龐艷彬，趙松穎，薛華，郭慧梅，化羅明，范麗霞，羅建民，杜欣

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)是一組異質(zhì)性腫瘤性疾病，以骨髓無效造血并伴有向急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)轉(zhuǎn)化的風(fēng)險為特點[1-2]。目前MDS的唯一治愈方式是異基因造血干細(xì)胞移植，其機制在于移植物抗白血病效應(yīng)的實現(xiàn)，表明患者的免疫功能在MDS的治療中具有重要作用[3]。去甲基化藥物(hypomethylating agents，HMAs)如地西他濱(decitabine，DAC)和阿扎胞苷是近年來MDS治療取得的最大進(jìn)展[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)HMAs的作用機制有免疫調(diào)控因素的參與，即HMAs誘導(dǎo)內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒基因通過模擬病毒感染的方式發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[4-5]。移植后的淋巴細(xì)胞水平與MDS患者免疫狀態(tài)密切相關(guān)，是反映患者總生存期的預(yù)后因素[6]。然而，DAC治療后淋巴細(xì)胞計數(shù)與治療反應(yīng)的關(guān)系尚不明確。本研究對第1療程DAC治療后28～35d的淋巴細(xì)胞(Lym)水平與MDS患者治療反應(yīng)之間的關(guān)系進(jìn)行回顧性分析。

1 資料與方法

1.1 病例來源 2014年1月－2016年12月在河北大學(xué)附屬醫(yī)院血液科接受治療的35例MDS患者，隨訪截止時間為2017年3月31日。依據(jù)患者病史、外周血細(xì)胞計數(shù)、骨髓形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞遺傳學(xué)等檢查結(jié)果，所有患者符合MDS的最低診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。納入標(biāo)準(zhǔn)：初治MDS患者且至少經(jīng)歷2個療程的DAC治療。35例患者年齡42～83(中位值66)歲，其中男26例(74.3%)，女9例(25.7%)。根據(jù)MDS 2008診斷標(biāo)準(zhǔn)，35例患者中，難治性貧血或難治性貧血伴多系病態(tài)造血或難治性貧血伴環(huán)狀鐵粒幼細(xì)胞8例(22.9%)，難治性貧血伴原始細(xì)胞增多-Ⅰ12例(34.3%)，難治性貧血伴原始細(xì)胞增多-Ⅱ6例(17.1%)，MDS轉(zhuǎn)化AML 9例(25.7%)。

35例患者按照國際預(yù)后積分系統(tǒng)(international prognostic scoring system，IPSS)評分分級，低危或中危-Ⅰ者(定義為低危)共9例(25.7%)，中危-Ⅱ或高危的患者(高危)共17例(48.6%)。

1.2 病例分組和指標(biāo)定義 參考文獻(xiàn)[8]，根據(jù)患者在接受第1療程DAC治療后的淋巴細(xì)胞計數(shù)絕對值，將淋巴細(xì)胞計數(shù)≥1.2×109個/L的患者分為高淋巴細(xì)胞(H-Lym)組(n=15)，將淋巴細(xì)胞計數(shù)＜1.2×109個/L者分為低淋巴細(xì)胞(L-Lym)組。搜集兩組患者的基線資料，包括年齡、性別、診斷時的血常規(guī)、骨髓中原始細(xì)胞百分比、染色體核型、治療相關(guān)死亡率。其中骨髓形態(tài)學(xué)中根據(jù)原始細(xì)胞比例分為原始細(xì)胞＜10%和原始細(xì)胞≥10%；染色體核型特點分為預(yù)后良好或中等核型與預(yù)后不良核型。根據(jù)IPSS積分分為低危和高?；蚶^發(fā)性急性髓系白血病(secondary acute myeloid leukemia，sAML)。

1.3 治療方案 所有患者均接受DAC治療，15～20mg/(m2.d)，連續(xù)1～5d(d1－5)，28d為1個療程。有效患者可重復(fù)應(yīng)用，直至無效。

1.4 療效評價 參照修訂的MDS國際工作組(International Working Group，IWG)提出的關(guān)于MDS治療后評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估[7]。

形態(tài)學(xué)完全緩解(CR)定義為骨髓形態(tài)學(xué)上原始細(xì)胞≤5%且中性粒細(xì)胞≥1×109個/L，血小板≥100×109個/L；部分緩解(PR)定義為原始細(xì)胞較治療前下降≥50%，仍大于5%；穩(wěn)定指未達(dá)到PR，但無疾病進(jìn)展的證據(jù)。

血液學(xué)改善(HI)：紅系反應(yīng)，血紅蛋白治療前＜110g/L者，治療后增加≥15g/L；中性粒細(xì)胞反應(yīng)，治療前＜1×109個/L者，治療后增加＞0.5×109個/L； 血小板反應(yīng)，治療前＜100×109/L，且＞20×109個/L 者，治療后凈增≥30×109個/L，或治療前血小板＜20×109個/L者，治療后血小板＞20×109個/L，且增幅≥100%。

疾病進(jìn)展(PD)定義：骨髓原始細(xì)胞計數(shù)增加≥50%，達(dá)到或超過治療前水平，血小板或中性粒細(xì)胞計數(shù)較最高值減少大于等于50%，血紅蛋白減少≥20g/L?？偡磻?yīng)率(ORR)：治療后患者達(dá)到CR、PR和血液學(xué)改善。無進(jìn)展生存期(PFS)：從進(jìn)入治療試驗到PD或因MDS死亡的時間。治療相關(guān)死亡：DAC治療過程中或治療結(jié)束30d內(nèi)因骨髓抑制導(dǎo)致的死亡。

1.5 H-Lym組與L-Lym組在第1個DAC療程后淋巴細(xì)胞計數(shù)的差異 分別記錄診斷時患者血常規(guī)中淋巴細(xì)胞計數(shù)和第1個療程DAC治療后28～35d淋巴細(xì)胞計數(shù)，分析兩組患者第1療程DAC治療后淋巴細(xì)胞的變化特點。

1.6 H-Lym組與L-Lym組患者對DAC治療反應(yīng)的差異 在至少2個療程DAC治療后，觀察患者達(dá)到最佳治療反應(yīng)時的血常規(guī)特點、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。根據(jù)IWG提出的MDS評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估，分析患者治療反應(yīng)與第1次DAC治療后28～35d外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)目、診斷時骨髓原始細(xì)胞比例、染色體核型、IPSS分層之間的關(guān)系。

1.7 H-Lym與L-Lym患者PFS的差異及可能危險因素分析 在患者經(jīng)歷至少2個療程DAC治療后，觀察和記錄達(dá)到最佳治療反應(yīng)時的血常規(guī)特點、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及病情進(jìn)展時間。根據(jù)IWG提出的MDS評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估。分析第1次DAC治療后28～35d患者外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)、骨髓原始細(xì)胞比例、染色體核型、IPSS分層對DAC治療后患者無進(jìn)展生存期的影響。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料呈正態(tài)分布的情況下以±s表示，若呈方差齊性，采用兩樣本t檢驗比較。采用Pearson χ2檢驗對計數(shù)資料進(jìn)行比較。采用Kaplan-Meier法繪制患者PFS曲線并應(yīng)用log-rank檢驗進(jìn)行兩組間比較。均采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者基線資料 35例患者共接受了158個療程的DAC治療，療程2～10個(中位值4個)。H-Lym組基線淋巴細(xì)胞計數(shù)為(1.37±0.70)×109個/L，L-Lym組基線淋巴細(xì)胞計數(shù)為(1.24±0.53)×109個/L，兩組基線淋巴細(xì)胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.533，表1)。兩組患者基線年齡、性別、疾病構(gòu)成、中性粒細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、染色體核型及治療相關(guān)死亡率等的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。H-Lym組中骨髓原始細(xì)胞≥10%的比例高于L-Lym組患者(P=0.014，表1)。

2.2 兩組患者在第1個DAC療程后淋巴細(xì)胞計數(shù)的差異 在第1個DAC療程后28～35d，H-Lym淋巴細(xì)胞計數(shù)為(1.57±0.72)×109個/L，與其基線值(1.37±0.70)×109個/L比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.072)。L-Lym組為(0.79±0.22)×109個/L，與其基線值(1.24±0.53×109/L)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)。

2.3 兩組患者對第1個療程DAC治療反應(yīng)的差異H-Lym組ORR為80.0%(12/15)，L-Lym組ORR為40.0%(8/20)，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)。由表2可見，在可能影響DAC患者療效的影響因素中，第1個DAC療程后淋巴細(xì)胞計數(shù)與患者對治療的反應(yīng)相關(guān)(P<0.05)。此外，IPSS高危組MDS或sAML患者對DAC反應(yīng)率明顯高于低危組MDS患者(69.6% vs.33.3%，P=0.04)，骨髓原始細(xì)胞比例高的患者或具有不良預(yù)后染色體核型的患者易于產(chǎn)生治療反應(yīng)，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表1 兩組患者基線資料及治療相關(guān)死亡率比較Tab.1 Baseline data and mortality after entire courses of DAC therapy of two groups

2.4 兩組患者累積生存率的差異及相關(guān)危險因素的單因素分析 由表3可見，截至2017年3月31日隨訪結(jié)束，H-Lym組患者中位PFS值為10個月(95%CI 7.6～12.4)，明顯優(yōu)于L-Lym組的7.6個月(95%CI 3.5～11.6)。生存曲線顯示兩組患者的累積生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.017，圖1)。骨髓原始細(xì)胞≥10%組患者PFS略高于骨髓原始細(xì)胞＜10%組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.411)。不同染色體核型(P=0.708)、IPSS分級(P=0.236)的患者PFS差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。單因素分析顯示，淋巴細(xì)胞計數(shù)絕對值低是患者疾病進(jìn)展的預(yù)后因素(P<0.05)。

3 討 論

盡管已明確遺傳學(xué)和分子學(xué)異常在MDS的疾病進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，但目前越來越多的基礎(chǔ)研究和大樣本流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)免疫機制也參與了該過程[9-10]。異基因造血干細(xì)胞移植治愈MDS的重要原因是移植物抗白血病效應(yīng)的實現(xiàn)，說明免疫功能在MDS治療中具有重要的作用[3]。目前作為指導(dǎo)MDS治療選擇的評估模型，無論是使用最廣泛的IPSS積分系統(tǒng)還是修訂后的IPSS積分系統(tǒng)，均不能反映患者免疫狀態(tài)在治療中作用[8]。去甲基化藥物(HMAs)如DAC是近年來MDS最重要的治療進(jìn)展，其作用機制有免疫因素的參與，而淋巴細(xì)胞恢復(fù)是反映MDS、AML患者免疫恢復(fù)的重要指標(biāo)[6,11]。因此本研究分析了首次DAC治療后28～35d淋巴細(xì)胞與患者治療反應(yīng)之間的關(guān)系。

表2 臨床指標(biāo)與MDS患者治療反應(yīng)的關(guān)系Tab.2 Relationship between clinical parameters and the therapeutic response of MDS patients

圖1 H-Lym和L-Lym組患者的生存曲線 Fig.1 Survival curves of patients in H-Lym and L-Lym group

表3 MDS患者PFS危險因素的單因素分析Tab.3 Univariate analysis for the risk factors influencing the progression-free survival of MDS patients

本研究發(fā)現(xiàn)，第1療程DAC治療后28～35d血常規(guī)中的淋巴細(xì)胞計數(shù)與患者的治療反應(yīng)密切相關(guān)，H-Lym組患者對DAC反應(yīng)率和PFS明顯優(yōu)于L-Lym組(P＜0.05)。H-Lym組治療后與L-Lym組治療前淋巴細(xì)胞水平無明顯差異(P＞0.05)，H-Lym組患者治療前后淋巴細(xì)胞計數(shù)無明顯變化，L-Lym組患者治療后淋巴細(xì)胞計數(shù)較治療前明顯下降 (P＜0.05)，提示DAC治療后淋巴細(xì)胞減少可能導(dǎo)致患者治療反應(yīng)低下。本研究結(jié)果與Saeed等[8]的889例MDS患者分析結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)高淋巴細(xì)胞計數(shù)患者中位PFS優(yōu)于低淋巴細(xì)胞計數(shù)患者(35個月vs 26個月，P＜0.05)，低淋巴細(xì)胞計數(shù)患者死亡風(fēng)險比為1.3倍(95%CI 1.2～1.6，P＜0.05)。在AML中也有類似結(jié)果，Behl等[12]對103例AML患者鞏固治療前患者的淋巴細(xì)胞計數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，高淋巴細(xì)胞計數(shù)患者具有較好的完全緩解期和總生存期。DAC治療后高淋巴細(xì)胞計數(shù)的患者具有較好的治療效果可能與DAC的作用機制有關(guān)。HMAs抗腫瘤效應(yīng)有免疫調(diào)節(jié)機制的參與：內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(endogenous retrovirus，EDV)基因由于啟動子高度甲基化而不表達(dá)，HMASs使EDV基因的啟動子去甲基化，進(jìn)而發(fā)生雙向轉(zhuǎn)錄，正義和反義RNA形成雙鏈RNA(dsRNA)，dsRNA與胞質(zhì)中的感應(yīng)蛋白Toll樣受體3(TLR-3)和黑色素瘤分化基因5(MDA5)結(jié)合，在線粒體上的線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)協(xié)助下使轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)3、IRF7和核因子κB(NF-κB)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素和促炎性細(xì)胞因子表 達(dá)[4-5]。Ⅰ型干擾素和促炎性細(xì)胞因子除激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的JAK/STAT信號通路發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)外，還可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放趨化因子，誘導(dǎo)T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞微環(huán)境后增殖、活化，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[4-5,13]。這說明足夠數(shù)量的免疫細(xì)胞可能是DAC治療成功的重要因素。

此外，H-Lym組中高危MDS或sAML患者的比例、具有不良預(yù)后核型患者的比例高于L-Lym組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。盡管高危組MDS或sAML、骨髓原始細(xì)胞比例高和具有不良預(yù)后核型的患者容易對DAC治療產(chǎn)生反應(yīng)，但患者的PFS并未提高(P＞0.05)，其原因可能是DAC使患者造血獲得改善，但并不能清除白血病細(xì)胞[13]。其潛在的機制可能是DAC誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放干擾素和促炎因子發(fā)生抗腫瘤效應(yīng)的同時，也誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上的程序性細(xì)胞死亡因子1(PD-1)、程序性細(xì)胞死亡因子配體1(PD-L1)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)等免疫抑制分子表達(dá)升高，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，導(dǎo)致疾病的進(jìn)展[14]。因此，HMAs藥物治療失敗后進(jìn)行聯(lián)合免疫檢查點阻滯劑的嘗試性治療正在探索中：最近一項含有MDS和急性白血病的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果表明，抗CTLA-4單克隆抗體可使部分MDS/AML患者產(chǎn)生治療反應(yīng)，其中1例MDS轉(zhuǎn)化的sAML緩解期超過15個月，盡管樣本數(shù)量很少，至少說明這種治療策略有潛在臨床研究價值[3]。

本研究尚且存在幾點不足：第一，雖然本研究直接采用1.2×109/L作為臨界值能反映患者的治療效果，但是采用ROC曲線或淋巴細(xì)胞計數(shù)的中位值計算出的淋巴細(xì)胞計數(shù)可能能更準(zhǔn)確地反映DAC的治療效果，但是由于本研究的樣本例數(shù)較少，未能計算最佳臨界值，因此，有必要進(jìn)一步擴大樣本量以計算反映DAC治療反應(yīng)的最佳臨界值，并進(jìn)行多因素分析。第二，H-Lym組ORR為80%，而L-Lym組中也有40%患者獲得治療反應(yīng)，說明還有其他因素對患者的治療反應(yīng)產(chǎn)生影響，需要進(jìn)一步研究確定。第三，本研究應(yīng)用第1療程DAC治療后的淋巴細(xì)胞計數(shù)對患者治療反應(yīng)和FPS進(jìn)行初步分析，并不能反映不同亞型淋巴細(xì)胞在DAC治療反應(yīng)中的作用。因此，有必要進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析不同亞型淋巴細(xì)胞預(yù)測患者對DAC治療反應(yīng)的價值。

總之，本研究表明第1療程DAC治療后淋巴細(xì)胞水平與MDS患者的治療反應(yīng)和PFS密切相關(guān)。對于第1療程DAC治療后淋巴細(xì)胞計數(shù)較低的患者可及早調(diào)整治療方案以延緩疾病進(jìn)展。

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