釀酒酵母W5單倍體的制備及其代謝水平分析

王長(zhǎng)麗，佟天奇，劉文娟，張?jiān)埔?，?剛，葛菁萍,*

近年來(lái)，利用國(guó)際公認(rèn)安全微生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生產(chǎn)一些在食品、醫(yī)藥和能源等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用的平臺(tái)化合物受到研究者的極大關(guān)注[1-2]。作為模式生物，S. cerevisiae被認(rèn)為是最具潛力的大規(guī)模生產(chǎn)菌種。但是，野生型S. cerevisiae的主產(chǎn)物為乙醇，而且其自身某些產(chǎn)物的代謝途徑被抑制或者不完整，故S. cerevisiae只能合成痕量的或者基本不產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物，大多以其前體物質(zhì)形式存在，如2,3-丁二醇[3-4]等。因此，若想有效地提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量，必須提升原始菌株的生產(chǎn)性能。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對(duì)S. cerevisiae進(jìn)行代謝工程改造，從而定向提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。改造思路主要集中在2 個(gè)方面[5-7]：一是敲除主產(chǎn)物代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因；二是將目標(biāo)產(chǎn)物途徑關(guān)鍵酶基因?qū)胍吧蚐. cerevisiae中，誘導(dǎo)其過(guò)量表達(dá)。然而酵母細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)形態(tài)為二倍體[8]，無(wú)形中給菌株改造帶來(lái)了許多困擾。例如，在連續(xù)敲除二倍體S.cerevisiae細(xì)胞相關(guān)酶基因時(shí)，既增加了選擇抗性標(biāo)記的困擾，又造成了菌株生長(zhǎng)的壓力。而且目標(biāo)基因?qū)攵扼w酵母細(xì)胞后，在連續(xù)傳代過(guò)程中呈現(xiàn)出不穩(wěn)定性。

研究表明，誘導(dǎo)S. cerevisiae產(chǎn)生子囊孢子進(jìn)而分離單倍體是進(jìn)行酵母代謝工程改造的重要手段之一，對(duì)于獲得穩(wěn)定性和代謝性能均良好的工程菌株具有重要意義。酵母基因組倍性復(fù)雜，這是基因修飾后的菌株穩(wěn)定性差的主要原因。單倍體酵母只有一套染色體，遺傳背景相對(duì)簡(jiǎn)單，所以更適合作為代謝工程改造的出發(fā)菌株[9-11]。S.cerevisiae存在單倍體和二倍體2 種形態(tài)[12]，由于MAT基因座的信息差異，單倍體細(xì)胞被分為a和α兩種接合型，每種接合型的單倍體酵母細(xì)胞均可以產(chǎn)生外激素以吸引異性，因此二者可以交配形成二倍體細(xì)胞。但是在二倍體細(xì)胞中，這種交配應(yīng)答是被抑制的[13]。此外，單倍體酵母細(xì)胞每經(jīng)歷一個(gè)生命周期就會(huì)發(fā)生接合型轉(zhuǎn)換，這是由一種核酸內(nèi)切酶的基因HO所誘導(dǎo)，其功能是在MAT交配型位點(diǎn)處產(chǎn)生特異性雙鏈斷裂，完成沉默的供體位點(diǎn)和活化位點(diǎn)之間的信息轉(zhuǎn)換，從而實(shí)現(xiàn)酵母細(xì)胞的同宗配合或異宗配合[14]。同宗配合菌株可以自我繁殖，由于HO作用將自身的母細(xì)胞轉(zhuǎn)變成與子細(xì)胞相反的配型進(jìn)行交配[15]。另有研究表明二倍體產(chǎn)孢過(guò)程與減數(shù)分裂相關(guān)聯(lián)，在減數(shù)分裂I期，同源染色體聯(lián)會(huì)非姐妹染色單體交叉互換，促進(jìn)染色體上的基因發(fā)生重排[16-17]，使得篩選性狀較好的單倍體細(xì)胞成為可能。

本研究以S. cerevisiae為出發(fā)菌株，旨在獲得1株生長(zhǎng)性能好、碳源流向乙醇途徑相對(duì)減弱的單倍體S. cerevisiae菌株，使其能更多地積累目的產(chǎn)物2,3-丁二醇的前體物質(zhì)乙偶姻。選取不同的產(chǎn)孢培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢實(shí)驗(yàn)，確定最適的產(chǎn)孢培養(yǎng)基；利用隨機(jī)孢子分析法[18]和MAT-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法[19]分離并鑒定單倍體菌株；通過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)，觀察單倍體細(xì)胞及菌落形態(tài)，鑒定是否含有HO，并從代謝水平上研究單倍體菌株的代謝物變化情況，最終選取主產(chǎn)物途徑被削減，目標(biāo)產(chǎn)物或其前體物質(zhì)含量增加的單倍體，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行做好準(zhǔn)備工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與菌株

Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液 上海生物工程有限公司；蝸牛酶 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；β-巰基乙醇、NaCl、脫色液（3%酸性乙醇溶液）、番紅花紅T天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；TritonX-100 上海索萊寶生物科技有限公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 上海翊圣生物科技有限公司；石碳酸復(fù)紅、呂氏美蘭 南京森貝伽生物科技有限公司；孔雀石綠 天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心；生物素 武漢艾美捷科技有限公司；肌醇 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；琥珀酸 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；Taq DNA polymerase、dNTP Mixture 天根生化科技有限公司。

本實(shí)驗(yàn)所用菌株見(jiàn)表1，其中S. cerevisiae W5用作單倍體分離，標(biāo)準(zhǔn)單倍體S. cerevisiae W303-1A[20]用于鑒定單倍體。酵母細(xì)胞培養(yǎng)條件為30 ℃、140 r/min。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株基因型與來(lái)源Table 1 Yeast strains used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蒸餾水定容至1 L，108 ℃滅菌20 min，瓊脂粉20 g/L，用于S. cerevisiae W5的培養(yǎng)。改良YPD培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L，蛋白胨3 g/L，酵母提取物8 g/L，25 mg/L ZnSO4·7H2O，108 ℃高壓濕熱滅菌20 min，瓊脂粉20 g/L，用于產(chǎn)孢前S. cerevisiae W5培養(yǎng)。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基[9,21]：McClary培養(yǎng)基：酵母粉2.5 g/L、KCl 1.8 g/L、乙酸鈉8.2 g/L、瓊脂粉20 g/L；Kleyn培養(yǎng)基：蛋白胨2.5 g/L、NaCl 0.62 g/L、乙酸鈉5 g/L、瓊脂粉20 g/L；SPM培養(yǎng)基：酵母粉2.5 g/L、乙酸鉀10 g/L、KH2PO41 g/L、瓊脂粉20 g/L；改良SPM培養(yǎng)基：在SPM培養(yǎng)基上補(bǔ)加23.6 g/L琥珀酸，0.125 g/L ZnSO4·7H2O，2 μg/L生物素，100 μg/L肌醇，pH 6.0；醋酸鹽培養(yǎng)基：酵母粉2.5 g/L、乙酸鈉8.2 g/L、pH 4.8，瓊脂粉20 g/L；改良醋酸鹽培養(yǎng)基：在醋酸鹽培養(yǎng)基基礎(chǔ)上補(bǔ)加23.6 g/L琥珀酸，0.125 g/L ZnSO4·7H2O，2 μg/L生物素，100 μg/L肌醇，pH 4.8。用于S. cerevisiae W5產(chǎn)孢培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L、蛋白胨20 g/L、無(wú)氨基酸酵母氮源3.4 g/L、KH2PO411.8 g/L、K2HPO43 g/L、(NH4)2SO410 g/L、pH 5.0，108 ℃滅菌20 min，用于酵母菌葡萄糖搖瓶發(fā)酵。

1.1.3 引物

MAT-PCR法用于鑒定單倍體，HO用于單倍體穩(wěn)定性的研究，涉及的引物見(jiàn)表2，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表2 驗(yàn)證單雙倍體的引物Table 2 List of primers used to verify haploid and diploid

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司；BX43正置熒光顯微鏡 美國(guó)Olympus有限公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；22R臺(tái)式離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；XB-K-25血球計(jì)數(shù)板上海市求精生化試劑儀器有限公司；DK-S24恒溫水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基的篩選

將活化好的S. cerevisiae W5接種于改良YPD培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，直至單菌落出現(xiàn)。挑取單菌落轉(zhuǎn)接于產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～10 d，每天定量取樣鏡檢，觀察孢子的形成情況，采用血球計(jì)數(shù)法計(jì)算產(chǎn)孢率和孢子釋放率，分別按公式（1）和（2）進(jìn)行計(jì)算：

通過(guò)產(chǎn)孢率確定最佳的培養(yǎng)時(shí)間，并通過(guò)孔雀石綠-番紅對(duì)子囊孢子進(jìn)行染色，驗(yàn)證孢子的產(chǎn)生情況。

1.3.2 誘導(dǎo)S. cerevisiae W5單倍體分離、富集和驗(yàn)證

參照文獻(xiàn)[22-23]分離方法，利用Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液稀釋孢子菌懸液（1×108CFU/mL），吸取2 mL，6 000 r/min離心5 min，重復(fù)2 次。向收集菌體中加入蝸牛酶液（均含1%巰基乙醇，起始的蝸牛酶質(zhì)量濃度為100 mg/mL），終質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 mg/mL，分別于37 ℃恒溫水浴0.5、1、2、4、8、10 h，每20 min振蕩一次，取樣鏡檢，觀察不同蝸牛酶質(zhì)量濃度對(duì)子囊孢子破壁的影響，并計(jì)算孢子釋放率。子囊孢子破壁結(jié)束后，9 700×g離心1 min，收集菌體，加入400 μL 0.5% TritonX-100和4 μL 10 mmol/L DTT重懸菌液，58 ℃熱激10 min，4 ℃離心收集孢子，溶于2 mL STD溶液（0.1 g NaCl溶于10 mL 0.05% TritonX-100），梯度稀釋10－5、10－6、10－7倍后涂布于YPD平板上。培養(yǎng)3 d，挑取較小的菌落進(jìn)行MAT-PCR，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。其中PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)體系：含Mg2＋10×Taq Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，MAT-F、MAT-a、MAT-α各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 4.5 μL，2.5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL。

1.3.3 單倍體菌株傳代培養(yǎng)與鑒定

將分離得到的單倍體以5%接種量接種至YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10 代，利用PCR法擴(kuò)增HO基因。具體反應(yīng)程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)體系：含Mg2＋10×Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，HO-up和HO-down各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 17 μL，2.5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL。

1.3.4 單倍體菌株的搖瓶發(fā)酵性能測(cè)定

將菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以5%接種量分別轉(zhuǎn)接至150/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)72 h，每6 h取3 mL，測(cè)定其OD600nm和pH值。同時(shí)取樣1 mL，稀釋100 倍，12 000 r/min離心10 min，利用HPLC檢測(cè)葡萄糖、乙醇、甘油、乙酸和乙偶姻含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P小于0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基的選擇

2.1.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)S. cerevisiae W5產(chǎn)孢率的影響

如圖1所示，S. cerevisiae W5在6 種產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，產(chǎn)孢率由大到小分別是改良SPM培養(yǎng)基＞改良醋酸鹽培養(yǎng)基＞醋酸鹽培養(yǎng)基＞SPM培養(yǎng)基＞McClary培養(yǎng)基＞Kleyn培養(yǎng)基，因此改良SPM培養(yǎng)基比較適合S. cerevisiae W5。S. cerevisiae W5在改良SPM培養(yǎng)基上產(chǎn)孢率最高為（35.57±0.82）%。除Kleyn培養(yǎng)基外其他培養(yǎng)基均能使原始菌株W5產(chǎn)孢，產(chǎn)孢率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后趨于平穩(wěn)，5～8 d時(shí)產(chǎn)孢率明顯增高，培養(yǎng)至10 d時(shí)子囊孢子生長(zhǎng)基本停止。因此，選擇培養(yǎng)至8 d時(shí)的子囊孢子較好，此時(shí)孢子產(chǎn)量和活性較高。

圖1 不同產(chǎn)孢培養(yǎng)基（A）和培養(yǎng)時(shí)間（B）對(duì)酵母W5產(chǎn)孢率的影響Fig. 1 Effects of different culture media (A) and culture time (B) on sporulation rate of S. cerevisiae W5

2.1.2 S. cerevisiae W5產(chǎn)孢驗(yàn)證結(jié)果

圖2 孔雀石綠-番紅染色的顯微觀察（×1 600）Fig. 2 Microscopic examination of S. cerevisiae W5 with malachite green-safranine staining (× 1 600)

如圖2所示，S. cerevisiae W5的孢子多數(shù)為3 孢和2 孢，只有在SPM培養(yǎng)基或改良SPM培養(yǎng)基中有少數(shù)的4 孢產(chǎn)生，這說(shuō)明細(xì)胞完成了減數(shù)分裂II期，即“四聯(lián)體”階段。染色結(jié)果可以清楚地觀察到改良SPM培養(yǎng)基有少量4 個(gè)子囊孢子的形成，這進(jìn)一步說(shuō)明生物素和肌醇的添加促進(jìn)了細(xì)胞完成減數(shù)分裂II期。所以，改良SPM培養(yǎng)基是S. cerevisiae W5的最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基，并成功驗(yàn)證了培養(yǎng)8 d時(shí)，S. cerevisiae W5的產(chǎn)孢情況。

2.2 單倍體的制備結(jié)果

2.2.1 蝸牛酶質(zhì)量濃度對(duì)S. cerevisiae W5孢子釋放率的影響

表3 不同蝸牛酶質(zhì)量濃度處理不同時(shí)間對(duì)孢子釋放率的影響Table 3 Effect of snailase concentration on spore release rate

由表3可知，蝸牛酶質(zhì)量濃度的差異對(duì)S. cerevisiae W5子囊孢子的釋放率有較大影響，S. cerevisiae W5的孢子釋放率隨蝸牛酶質(zhì)量濃度的增加而先增高后降低；相同質(zhì)量濃度下，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，孢子釋放率也呈現(xiàn)出先增后降的特點(diǎn)，處理10 h時(shí)尤為明顯?？赡茉蛟谟诿附鈺r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使子囊孢子的孢子壁再次裂解。所以最終選擇終質(zhì)量濃度為30 mg/mL時(shí)的蝸牛酶處理2 h為最佳破壁條件。

2.2.2 單倍體菌株的分離與鑒定

子囊孢子分離和富集后在YPD培養(yǎng)基上形成若干單菌落，隨機(jī)挑取較小的單菌落，由MAT-PCR法鑒定，由圖3可知，404 bp處條帶為MAT-α型，544 bp處條帶為MAT-a型，而兩處均有條帶的則為二倍體菌株。將鑒定配型后的菌株活化，并按照?qǐng)D3數(shù)字順序命名菌株為H1～H16。理想狀態(tài)下單倍體菌株性能穩(wěn)定，生長(zhǎng)良好，產(chǎn)乙醇能力能夠適當(dāng)減弱，使更多的碳源流向乙偶姻，與原始菌株W5相比，積累量有一定的提高。

圖3 單倍體與二倍體的PCR擴(kuò)增驗(yàn)證結(jié)果Fig. 3 Identification of haploid and diploid strains by PCR amplification

2.3 單倍體菌株篩選

將鑒定為單倍體的菌株經(jīng)連續(xù)傳代后發(fā)現(xiàn)有7 株較為穩(wěn)定，分別為S. cerevisiae H1/H2/H5/H6/H14/H8/H9。其中，S. cerevisiae H1/H2/H5/H6/H8為MAT-α型，S. cerevisiae H14/H9則為MAT-a型。PCR擴(kuò)增HO，如圖4所示，除S. cerevisiae H14（MAT-a）外，均在1 772 bp處出現(xiàn)清晰的條帶，與理論值一致。

圖4 單倍體HO的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 4 PCR amplification of HO of seven haploid strains

為了驗(yàn)證S. cerevisiae H14（MAT-a）是否存在HO，再次以原始菌株W5基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，H2O為陰性對(duì)照，PCR擴(kuò)增HO。如圖5和圖6所示，陽(yáng)性對(duì)照組在1 772 bp處有清晰條帶，而S. cerevisiae H14和陰性對(duì)照組均沒(méi)有條帶，表明S. cerevisiae H14確實(shí)為HO缺失株。原因可能是二倍體（MAT-a/α）存在隱性致死基因，在減數(shù)分裂過(guò)程中導(dǎo)致基因缺失。

圖5 單倍體HO PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 5 PCR amplification of HO of haploid H14

圖6 單倍體及二倍體的PCR擴(kuò)增驗(yàn)證結(jié)果Fig. 6 PCR amplification of haploid H14 and diploid W5

2.4 顯微形態(tài)觀察

圖7 顯微形態(tài)觀察Fig. 7 Microscopic observations of S. cerevisiae H14 and S. cerevisiae W5

如圖7所示，S. cerevisiae H14（MAT-a）細(xì)胞呈圓球形、?。?～6 μm）、易聚集在一起；菌落為乳白色、呈隆起狀、濕潤(rùn)、邊緣光滑。而S. cerevisiae W5細(xì)胞較大（5～10 μm）分散、呈橢圓形，菌落直徑為0.5～0.6 cm。

2.5 單倍體發(fā)酵性能檢測(cè)結(jié)果

圖8 S. cerevisiae H14和S. cerevisiae W5發(fā)酵性能Fig. 8 Fermentation curves of S. cerevisiae H14 and S. cerevisiae W5

由圖8可知，隨著葡萄糖的消耗，菌體大量繁殖，單倍體菌株S. cerevisiae H14（MAT-a）生長(zhǎng)速率略低于S. cerevisiae W5（MAT-a/α），但二者差異不顯著（P＞0.05）。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，S. cerevisiae W5的乙醇質(zhì)量濃度始終高于單倍體菌株S. cerevisiae H14（MAT-a）。S. cerevisiae H14在發(fā)酵30 h乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到最大為（40.46±1.06）g/L，較S. cerevisiae W5發(fā)酵24 h乙醇最大質(zhì)量濃度（（51.65±2.39）g/L）下降了21.67%（P＜0.05）。

但S. cerevisiae H14（MAT-a）乙酸和乙偶姻質(zhì)量濃度高于S. cerevisiae W5，在發(fā)酵24 h時(shí)，分別較S. cerevisiae W5提高了12.70%和57.14%（P＜0.05）。pH值則呈現(xiàn)先降低后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，且S. cerevisiae H14（MAT-a）略高于S. cerevisiae W5。而甘油在發(fā)酵過(guò)程中呈先升后降趨勢(shì)，在發(fā)酵30 h，S. cerevisiae H14（MAT-a）甘油質(zhì)量濃度要高于S. cerevisiae W5，并較其提高了60.14%（P＜0.05），這意味著乙醇質(zhì)量濃度的變化影響了代謝途徑中其他副產(chǎn)物的變化，原因可能是S. cerevisiae倍型的改變對(duì)其代謝途徑產(chǎn)生了影響，減少了主產(chǎn)物乙醇的合成，又提高了其他產(chǎn)物的含量，如乙酸、乙偶姻、甘油等。

3 討 論

進(jìn)行酵母代謝工程改造和遺傳學(xué)研究尤為關(guān)鍵的一步是誘導(dǎo)酵母產(chǎn)孢[23-24]從而分離單倍體，這既是遺傳分析的必需因素，又可為親本的雜交[23,25]提供條件。原因在于它僅有一套染色體，減少了基因敲除過(guò)程中回復(fù)突變的概率[11]。S. cerevisiae子囊孢子的形成過(guò)程中有兩個(gè)重要因素[8]：一是營(yíng)養(yǎng)條件匱乏；二是出發(fā)菌株為二倍體。營(yíng)養(yǎng)匱乏與產(chǎn)孢培養(yǎng)基成分顯著相關(guān)，在碳源豐富的改良YPD培養(yǎng)基中，葡萄糖可以提供孢子形成的碳源骨架和細(xì)胞減數(shù)分裂的能量，并促進(jìn)前體物質(zhì)的合成。而以醋酸鹽為碳源的產(chǎn)孢培養(yǎng)基能夠促使酵母產(chǎn)孢，并通過(guò)添加少量的維生素，可以在一定程度上提高產(chǎn)孢率。此外，肌醇和生物素同樣利于3 孢子或4 孢子的形成，可見(jiàn)孢子萌發(fā)過(guò)程十分復(fù)雜，并且受很多因素影響[26]。當(dāng)環(huán)境中碳、氮源匱乏時(shí)[9]，適當(dāng)添加非發(fā)酵碳源（如醋酸等），能夠誘導(dǎo)孢子的生成[15]。因此本實(shí)驗(yàn)所選擇的6 種產(chǎn)孢培養(yǎng)基均缺乏碳源且無(wú)機(jī)鹽豐富。其中最適合S.cerevisiae W5產(chǎn)孢的改良SPM培養(yǎng)基，是在SPM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加了琥珀酸、Zn2＋、生物素和肌醇等物質(zhì)。琥珀酸可以維持內(nèi)部pH值的動(dòng)態(tài)平衡，Zn2＋則可以提高酵母細(xì)胞減數(shù)分裂II期過(guò)程中關(guān)鍵酶的活性，并增加胞內(nèi)3 孢子或4 孢子的生成數(shù)量，生物素和肌醇能夠促進(jìn)酵母細(xì)胞順利完成減數(shù)分裂II期。

在獲得最適產(chǎn)孢培養(yǎng)基后，對(duì)S. cerevisiae W5進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)及孢子的分離。孢子的生長(zhǎng)過(guò)程分為準(zhǔn)備階段、基因重組、孢子生成轉(zhuǎn)換3 個(gè)階段[16,27-28]，孢子的分離通常采用四分子分析和隨機(jī)孢子分析，由于S. cerevisiae四分子的子囊形成較少，所以本實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)孢子分析法對(duì)S. cerevisiae W5進(jìn)行單倍體的分離。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中鑒于單倍體和二倍體耐熱性的差異，采用高溫滅活營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的方法[22,24]分離單倍體，經(jīng)過(guò)MAT-PCR法鑒定及連續(xù)傳代培養(yǎng)后共獲得7 株單倍體，PCR擴(kuò)增后獲得1株HO缺失的穩(wěn)定傳代單倍體菌株S. cerevisiae H14（MAT-a）。該菌株經(jīng)PCR鑒定屬于異宗配合的單倍體，能以單倍體形式穩(wěn)定繁殖，只有在特定環(huán)境[29-30]中（即存在與其自身相反配型）才能雜交形成二倍體細(xì)胞[15]。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，由于S. cerevisiae H14（MAT-a）為單倍體菌株，其生長(zhǎng)率略低于S. cerevisiae W5，但二者差異并不顯著（P＞0.05），而S. cerevisiae W5積累量顯著高于S.cerevisiae H14（MAT-a）（P＜0.05），S. cerevisiae H14（MAT-a）的乙酸、乙偶姻的產(chǎn)量較S. cerevisiae W5分別提高了12.7%和57.14%，可能是由于乙酸上升導(dǎo)致酸度增加，一定程度上影響菌株生長(zhǎng)，與乙醇的積累呈非偶合關(guān)系。綜上可知，當(dāng)菌株S. cerevisiae H14（MAT-a）的乙醇產(chǎn)量降低時(shí)，菌體生長(zhǎng)卻變化不大，足以說(shuō)明菌體碳源分流向其他代謝途徑，大量積累副產(chǎn)物乙酸、乙偶姻。乙偶姻產(chǎn)量上升更加證實(shí)了這一觀點(diǎn)，同時(shí)乙偶姻因反饋調(diào)節(jié)，中和乙酸帶來(lái)的酸性作用，致使S.cerevisiae H14（MAT-a）的pH值較S. cerevisiae W5相對(duì)提高。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)以S. cerevisiae W5為出發(fā)菌株制備篩選的S. cerevisiae H14（MAT-a）較為理想，為S. cerevisiae單倍體的制備提供了研究經(jīng)驗(yàn)，也豐富了酵母遺傳學(xué)研究的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] LIU J M, CHAN S H J, THEIS B N, et al. Combining metabolic engineering and biocompatible chemistry for high yield production of homo-diacetyl and homo-(S,S)-2,3-butanediol[J]. Metabolic Engineering, 2016, 36: 57-67. DOI:10.1016/j.ymben.2016.02.008.

[2] HANSON S J, BYRNE K P, WOLFE K H. Mating-type switching by chromosomal inversion in methylotrophic yeasts suggests an origin for the three-locus Saccharomyces cerevisiae system[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2014, 111(45): 4851-4858. DOI:10.1073/pnas.1416014111.

[3] 童穎佳, 鄔文嘉, 彭輝, 等. 微生物合成 2,3-丁二醇的代謝工程[J]. 化工學(xué)報(bào), 2016, 67(7): 2656-2671. DOI:10.11949/j.issn.0438-1157.20160209.

[4] PRIYA A, DUREJA P, TALUKDAR P, et al. Microbial production of 2,3-butanediol through a two-stage pH and agitation strategy in 150 L bioreactor[J]. Biochemical Engineering Journal, 2016, 105: 159-167.DOI:10.1016/j.bej.2015.09.016.

[5] KIM S, HAHN J S. Efficient production of 2,3-butanediol in Saccharomyces cerevisiae by eliminating ethanol and glycerol production and redox rebalancing[J]. Metabolic Engineering, 2015, 31:94-101. DOI:10.1016/j.ymben.2015.07.006.

[6] MILNE N, WAHL S A, MARIS A J A V, et al. Excessive by-product formation: a key contributor to low isobutanol yields of engineered Saccharomyces cerevisiae strains[J]. Metabolic Engineering Communications, 2016, 3: 39-51. DOI:10.1016/j.meteno.2016.01.002.

[7] JI X J, LIU L G, SHEN M Q, et al. Constructing a synthetic metabolic pathway in Escherichia coli to produce the enantiomerically pure(R,R)-2,3-butanediol[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2015,112(5): 1056-1059. DOI:10.1002/bit.25512.

[8] BESSHO K, IWASA Y, DAY T. The evolutionry advantage of haploid versus diploid microbes in nutrient-poor environments[J].Journal of Theoretical Biology, 2015, 383: 116-129. DOI:10.1016/j.jtbi.2015.07.029.

[9] XU W, WANG J, LI Q. Induction separation and identification of haploid strains from industrial brewer’s yeast[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2015, 55(1): 22-32. DOI:10.13343/j.cnki.Wsxb.20140159.

[10] JOUHTEN P, PONOMAROVA O, GONZALEZ R, et al.Saccharomyces cerevisiae metabolism in ecological context[J]. Fems Yeast Research, 2016, 16(7): 80. DOI:10.1093/femsyr/fow080.

[11] SKONECZNA A, KANIAK A, SKONECZNY M. Genetic instability in budding and fission yeast-sources and mechanisms[J]. Fems Microbiology Reviews, 2015, 39(6): 917-967. DOI:10.1093/femsre/fuv028.

[12] PERIS D, LOPES C A, ARIAS A, et al. Reconstruction of the evolutionary history of Saccharomyces cerevisiae × S. kudriavzevii hybrids based on multilocus sequence analysis[J]. PLoS ONE, 2012,7(9): e45527. DOI:10.1371/journal.pone.0045527.

[13] KOSTRIKEN R, STRATHERN J N, KLAR A J, et al. A site-specific endonuclease essential for mating-type switching in Saccharomyces cerevisiae[J]. Cell, 1983, 35(1): 167-174. DOI:10.1016/0092-8674(83)90219-2.

[14] COI A L, LEGRAS J L, ZARA G, et al. A set of haploid strains available for genetic studies of Saccharomyces cerevisiae flor yeasts[J].Fems Yeast Research, 2016, 16(6): 66. DOI:10.1093/femsyr/fow066.

[15] STRATHERN J N, AMAR J S K, HICKS J B, et al. Homothallic switching of yeast mating type cassettes is initiated by a doublestranded cut in the MAT locus[J]. Cell, 1982, 31(1): 183-192.DOI:10.1016/0092-8674(82)90418-4.

[16] HANSON S J, WOLFE K H. An evolutionary perspective on yeast mating-type switching[J]. Genetics, 2017, 206(1): 29-32. DOI:10.1534/genetics.117.202036.

[17] KASSIR Y, STUART D T. Genetic approaches to study meiosis and meiosis-specific gene expression in Saccharomyces cerevisiae[J].Methods in Molecular Biology, 2017, 1471: 1-23. DOI:10.1007/978-1-4939-6340-9_1.

[18] TOMITAKA M, TAGUCHI H, MATSUOKA M, et al. Potent L-lactic acid assimilation of the fermentative and heterothallic haploid yeast Saccharomyces cerevisiae NAM34-4C[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2014, 117(1): 65-70. DOI:10.1016/j.jbiosc.2013.06.001.

[19] HUXLEY C, GREEN E D, DUNHAM I. Rapid assessment of S.cerevisiae mating type by PCR[J]. Trends in Genetics, 1990, 6(8): 236.DOI:10.1016/0168-9525(90)90190-H.

[20] AVRAHAMI-MOYAL L, ENGELBERG D, WENGER J W, et al.Turbidostat culture of Saccharomyces cerevisiae W303-1A under selective pressure elicited by ethanol selects for mutations in SSD1 and UTH1[J]. Fems Yeast Research, 2012, 12(5): 521-533. DOI:10.1111/j.1567-1364.2012.00803.x.

[21] 封冰, 張翠英, 肖冬光. 耐高糖面包酵母單倍體的分離篩選[J]. 釀酒科技, 2014(11): 10-13. DOI:10.13746/j.njkj.2014.0247.

[22] MILANI E A, GARDNER R C, SILVA F V. Thermal resistance of Saccharomyces yeast ascospores in beers[J]. International Journal of Food Microbiology, 2015, 206: 75-80. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2015.04.002.

[23] FUKUDA N, KAISHIMA M, ISHII J, et al. Continuous crossbreeding of sake yeasts using growth selection systems for a-type and α-type cells[J]. AMB Express, 2016, 6(1): 1-12. DOI:10.1186/s13568-016-0216-x.

[24] 湯二將, 鄧朝霞, 張曉敏, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化釀酒酵母產(chǎn)孢培養(yǎng)基及單倍體的鑒定[J]. 釀酒科技, 2012(6): 36-40. DOI:10.13746/j.njkj.2012.06.089.

[25] BARBOSA R, ALMEIDA P, SAFAR S V B, et al. Evidence of natural hybridization in Brazilian wild lineages of Saccharomyces cerevisiae[J]. Genome Biology and Evolution, 2016, 8(2): 317-329.DOI:10.1093/gbe/evv263.

[26] JOSEPHSTRAUSS D, ZENVIRTH D, SIMCHEN G, et al. Spore germination in Saccharomyces cerevisiae: global gene expression patterns and cell cycle landmarks[J]. Genome Biology, 2007, 8(11):R241. DOI:10.1186/gb-2007-8-11-r241.

[27] PAULISSEN S M, HUANG L S. Efficient sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 multiwell format[J]. Journal of Visualized Experiments Jove, 2016(115): 54584. DOI:10.3791/54584.[28] FRIEDLANDER G, JOSEPH-STRAUSS D, CARMI M, et al.Modulation of the transcription regulatory program in yeast cells committed to sporulation[J]. Genome Biology, 2006, 7(3): R20.DOI:10.1186/gb-2006-7-3-r20.

[29] NAHON E, RAVEH D. Targeting a truncated Ho-endonuclease of yeast to novel DNA sites with foreign zinc fingers[J]. Nucleic Acids Research, 1998, 26(5): 1233-1239. DOI:10.1093/nar/26.5.1233.

[30] MCDONALD M J, RICE D P, DESAI M M. Sex speeds adaptation by altering the dynamics of molecular evolution[J]. Nature, 2016,531(7593): 233-236. DOI:10.1038/nature17143.