姚凌云，王晶宇，歐陽偉，錢 晶，吳世妍，夏興霞，諸玉梅，王曉麗，潘群興，芮榮，王永山

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014）

近年來，養(yǎng)犬業(yè)發(fā)展快速，犬的傳染病和非傳染病的發(fā)病率也在逐年升高，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展[1]。目前，犬病的研究比較滯后，生物防治性制劑缺乏，遠(yuǎn)不能滿足對犬病防治的實(shí)際需求。而犬類感染病毒后，通常采用注射干擾素并輔助特異性單克隆抗體的治療手段，以控制病情惡化進(jìn)而轉(zhuǎn)歸康復(fù)。因此，犬干擾素具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

干擾素是機(jī)體細(xì)胞受到病毒感染或其他生物誘導(dǎo)劑的刺激而產(chǎn)生的一類具有抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等功能的活性蛋白質(zhì)[2,3]。根據(jù)干擾素氨基酸序列和其特異性識別受體的不同，主要分為3種：IFN-α、IFN-β和IFN-γ[4]。IFN-α和IFN-β屬I型干擾素，能在幾分鐘之內(nèi)激活細(xì)胞并建立抗病毒狀態(tài)，其中IFN-α主要來源于白細(xì)胞，因其具有廣譜抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)功能已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。犬干擾素α（Canine Interferon-α，CaIFN-α）基因全長為564個(gè)核苷酸，編碼187個(gè)氨基酸（包含23個(gè)氨基酸的信號肽），CaIFN-α存在8個(gè)亞型[5]，其同源性達(dá)93%～100%。

天然干擾素制備工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低、成本高，而利用基因工程技術(shù)表達(dá)外源蛋白的方法具有操作簡單、成本低廉和可控性好等優(yōu)勢，已成為當(dāng)前重組蛋白制備的主要手段。根據(jù)外源基因表達(dá)宿主的不同，表達(dá)系統(tǒng)可大致分為：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[6]。其中，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是第一個(gè)用于重組蛋白生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、目的蛋白表達(dá)水平高、具備可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢，已被廣泛地用于外源蛋白的制備[7]。

CaIFN-α的各亞型之間的抗病毒活性存在差異。目前，有關(guān)CaIFN-α2的研究較少，因此，本試驗(yàn)通過人工合成CaIFN-α2成熟活性區(qū)序列（去除信號肽），利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組CaIFN-α2，并探討了CaIFN-α2的抗病毒活性，為研制新型高效的犬用干擾素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體、病毒及細(xì)胞E. coliDH5α、E. coliRosetta、原核表達(dá)載體pET-28a(+)、水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）和犬腎細(xì)胞（madindarby canine kidney，MDCK）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III、T4 DNA連接酶和rTaqmix均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA Marker和蛋白Marker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；小牛血清購自浙江航天生物有限公司；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；HisTrap HP蛋白純化系統(tǒng)購自GE公司；硝酸纖維素（NC）膜購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；鼠抗His單克隆抗體購自碧云天生物技術(shù)公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG由本實(shí)驗(yàn)室自制；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 CaIFN-α2基因的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已公布的CaIFN-α2序列（GenBank登錄號：M28625.1），去除信號肽，并在目的基因前、后端引入EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)。合成的目的基因序列連在pUC57-simple載體上，重組獲得的陽性質(zhì)粒命名為pUC57-CaIFN-α2。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-CaIFN-α2的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒pUC57-CaIFN-α2和表達(dá)載體分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III雙酶切消化后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結(jié)果；回收目的基因與載體pET-28a(+)片段，在16℃條件下連接過夜，次日轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，涂于固體瓊脂平板上（100 μg/mL Kan+），37℃培養(yǎng)12～16 h；挑取單個(gè)菌落接種于3 mL的LB液體培養(yǎng)基中（100 μg/mL Kan+），提取質(zhì)粒，采用EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定；最后，將鑒定正確的陽性質(zhì)粒送公司測序，命名為pET-28a-CaIFN-α2。

1.5 CaIFN-α2基因的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 將重組質(zhì)粒pET-28a-CaIFN-α2轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)中，涂布在含卡那霉素（100 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)平皿上，放37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16 h。挑取單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，按1∶100比例轉(zhuǎn)接于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600值為0.8時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h。收集菌體，用10 mL PBS重懸，冰浴超聲破碎后，離心收集上清和沉淀；分別用全菌、破碎上清及沉淀制備樣品，同時(shí)設(shè)pET-28a(+)空載體菌及未轉(zhuǎn)化菌作對照，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，電泳結(jié)果用BandScan 5.0軟件分析目的蛋白的表達(dá)量。Western blot鑒定，一抗為鼠抗His單克隆抗體（1∶2000稀釋）；二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶1000稀釋），DAB溶液顯色。將鑒定正確的工程菌命名為pET-28a-CaIFN-α2/Rosetta。

1.6 CaIFN-α2表達(dá)條件的優(yōu)化 取重組工程菌液pET-28a-CaIFN-α2/Rosetta按1%的量接入LB液體培養(yǎng)基中（100 μg/mL Kan+），37℃ 220 r/min振搖培養(yǎng)至OD600值為0.8時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，分別誘導(dǎo)表達(dá)2 h、3 h、4 h、5 h和6 h，并同時(shí)設(shè)立空載體誘導(dǎo)表達(dá)的對照組。采用SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物，利用BandScan 5.0軟件分析各個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的表達(dá)量，表達(dá)產(chǎn)物命名為CaIFN-α。

1.7 重組CaIFN-α2的純化 將CaIFN-α2包涵體粗制品（200 mL培養(yǎng)體積）中加入10 mL預(yù)冷7M鹽酸胍，4℃攪拌2～3 h，10 000×g離心10 min，收集上清；將上清加入10倍體積的0.15 mol/L硼酸緩沖液使其緩慢復(fù)性，隨后裝入透析袋中，置于10 mmol/L氯化銨中透析24 h，間隔8 h換液一次；透析后離心收集上清，加入硫酸銨使其達(dá)到80%飽和度，緩慢攪拌8 h，離心收集沉淀；沉淀用8 mL去離子水溶解，再次放入透析袋中用去離子水透析24 h，中間換液2次；透析結(jié)束后用0.1 N的鹽酸調(diào)pH至2.0，再放入pH 7.2 20 mmol/L PBS中透析24 h，中間換液1次。10 000×g離心10 min收集上清，即為粗制品CaIFN-α2。將上述復(fù)性液上載1 mL HisTraqTMHP親和層析柱：用5個(gè)柱體積結(jié)合緩沖液（20 mmol/L磷酸鈉、0.5 mol/L氯化鈉、20 mmol/L咪唑，pH 7.4）平衡柱子；加復(fù)入性液；上載完樣品后，用5個(gè)柱體積結(jié)合緩沖液洗滌柱子，再用5個(gè)柱體積洗脫緩沖液（20 mmol/L磷酸鈉、0.5 mol/L氯化鈉、500 mmol/L咪唑，pH 7.4）進(jìn)行一步洗脫，收集流出液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.8 重組CaIFN-α2的活性測定 采用MDCK/VSV微量細(xì)胞病變抑制法檢測純化后重組CaIFN-α2的抗病毒活性：將生長狀態(tài)良好的MDCK細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞長成單層后，加入用含5%血清的DMEM培養(yǎng)液10倍倍比稀釋的純化后重組CaIFN-α2，每孔加入100 μL稀釋樣品，置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔接種100 μL 100個(gè)TCID50的VSV，置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；同時(shí)設(shè)病毒對照（只加病毒，不加重組CaIFN-α2）和空白對照（不加病毒和重組CaIFN-α2）；在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，以抑制50%細(xì)胞病變的最高CaIFN-α2稀釋度作為一個(gè)活性單位，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算重組CaIFN-α2的抗病毒活性。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-CaIFN-α2進(jìn)行雙酶切鑒定，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，可見兩條帶，分別約為5200 bp與510 bp，與預(yù)期大小相符，見圖1。測序結(jié)果也表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-CaIFN-α2構(gòu)建成功。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig. 1 Identi fi cation of the recombinant plasmid pET-28a-CaIFN-α2 digested with EcoR I and Hind III

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析與Western blot鑒定工程菌pET-28a-CaIFN-α2/Rosetta經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物，通過SDS-PAGE分析，可見在相對分子質(zhì)量約23 kDa處有一明顯條帶，與重組CaIFN-α2大小一致，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在；利用BandScan 5.0軟件分析，目的蛋白的表達(dá)量約占菌體總蛋白的表達(dá)量的52.5%，見圖2。Western blot檢測結(jié)果可見約23 kDa的條帶，與理論值相符，表明重組CaIFN-α2獲得成功表達(dá)。

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot分析Fig. 2 SDS-PAGE and Western blot analysis of the expressed products

2.3 表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化及純化 在同種宿主菌中，含CaIFN-α2的重組E.coliRosetta經(jīng)1 mmol/L的IPTG依次誘導(dǎo)表達(dá)2 h、3 h、4 h、5 h和6 h后，重組CaIFN-α2的表達(dá)量分別為40.5%、46.6%、52.5%、45.3%和41.8%，在誘導(dǎo)表達(dá)4 h時(shí)最高，因此本試驗(yàn)的最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為4 h，見圖3。以試驗(yàn)優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為條件，擴(kuò)大培養(yǎng)工程菌，提取的包涵體經(jīng)變性、復(fù)性和親和層析純化后，重組CaIFN-α2的純度可達(dá)92%。

2.4 重組CaIFN-α2的抗病毒活性分析 采用MDCK/VSV系統(tǒng)微量細(xì)胞病變抑制法檢測純化后的重組CaIFN-α2的抗病毒活性，結(jié)果顯示重組CaIFN-α2在MDCK細(xì)胞上呈現(xiàn)較高的抗病毒活性，見圖4，經(jīng)Reed-Muench法計(jì)算，活性為3.16×106U/mL。

3 討論

圖3 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果Fig. 3 Optimization result of induction time

圖4 重組CaIFN-α2的抗病毒活性分析Fig. 4 Antiviral activity analysis of the recombinant CaIFN-α2 in MDCK cells

近年來，隨著我國養(yǎng)犬業(yè)的迅速發(fā)展，犬的品種和數(shù)量也逐漸增多；與此同時(shí)，犬的各種病毒性疾病問題也日益凸顯。CaIFN-α具有廣譜的抗病毒活性，在犬病毒性疾病的臨床治療過程中起到重要的作用。林德貴[8]使用重組CaIFN-α治療犬瘟熱，結(jié)果表明重組CaIFN-α具有明顯的臨床療效。蘇建東[9]驗(yàn)證了重組CaIFN-α對犬細(xì)小病毒病的治療效果穩(wěn)定。除此之外，CaIFN-α還具有免疫調(diào)節(jié)功能。鄒勇等[10]研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量的干擾素α可明顯提高狂犬病疫苗的免疫效果，減少免疫接種的副反應(yīng)。因此，CaIFN-α具有良好的臨床應(yīng)用前景。

目前，CaIFN-α各亞型已成功克隆并表達(dá)。Taira等[5]將CaIFN-α的8個(gè)亞型分為2組，其中CaIFN-α1、CaIFN-α2和CaIFN-α7為一組；CaIFN-α3～CaIFN-α6和CaIFN-α8為一組；通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組CaIFN-α7，在犬腎細(xì)胞上抗水皰性口炎病毒的活性為2.0×107U/mg。徐曉娟等[11]通過對CaIFN-α1基因的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白經(jīng)復(fù)性后的抗病毒活性為2×106U/mL。第一組中的CaIFN-α2雖然早已克隆出來，但至今尚未有文獻(xiàn)報(bào)道其生物學(xué)活性和功能。本研究制備的CaIFN-α2在MDCK上的抗病毒活性為3.16×106U/mL，這與Taira等[5]報(bào)道的第一組亞型CaIFN-α具有較高抗病毒活性結(jié)果是一致的。

在表達(dá)系統(tǒng)的選擇上，由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)迅速、產(chǎn)量高，便于規(guī)模化操作等優(yōu)勢[12]，且已有很多通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)出抗病毒活性較高的動(dòng)物干擾素的報(bào)道[13,14]。因此本試驗(yàn)應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)CaIFN-α2，表達(dá)的重組CaIFN-α2主要以包涵體的形式存在，表達(dá)量占菌體總蛋白的比例高達(dá)52.5%。對包涵體蛋白而言，復(fù)性獲得具有生物學(xué)活性的蛋白是一個(gè)重要且關(guān)鍵的步驟，目前蛋白的復(fù)性方法主要有透析復(fù)性法、稀釋復(fù)性法、層析復(fù)性法和高流體靜壓復(fù)性法等[15]。有文獻(xiàn)報(bào)道稱，透析復(fù)性法對蛋白復(fù)性液中的化學(xué)環(huán)境起到穩(wěn)定的作用，而稀釋復(fù)性法則能極大地降低復(fù)性過程中蛋白的損失[16]。本試驗(yàn)采用稀釋復(fù)性和透析復(fù)性相結(jié)合的方法對CaIFN-α2重組蛋白進(jìn)行復(fù)性，可去除其中大部分雜蛋白，有利于提高重組蛋白的純度和增加目的蛋白的回收效率。

綜上所述，本研究構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-28a-CaIFN-α2，在大腸桿菌Rosetta中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，表達(dá)量為52.5%，并建立了一套系統(tǒng)穩(wěn)定、操作簡單的變復(fù)性方法，獲得的重組CaIFN-α2的抗病毒活性可達(dá)3.16×106U/mL，為進(jìn)一步研究CaIFN-α2的分子生物學(xué)特性和功能及其臨床生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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