易遠(yuǎn)勝，郭春娜，王霄旸，張可煜，楊帆帆，孫志良，薛飛群

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長沙 410000; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用化學(xué)藥物及制劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241; 3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心，長沙 410000）

雞球蟲病是養(yǎng)雞業(yè)中重要的常見的一種疾病，對雞的危害十分嚴(yán)重，分布廣泛，世界各地普遍發(fā)生，15～50日齡的雛雞發(fā)病率高，死亡率可達(dá)80%，病愈的雛雞，生長發(fā)育受阻，長期不能康復(fù)。成年蛋雞多為帶蟲者，增重和產(chǎn)蛋受到一定的影響。全世界每年用于預(yù)防球蟲病費(fèi)用已超過數(shù)億美元[1]。雞球蟲病作為一種寄生性原蟲病，疫苗很難對其進(jìn)行全面保護(hù)，宿主仍然有感染球蟲的風(fēng)險(xiǎn)[2]，抗球蟲藥物仍然是防治畜禽球蟲病的可靠手段[3]。

沙咪珠利（Ethanamizuril，EZL）是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所在地克珠利和妥曲珠利的基礎(chǔ)上自主研發(fā)的一種新型三嗪類抗球蟲藥。早期藥效學(xué)研究證實(shí)其有使用劑量低、抗球蟲活性高，具有成為新型抗球蟲藥物的潛力[4]。沙咪珠利在體內(nèi)吸收較少，有利于藥物在腸道保持較高的濃度，能直接作用于盲腸上的球蟲[5]。本研究利用高效液相色譜法建立沙咪珠利在雞盲腸中含量檢測方法，可以更好地用于沙咪珠利的后續(xù)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 高效液相色譜儀（Waters2695，美國Waters公司）；紫外檢測器（Waters2487，美國Waters公司）；氮吹儀（美國Organomation Associates公司）；雙量程分析天平（AE240，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；超純水系統(tǒng)（上海瑞楓生物科技有限公司）；渦旋混合器（XW-OA，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；超聲儀（SCQ-250，上海聲譜科學(xué)儀器廠）；離心機(jī)（An-ke LXJ-ⅡB，上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品、試劑和動(dòng)物 沙咪珠利對照品（含量≥99.8%）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物藥學(xué)研究室制備；妥曲珠利亞砜（純度99.4%±0.2%，WTTEGA Laboratorien）、己烷、磷酸均為分析醇，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜純乙腈購自Merck公司；其他試劑均為分析純；文中所用水均為超純水；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自上海閔優(yōu)家禽養(yǎng)殖合作社。

1.3 含量測定及樣品前處理

1.3.1 溶液的配制 精密稱取10 mg沙咪珠利對照品置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容到10 mL，制得沙咪珠利含量為1 mg/mL的對照品儲(chǔ)備液，取適量甲醇分別稀釋成5、10、50、100、250、500、1000 μg/mL系列濃度的對照品溶液。

1.3.2 色譜條件 X TERRA MS C18（4.6×250 mm，5 μm，Waters），流動(dòng)相為乙腈∶0.2%磷酸水（35∶65 v/v），流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，運(yùn)行時(shí)間30 min，柱溫為30℃，紫外檢測波長為251 nm。

1.3.3 樣品前處理 取0.5 g勻漿化雞盲腸置于10 mL離心管中，加入20 μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)液（妥曲珠利亞砜TSO）后渦旋30 s，靜置30 min，再加入5 mL乙腈，渦旋1 min，超聲20 min后在4000×g轉(zhuǎn)速下離心10 min，吸取上層有機(jī)層2.5 mL至離心管中，于60℃水浴下氮?dú)獯蹈?，加? mL流動(dòng)相復(fù)溶（乙腈∶0.2%磷酸水，35∶65，v/v），再加入0.8 mL己烷，渦旋1 min后在8000×g轉(zhuǎn)速下離心10 min，吸取下層過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣測定。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 專屬性考察 取空白盲腸和空白加樣盲腸分別按照前處理方法進(jìn)行處理，在確定的色譜條件下進(jìn)行進(jìn)樣，觀察在EZL和TSO保留時(shí)間處有無雜峰干擾，從而判斷專屬性是否良好。

1.4.2 檢測限和定量限 將EZL標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋到合適濃度后加入空白盲腸中，按照前處理方法進(jìn)行處理，按照色譜方法進(jìn)行進(jìn)樣測定，以色譜圖中沙咪珠利峰信噪比（s/n）≥3時(shí)的濃度作為檢測限；以信噪比（s/n）≥10時(shí)的濃度作為定量限。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 在0.5 g空白雞盲腸中加入沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，配置成樣品濃度為0.2、0.4、2、4、10、20、40 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個(gè)濃度5個(gè)平行樣品，按照前處理方法處理雞盲腸樣品，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖中沙咪珠利和妥曲珠利亞砜的峰面積，以樣品中EZL濃度為橫坐標(biāo)，以沙咪珠利與妥曲珠利亞砜峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 準(zhǔn)確度和精密度 準(zhǔn)確度用相對回收率表示。取0.5g空白雞盲腸，添加沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL，使樣品濃度分別為0.4、4、20 mg/kg，按照前處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣測定，每個(gè)濃度5個(gè)平行

樣品，樣品的相對回收率根據(jù)當(dāng)天制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。精密度包括日內(nèi)精密度和日間精密度。精密度用日內(nèi)和日間的標(biāo)準(zhǔn)偏差（RD）或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。制備0.4、4、20 mg/kg 3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個(gè)濃度5個(gè)平行樣品，按照前處理方法處理雞盲腸，進(jìn)樣測定，根據(jù)當(dāng)天制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)濃度實(shí)測值之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算日內(nèi)精密度。按照上述方法連續(xù)處理檢測3 d，計(jì)算日間精密度。

1.4.5 樣品穩(wěn)定性 本實(shí)驗(yàn)考察了2個(gè)濃度的雞盲腸樣品在室溫和3次凍融后的穩(wěn)定性。制備兩組含量濃度分別為2、5 mg/kg的雞盲腸樣品，第一組經(jīng)室溫放置8 h后按照1.4.2中的方法處理并進(jìn)樣測定，記錄沙咪珠利和妥曲珠利亞砜的峰面積；第二組處理方法是將盲腸樣品放置于-40℃冰箱保存24 h后取出自然解凍，完全解凍后再次將盲腸樣品放置于-40℃冰箱，如此反復(fù)3次后，將其按照1.4.2中的方法處理并進(jìn)樣測定，記錄沙咪珠利和妥曲珠利亞砜的峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出相對回收率。

2 結(jié)果

2.1 方法的專屬性 由圖1可知，在雞盲腸樣品中，EZL保留時(shí)間為7.4 min，TSO的保留時(shí)間為26.1 min，無雜質(zhì)干擾，專屬性良好。

圖1 雞盲腸中沙咪珠利含量檢測的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the determination of Ethanamizuril in chicken caecum

2.2 檢測限和定量限 按照1.4.2中的方法操作，以沙咪珠利峰和噪音的比值s/n≥3時(shí)的濃度為檢測限，由此得到本檢測方法的檢測限為0.04 mg/kg；同理，以s/n≥10的濃度為定量限，得到本檢測方法的定量限為0.2 mg/kg。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照1.4.3的方法制備并處理標(biāo)準(zhǔn)雞盲腸樣品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以EZL/TSO峰面積比值為y，以樣品中EZL濃度（mg/kg）作為x，計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.515x+0.00461，r2=0.994，測定范圍為0.2～40 mg/kg，具有良好線性關(guān)系，見圖2。

圖2 檢測雞盲腸內(nèi)EZL的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Linear correlation of standard curve of Ethanamizuril in chicken caecum

2.4 準(zhǔn)確度和精密度 按照1.4.4中的方法操作，本研究考察了0.4、4、20 mg/kg 3個(gè)濃度的準(zhǔn)確度和精密度，準(zhǔn)確度用相對回收率表示，精密度用RSD表示，見表1。

表1 雞盲腸中沙咪珠利含量檢測準(zhǔn)確度和精密度Table 1 Recovery and precision results of Ethanamizuril in chicken caecum

2.5 穩(wěn)定性考察 按照1.4.4中方法操作，本研究考察了2個(gè)添加濃度分別在室溫和經(jīng)過3次凍融后的樣品穩(wěn)定性，獲得數(shù)據(jù)如表2、表3所示。

表2 雞盲腸加標(biāo)樣品室溫放置8 h穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Stability of chicken caecum spiked samples in 8 h at room temperature

表3 雞盲腸中加標(biāo)樣品凍融3次穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Stability of chicken caecum spiked samples after freeze-thaw cycles

3 討論

沙咪珠利屬于三嗪類化合物，與地克珠利結(jié)構(gòu)式類似，都幾乎不溶于水[6]。隨著現(xiàn)代分析和檢測技術(shù)的發(fā)展，快速、簡便、高靈敏度和準(zhǔn)確度的檢測并可量化生物組織內(nèi)的藥物的方法得以出現(xiàn)，為藥物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究打下了基礎(chǔ)[7]。沙咪珠利在腎臟組織中會(huì)代謝成M3，在盲腸處理過程中并未發(fā)現(xiàn)沙咪珠利代謝成M3[8]。對樣品的提取方法研究中，本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇和乙腈分別單獨(dú)提取沙咪珠利和內(nèi)標(biāo)妥曲珠利亞砜的提取效率，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)乙腈提取效率較高，沉淀蛋白能力較強(qiáng)，且提取后內(nèi)源性物質(zhì)對于目標(biāo)物質(zhì)檢測無干擾。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用乙腈提取后溶液呈現(xiàn)淡黃色，還有脂肪成分，因此加入己烷進(jìn)行除脂，減少了雜質(zhì)干擾。流動(dòng)相選擇采用乙腈和0.2%磷酸水，在水相中加入0.2%磷酸后能顯著改善沙咪珠利的峰型；提高有機(jī)相比例有雜質(zhì)干擾內(nèi)標(biāo)妥曲珠利亞砜的檢測，為消除干擾，適當(dāng)降低有機(jī)相比例，當(dāng)乙腈∶0.2%磷酸水為35∶65（v/v）時(shí)，沙咪珠利和妥曲珠利亞砜都沒有雜質(zhì)干擾。

本研究建立了檢測雞盲腸中沙咪珠利含量的高效液相色譜方法，經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，線性良好，r2=0.994，回收率為90%～107%，批內(nèi)批間精密度為2.37%～6.80%，均符合樣品檢測的要求。該方法操作簡便快捷、重現(xiàn)性好，能滿足雞盲腸中沙咪珠利含量的檢測要求。

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