侯 婷，王霄旸，張麗芳，張可煜，薛飛群

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用化學(xué)藥物及制劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241）

尼卡巴嗪（雙硝苯脲二甲嘧啶醇）是一種廣譜、高效、穩(wěn)定的抗球蟲藥物，抗原蟲作用強(qiáng)，可促進(jìn)雞的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)能夠防治球蟲病，具有較好的應(yīng)用前景，主要用于預(yù)防雞盲腸球蟲和堆型、巨型、毒害、布氏艾美耳球蟲，常用于禽飼料添加劑[1-3]。

尼卡巴嗪是由4,4-二硝基均二苯脲（DNC）（圖1）和2-羥基-4,6-二甲基嘧啶（HDP）這2種成份按1∶1組成的復(fù)合物，其中HDP在動(dòng)物體內(nèi)由尿液排出，代謝消除迅速; 而作為抗球蟲的活性成份DNC，通過糞便排出，且代謝緩慢，因此各國(guó)規(guī)定了尼卡巴嗪在雞組織中的殘留標(biāo)示物為DNC[4]。我國(guó)235號(hào)公告規(guī)定DNC在雞的肌肉、皮/皮下脂肪、肝臟和腎臟中的最高殘留限量（MRL）均為200 μg/kg，且蛋雞產(chǎn)蛋期禁用。尼卡巴嗪在禽畜產(chǎn)品中的測(cè)定方法主要有高效液相-紫外法、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫法[4-9]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 29691-2013中采用高效液相-紫外法對(duì)雞的肌肉、肝臟和腎臟組織中殘留的DNC進(jìn)行檢測(cè)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 29690-2013中建立了對(duì)雞蛋和雞肌肉組織中DNC的殘留量進(jìn)行檢測(cè)的高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[10,11]。然而，目前國(guó)內(nèi)還沒有一種公認(rèn)的檢測(cè)方法可對(duì)雞食用性組織雞皮脂中殘留的DNC進(jìn)行有效的監(jiān)控。因此，建立一種對(duì)雞皮脂中尼卡巴嗪殘留標(biāo)示物4,4-二硝基均二苯脲進(jìn)行檢測(cè)的分析方法是勢(shì)在必行。本研究在參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 29690-2013的基礎(chǔ)上進(jìn)一步完善雞皮脂組織中尼卡巴嗪殘留標(biāo)示物4,4-二硝基均二苯脲殘留的檢測(cè)，以期達(dá)到監(jiān)督、監(jiān)控尼卡巴嗪安全使用的目的。

圖1 4,4-二硝基均二苯脲結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure of 4, 4-dinitrocarbanilide

1 材料與方法

1.1 儀器 2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），Quattro micromass三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（配ESI源， 美國(guó)Waters公司），分析天平（AE240，梅特勒-托利多公司），超聲波清洗儀（CQ250，上海超聲波儀器廠），離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），渦旋混合器（Genie-2,Scientific Industries公司），高速勻漿機(jī)（Waring公司），氮吹儀（北京康林公司）。

1.2 材料 4,4-二硝基均二苯脲（C13H10N4O5，純度大于97%，Sigma-Aldirch）；4,4-二硝基均二苯脲-d8（C13D8H2N4O5純度大于99.9%，Sigma-Aldirch）；色譜純乙腈、甲醇購(gòu)于美國(guó)Fisher 公司；其余試劑均為分析純；雞皮脂（雞皮及皮下脂肪）組織樣品為市場(chǎng)購(gòu)買，絞碎并均質(zhì)后使用；空白添加樣品：稱2.00±0.02 g空白試樣，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋1 min即得。

1.3 溶液的配制 精密稱取4,4-二硝基均二苯脲對(duì)照品和4,4-二硝基均二苯脲-d8對(duì)照品各（5.0±0.2）mg，置于10 mL容量瓶中，用二甲基甲酰胺溶解稀釋至刻度，配制成濃度為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液（4℃避光保存）；用甲醇稀釋成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液（4℃避光保存）。使用前用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化 采用MRM模式在負(fù)離子掃描方式下對(duì)4,4-二硝基均二苯脲和4,4-二硝基均二苯脲-d8進(jìn)行掃描，質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓為2.0 Kv；離子源溫度為120℃；脫溶劑溫度為350℃；錐孔氣流速為50 L/h；霧化氣流速為450 L/h；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、Dwell、錐孔電壓和碰撞能量，見表1。

1.5 液相條件優(yōu)化 選用Waters XTerra MS C18 液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），以甲醇∶乙酸銨溶液（75∶25，v/v）為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，見圖2。

1.6 雞皮脂組織樣品前處理過程 稱取均質(zhì)組織（2.00±0.02）g于50 mL離心管中，加入濃度為1 μg/mL 4,4-二硝基均二苯脲-d8甲醇溶液100 μL，渦旋1 min，加入8 mL乙腈，渦旋1 min，超聲10 min, 5 000×g離心10 min，取上清液，在40℃水浴條件下氮?dú)獯蹈桑?5%甲醇水溶液飽和正己烷1 mL，渦旋30 s，再加75%甲醇水溶液1.0 mL，充分渦旋混合，于40℃水浴中靜置5 min、2000×g離心5 min，取下層清液，0.22 μm濾膜過濾，取10 μL續(xù)濾液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

表1 化合物的定性、定量離子對(duì)、Dwell time值、碰撞能量和錐孔電壓Table 1 The qualitative and quantitative ion pair of compounds and the value of Dwell, Collision energy and Cone voltage

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液中DNC和內(nèi)標(biāo)（DNC-d8）的特征離子色譜圖Fig.2 The MRM chromatograms of DNC and internal standard (DNC- d8) in standard solution

1.7 方法學(xué)研究

1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性 取新配制的4,4-二硝基均二苯脲貯備液適量，稀釋成濃度為500 ng /mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分裝24份，分別存貯在-20℃、4℃、室溫避光和20℃光照條件下，于7 d、15 d、30 d后拿出并稀釋5倍后測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量，計(jì)算同一條件下平行樣的含量百分比的平均值。

1.7.2 特異性 空白試樣和空白添加試樣按照1.6處理后，按照1.4和1.5條件進(jìn)行檢測(cè)，觀察空白對(duì)4,4-二硝基均二苯脲是否存在干擾。

1.7.3 靈敏度考察 空白添加試樣按照1.6處理后，按照1.4和1.5中的條件進(jìn)行檢測(cè)，以待測(cè)物的信噪比S/N≥3為方法的檢測(cè)限，信噪比S/N≥10為方法的定量限為原則，確定組織中4,4-二硝基均二苯脲的檢測(cè)限和定量限。

1.7.4 線性 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法：精密量取10 μg/mL 4, 4-二硝基均二苯脲標(biāo)準(zhǔn)中間液和4, 4-二硝基均二苯脲-d8標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用75%甲醇水溶液稀釋，配制成4, 4-二硝基均二苯脲濃度為50、100、250、500和1000 ng/mL，且4, 4-二硝基均二苯脲-d8濃度均為100 ng/mL的系列對(duì)照溶液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。以4, 4-二硝基均二苯脲與內(nèi)標(biāo)定量離子質(zhì)量色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.7.5 基質(zhì)效應(yīng) 按1.7.4操作制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，測(cè)定后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線A；取5份雞空白皮脂試樣，按照1.6方法進(jìn)行處理空白樣品，吹干后的樣品加75%甲醇水溶液飽和的正己烷1 mL，渦旋30 s，加1 mL 1.7.4制備的系列標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液，充分渦旋混合，于40℃水浴中靜置5 min，2000×g離心5 min，取下層清液，0.22 μm濾膜過濾，測(cè)定后繪制標(biāo)曲B。根據(jù)標(biāo)曲B與標(biāo)曲A的斜率比值判斷是否存在基質(zhì)效應(yīng)。

1.7.6 精密度和回收率 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白試料中添加定量限濃度、MRL的0.5倍、1倍、2倍的4個(gè)水平添加濃度來(lái)進(jìn)行精密度和回收率的考察。每個(gè)濃度5個(gè)平行樣品，3個(gè)批次。以測(cè)定濃度與添加濃度的百分比計(jì)算試樣的百分回收率；以批內(nèi)5個(gè)樣品百分回收率之間的RSD %計(jì)算批內(nèi)精密度；以3批次15個(gè)樣品百分回收率之間的RSD %計(jì)算批間精密度。

1.7.7 添加試樣的穩(wěn)定性 取雞空白皮脂組織樣品按MRL濃度添加標(biāo)準(zhǔn)液，制備6個(gè)平行樣品，3份在-40℃冰箱放置3 d，考察3 d穩(wěn)定性；另外3份放置-40℃冰箱，每隔24 h將樣品取出，放置室溫融化后，再放置至-40℃儲(chǔ)存，連續(xù)3 d，考察樣品反復(fù)凍融穩(wěn)定性。以待測(cè)樣品的平均回收率評(píng)價(jià)試樣的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性研究 測(cè)定結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)溶液在4℃、-20℃和室溫避光條件下放置30 d后含量在98.15%～101.9%范圍內(nèi)，較為穩(wěn)定，而在光照條件下放置15 d后含量只有53.75%，放置30 d后含量只有10.15%。為了保證溶液穩(wěn)定和方便使用，最終選擇4℃避光條件下保存。

2.2 特異性考察 空白試樣和空白添加試樣的總離子流色譜圖，見圖3。結(jié)果顯示，雞皮脂基質(zhì)對(duì)4,4-二硝基均二苯脲無(wú)干擾，且出峰時(shí)間適宜，峰形良好。

圖3 雞皮脂中4,4-二硝基均二苯脲的色譜圖Fig.3 The chromatogram of DNC in chicken skin/fat

2.3 靈敏度考察 以待測(cè)物的信噪比S/N≥3為方法的檢測(cè)限，信噪比S/N≥10為方法的定量限為原則，測(cè)得雞皮脂組織中4,4-二硝基均二苯脲的檢測(cè)限和定量限分別為2.5 μg/kg和25 μg/kg。此方法的靈敏度可滿足目前此化合物的檢測(cè)技術(shù)指標(biāo)要求。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察 結(jié)果顯示，雞皮脂基質(zhì)標(biāo)曲B和標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)曲A的斜率比值為101.03%（比值在85%～115%范圍內(nèi)認(rèn)為不存在基質(zhì)效應(yīng)），即雞皮脂組織中殘留的4,4-二硝基均二苯脲采用本文建立的方法定量時(shí)不存在基質(zhì)效應(yīng)，可直接用標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量，見圖4。

2.5 線性 按1.7.4制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，4,4-二硝基均二苯脲在50～1000 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性方程為Y=0.0113x-0.1457，線性良好 （r=0.9998），見圖4。

2.6 精密度和回收率考察 在25～400 μg/kg添加范圍內(nèi)，空白添加試樣的平均回收率在98.10%～114.11%范圍內(nèi)，批內(nèi)和批間的RSDs均小于5%，具有較好的回收率和精密度，見表1。

圖4 4, 4-二硝基均二苯脲的標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)曲A和雞皮脂基質(zhì)標(biāo)曲B

2.7 添加試樣穩(wěn)定性研究 結(jié)果顯示200μg/kg的空白添加試樣置于-40℃冰箱3天后，其回收率為93.40%；200 μg/kg的空白添加試樣置于-40℃冰箱3天，并反復(fù)凍融3次后，其回收率為90.20%。結(jié)果表明，待測(cè)組織樣品在-40℃條件下穩(wěn)定性較好，樣品可暫時(shí)存放于-40℃冰箱。

表1 4,4-二硝基均二苯脲在雞皮脂組織中的添加回收率Table 1 The spiked recoveries of DNC in skin/fat of chicken

3 討論

本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS/MS）檢測(cè)系統(tǒng)，靈敏度高、基質(zhì)干擾少、檢測(cè)時(shí)間短。分離過程采用梯度洗脫，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好。在樣品前處理時(shí)采用乙腈提取、氮?dú)獯蹈蓾饪s、己烷除脂等步驟，操作簡(jiǎn)單、快速。采用內(nèi)標(biāo)法定量可一定程度上消除基質(zhì)效應(yīng)，直接使用溶液標(biāo)曲進(jìn)行定量，避免了制備基質(zhì)標(biāo)曲的操作過程，節(jié)約時(shí)間和成本，也簡(jiǎn)化了樣品的凈化步驟，此方法完全滿足我國(guó)市場(chǎng)雞皮脂中尼卡巴嗪殘留量的檢測(cè)。

本研究采用內(nèi)標(biāo)法建立了一個(gè)對(duì)雞皮脂組織中殘留的4,4-二硝基均二苯脲進(jìn)行檢測(cè)的液相串聯(lián)質(zhì)譜法，為國(guó)內(nèi)首個(gè)對(duì)雞皮脂組織中殘留的4,4-二硝基均二苯脲進(jìn)行檢測(cè)的分析方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、有效，可用于雞皮脂中尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物殘留量的檢測(cè)，可為市場(chǎng)上蓄禽產(chǎn)品的質(zhì)量安全檢測(cè)提供一定的參考。另外，本單位擬將其申請(qǐng)為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，以響應(yīng)國(guó)家農(nóng)業(yè)部的號(hào)召，以期實(shí)現(xiàn)雞皮脂組織中殘留的4,4-二硝基均二苯脲有標(biāo)可依、有標(biāo)可檢、執(zhí)法有標(biāo)可判。

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