周昌孌 ，譚 磊 ，謝 軍 ，丁 鏟

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.西北民族大學(xué)，蘭州730030）

外泌體是一種由細(xì)胞主動(dòng)分泌的具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的囊泡，直徑約在30～150 nm，其形狀類似于茶托或一側(cè)凹陷的半球形[1]。20世紀(jì)80年代外泌體發(fā)現(xiàn)初期，研究者認(rèn)為其僅僅用于攜帶細(xì)胞廢棄蛋白[2]，但約十年后發(fā)現(xiàn)，外泌體是另一種新型的細(xì)胞間通訊方式[3]，且對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲能力及腫瘤微環(huán)境有至關(guān)重要的影響，因而外泌體的相關(guān)研究呈現(xiàn)“噴井式”增加。近期研究發(fā)現(xiàn)，外泌體內(nèi)容物極其豐富，包含RNA、蛋白和脂類。截止目前，據(jù)Exocarta數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，已有9769種蛋白質(zhì)、3408種RNA、2838種microRNA和1116種脂類發(fā)現(xiàn)于外泌體中（http：//www.exocarta.org/）。其中，一些蛋白質(zhì)如CD63、TSG101和Hsp70等可以用于外泌體的鑒定，因?yàn)樗鼈兪峭饷隗w表面的共有蛋白[4]。

HeLa細(xì)胞來(lái)源于一位美國(guó)婦女海莉耶塔·拉克斯（Henrietta Lacks）子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系[5]，因其增殖迅速、可連續(xù)傳代、生長(zhǎng)環(huán)境要求低、感染性強(qiáng)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于腫瘤研究及其他生物實(shí)驗(yàn)。但目前HeLa細(xì)胞外泌體的相關(guān)研究仍較少，而得到高質(zhì)量有效的HeLa細(xì)胞外泌體是進(jìn)行HeLa細(xì)胞外泌體研究的第一步。

商品化外泌體提取試劑盒良莠不齊，且昂貴的價(jià)格常常令研究者望而卻步。2016年Rider等[6]解析了PEG聚沉法分離外泌體的關(guān)鍵步驟，并優(yōu)化了一整套分離方法，極大降低了PEG聚沉法的成本，且相關(guān)成分與商品化外泌體提取試劑盒類似。因此，本文采用優(yōu)化之后的PEG沉淀法與經(jīng)典差速離心法提取HeLa細(xì)胞分泌的外泌體，利用電鏡比較兩種方法所提外泌體的形態(tài)學(xué)差異，蛋白印跡技術(shù)及動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)分別從外泌體表面特有蛋白及顆粒大小與分布兩方面來(lái)鑒定兩種方法所提的外泌體，從而選取最為可靠有效的外泌體提取方法，為進(jìn)一步高效且經(jīng)濟(jì)地研究外泌體提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 宮頸癌細(xì)胞株HeLa由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所水禽病毒病團(tuán)隊(duì)提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和0.25%胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）均購(gòu)自Gibco公司；CD63抗體（EPR5702）購(gòu)自Abcam公司；PEG6000購(gòu)自Sangon公司；Optima L-100XP低溫差速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司；Tecnai G2 Spirit BIOTWIN透射電子顯微鏡購(gòu)自荷蘭FEI公司，納米粒徑電位分析儀（Malvern，Nano-ZS90）購(gòu)自英國(guó)馬爾文公司。

1.2 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清收集 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且密度達(dá)到1×106～1×107個(gè)細(xì)胞時(shí)，換成不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。

1.3 差速離心法提取外泌體 具體方法參照外泌體分離的相關(guān)文獻(xiàn)[4]，并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。即在4℃下，首先300×g離心10 min，吸取上清液，然后2 000×g離心10 min；吸取上清液后，10 000×g高速離心30 min，吸取上清液；140 000×g超速離心90 min；除去上清液，所獲得的沉淀即為外泌體。用PBS緩沖液洗滌沉淀并重懸后，140 000×g再次離心90 min，100 μL PBS緩沖液重懸沉淀，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PEG沉淀法提取外泌體 具體步驟參照Rider等[6]的PEG沉淀法分離外泌體方法，并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。在4℃下，首先2 000×g離心30 min，吸取上清液，等體積加入8% PEG6000溶液混合均勻后4℃孵育過(guò)夜（至少12 h），10 000×g離心60 min，收集沉淀，加入1 mL PBS重懸沉淀，12 000×g離心30 min，棄上清，以100 μL PBS緩沖液重懸沉淀，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 外泌體的形態(tài)學(xué)分析 吸取15 μL樣品滴加于銅網(wǎng)上，沉淀2 min，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余液體，滴加10 μL 3% 磷鎢酸（pH7.0），2 min后，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余染液，最后滴加純水于銅網(wǎng)，吸去多余純水，常溫干燥數(shù)分鐘后，于80 kV電鏡下成像。

1.6 外泌體標(biāo)志蛋白鑒定 分別提取兩種方法所提外泌體的總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂乳室溫封閉2 h后，加入一抗（CD63，1∶3 000；CD81，1∶2 000）4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗脫3次后，加入二抗（兔），室溫孵育1 h，TBST洗脫3次，顯影、定影。

1.7 外泌體顆粒大小分布分析 利用動(dòng)態(tài)光散射，將所提取的外泌體樣品用PBS稀釋至1 mL，添加至樣品池中，打開(kāi)Zetasizer軟件，設(shè)置溫度為25℃，溫度平衡時(shí)間為70 s、粘度為0.89 cP、折射率為1.330，同一樣本測(cè)量3次，而后得到樣品的粒徑大小與分布。

2 結(jié)果

2.1 外泌體形態(tài)學(xué)鑒定 利用差速離心法與PEG沉淀法提取HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清，均分離到一些泡狀物，所觀察到的樣品形態(tài)見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，差速離心法與PEG沉淀法提取的疑似外泌體樣品呈現(xiàn)典型的外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)，即茶托樣雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑大小均在30～150 nm，兩種方法所提的泡狀物在形態(tài)上無(wú)明顯差異。沉淀法提取的樣品中均能檢測(cè)到外泌體標(biāo)志蛋白的表達(dá)，其分子量分別為CD63（53 kDa）、CD81（26 kDa），進(jìn)一步證明了所提樣品可能為外泌體，見(jiàn)圖2。

圖1 兩種不同方法提取的外泌體形態(tài)的電鏡觀察Fig.1 The exosome extracted with two methods under electron microscopy

圖2 外泌體標(biāo)志蛋白的表達(dá)Fig. 2 Expression of exosome marker protein

2.3 外泌體顆粒大小分布分析 采用動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)差速離心法與PEG沉淀法獲得的外泌體的粒徑及分布，結(jié)果顯示，差速離心法所提外泌體粒徑=（58.4 ±23.17）nm，PEG沉淀法所提外泌體粒徑=（59.43±21.31）nm，且都呈單峰，占據(jù)樣品組分100%，該結(jié)果表明兩種方法所提外泌體粒徑及分布無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖3。

圖3 DLS檢測(cè)HeLa細(xì)胞外泌體粒徑及分布Fig.3 Particle size and distribution of the exosomes derived from HeLa cells measured by DLS

2.2 外泌體標(biāo)志蛋白CD63、CD81的表達(dá)鑒定Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用超速離心法與PEG

3 討論

一直以來(lái)，外泌體作為“蛋白垃圾包”不受重視，在2007年，mRNA與microRNA在外泌體中被發(fā)現(xiàn)[7]，從而改變了大家對(duì)外泌體的認(rèn)識(shí)，使其成為當(dāng)前生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。外泌體作為細(xì)胞間通訊方式之一，在生長(zhǎng)發(fā)育、感染、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移等多種生理病理過(guò)程中扮演著重要角色，而外泌體的載體性質(zhì)也為藥物的靶向研究開(kāi)辟了新天地[8]。

HeLa細(xì)胞作為一種重要的細(xì)胞模型，在腫瘤研究、病毒感染等眾多實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用。如今，各種類型細(xì)胞來(lái)源外泌體的相關(guān)研究不斷更新，但關(guān)于HeLa分泌的外泌體研究卻鮮有報(bào)道。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體，甚至同一類型細(xì)胞在不同生理狀態(tài)下分泌的外泌體常常存在差異，因此，采用什么方法獲取有效的HeLa細(xì)胞外泌體成為了困擾我們的難題之一。

我們參考了經(jīng)典離心法提供的具體實(shí)驗(yàn)步驟，在超離步驟時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用100 000×g離心，所提的HeLa外泌體數(shù)量極少，電鏡下觀察時(shí)，多個(gè)網(wǎng)格中僅能找到1～2個(gè)呈現(xiàn)經(jīng)典茶托樣雙層膜結(jié)構(gòu)的外泌體，但將此步驟提高至150 000×g后，發(fā)現(xiàn)外泌體其他地方出現(xiàn)數(shù)量明顯增加，但雙層膜結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)部分破損的現(xiàn)象，最終發(fā)現(xiàn)140 000×g進(jìn)行超離時(shí)，電鏡下觀察到的外泌體數(shù)量增加且結(jié)構(gòu)完整。

PEG沉淀法在過(guò)去的幾十年里，一直作為病毒富集的經(jīng)典方法[9]，而外泌體的顆粒大小與病毒相仿且部分理化性質(zhì)相似，因而該方法已成為提取外泌體的另一種新途徑[6,10]，國(guó)內(nèi)已將該方法應(yīng)用于血清中胎盤來(lái)源的外泌體[11]及精液外泌體提取[12]。因而受此啟發(fā)，利用該方法提取HeLa細(xì)胞來(lái)源的外泌體，且電鏡下觀察到的外泌體形態(tài)與經(jīng)典離心法差異不顯著，都呈現(xiàn)經(jīng)典的外泌體雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑約30～150 nm。經(jīng)典離心法與PEG法提取的外泌體中都表達(dá)標(biāo)志蛋白CD63和CD81。PEG法比經(jīng)典離心法步驟更簡(jiǎn)單，耗時(shí)更短。若從便捷角度看，PEG沉淀法比經(jīng)典離心法好，但PEG分子的引入，是否會(huì)影響外泌體的生物學(xué)活性，我們還尚未知曉，需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。因此，為保證所提外泌體的質(zhì)量，差速離心法是一種更可靠的有效提取Hela細(xì)胞中的外泌體的方法。

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