趙 宇 郭銀鳳 朱小東 姜彧滕 劉玉秋 劉必成 張曉良

糖尿病腎病(DN)是一種慢性炎癥性疾病，巨噬細(xì)胞浸潤是其重要病理特征[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)，決定DN發(fā)展方向的主要因素是局部組織中巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)[2]。巨噬細(xì)胞主要分為兩種不同的活化狀態(tài)，即經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(M1 型)和替代活化型巨噬細(xì)胞(M2 型)[3]。其中M1型巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)炎癥與組織損傷的作用，M2型則介導(dǎo)抗炎和組織修復(fù)作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)DN腎組織存在M1/M2巨噬細(xì)胞表型失衡并以M1型浸潤為主[4]。因此調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型已成為防治DN的重要研究方向。

自噬是一種由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)過多或異常蛋白質(zhì)的降解過程[4-5]。線粒體是細(xì)胞發(fā)生自噬的重要場(chǎng)所。研究發(fā)現(xiàn)腎臟固有細(xì)胞線粒體自噬的異常在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6-7]。然而，對(duì)于DN狀態(tài)下巨噬細(xì)胞線粒體自噬的變化及其生物學(xué)意義尚不清楚。因此，本研究擬通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)探討DN大鼠腎組織線粒體自噬特征與巨噬細(xì)胞M1/M2表型的相關(guān)性及在其分化中的作用。

材料與方法

材料和試劑健康雄性SD大鼠55只(上海 斯萊克)，6周齡，體質(zhì)量180～220g，鏈脲菌素(STZ，美國Sigma)。血糖儀(德國 羅氏)，CD68(美國Santa Cruz)。RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞(上海 博古生物科技)。RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco)，胎牛血清(美國Sciencell)。右旋葡萄糖、甘露醇、3-甲基腺嘌呤(3-MA)、雷帕霉素 (RAPA)(美國 Sigma)，CD68 (英國 Abcam)，自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (LC3)(美國 Sigma)，Beclin-1 (英國 Abcam),P62 (美國 Cell Signaling)，電壓依賴性陰離子通道(VDAC)(英國 Abcam),一氧化氮合酶(iNOS)(英國 Abcam),腫瘤壞死因子(TNF-α)(美國 Santa Cruz),甘露糖受體(MR) (英國 Abcam),精氨酸酶1 (Arg-1) (美國 Santa Cruz)，山羊抗兔二抗(美國 Jackson)，驢抗小鼠二抗(美國 Jackson)，驢抗兔二抗(美國 Jackson)，山羊抗小鼠(美國，Cell Signaling)。

糖尿病大鼠模型建立與分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食12 h，隨機(jī)分為正常對(duì)照(NC)組(n=10)、DN組(n=45)，DN組大鼠采用 STZ 58 mg/kg一次性腹腔注射法制備DN大鼠模型，NC組腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。72h后尾靜脈采血測(cè)定隨機(jī)血糖，以血糖>16.7 mmol/L為造模成功，未成模5只剔除。定期監(jiān)測(cè)體重、血糖，24h尿蛋白。8周、12周、18周、24周末處死，留取血和腎組織樣本。

血尿生化指標(biāo)檢查血糖、血清尿素氮、肌酐采用全自動(dòng)生化分析儀(日本日立)測(cè)定，24h 尿蛋白量采用雙縮脲法測(cè)定。

腎臟病理學(xué)檢查腎組織常規(guī)石蠟包埋，切成2 μm厚切片后行PAS、Masson染色。光鏡下觀察腎小球大小，基膜與系膜基質(zhì)增生情況，每張切片隨機(jī)選取20個(gè)完整腎小球。

免疫組織化學(xué)石蠟切片脫蠟水化，微波修復(fù)，SP法免疫組化試劑盒檢測(cè)腎組織 CD68巨噬細(xì)胞數(shù)量。所有操作按照說明書進(jìn)行。用 PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%～80%融合時(shí)，按照1×105個(gè)/ml細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)改為無血清培養(yǎng)，12h使其生長(zhǎng)同步化后實(shí)驗(yàn)。

Western印跡法組織、細(xì)胞加裂解液后勻漿、離心，取上清液測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白樣本變性后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳，轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯膜，5%封閉專用脫脂牛奶(美國BD)封閉，分別與特異性一抗抗體4℃孵育過夜(均為1∶ 500稀釋)。TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶ 1000)，室溫孵育1～2 h后洗膜。電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色(美國GE Heahhcare)，膠片掃描后用Quantity One軟件分析灰度值，并計(jì)算其與β-actin的比值。

免疫熒光PBS洗后，4%多聚甲醛固定，PBS洗，0．5%Triton-X100通透，PBS洗后1%BSA封閉，加入稀釋的一抗，4℃過夜，次日PBS沖洗，加入稀釋的二抗，避光孵育，PBS沖洗，最后加入DAPI核染液(碧云天)孵育，PBS洗凈。激光共聚焦顯微鏡下觀察LC3、VDAC，iNOS，MR表達(dá)，用Image-ProPlus 6.0軟件對(duì)熒光結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

透射電子顯微鏡待檢測(cè)的組織或細(xì)胞經(jīng)2.5%的戊二醛固定，制片，用透射電子顯微鏡(日本，日立)觀察線粒體及線粒體自噬體形成及降解的過程。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用One-Way ANOVA，兩兩比較采用SNK法檢驗(yàn)，兩變量間的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)大鼠血、尿檢測(cè)，病理特征及巨噬細(xì)胞浸潤情況隨著時(shí)間推移，DN組大鼠體重逐漸下降，24h尿蛋白定量、血糖、腎重/體重比值、肌酐和尿素氮顯著高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。病理染色結(jié)果顯示DN大鼠腎小球系膜增生，基膜增厚。DN組大鼠腎間質(zhì)中CD68+巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量顯著增多，且隨時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)行性增加(圖1)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)比較

KW/BW：腎重/體重；SCr：血清肌酐；BUN：尿素氮；NC:正常對(duì)照組;*:與NC組比較,P<0.05

DN大鼠腎間質(zhì)組織自噬與巨噬細(xì)胞M1/M2表型密切相關(guān)隨著DN進(jìn)展，自噬蛋白LC3在第8周達(dá)到最大值而p62達(dá)到最低值，提示自噬體生成在8周達(dá)到最高峰，且自噬溶酶體降解正常，表明自噬流通暢。8周后，自噬體LC3蛋白逐漸降低，p62升高，提示自噬流障礙。同時(shí)，M1標(biāo)記蛋白iNOS與M2標(biāo)記蛋白MR的比值隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，且iNOS與LC3呈負(fù)相關(guān)(r=-0.617,P<0.05)，iNOS與p62呈正相關(guān)(r=0.894,P<0.05)(圖1)。這些結(jié)果提示DN大鼠腎組織巨噬細(xì)胞M1/M2表型活化與自噬存在密切關(guān)系。

DN大鼠腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞線粒體形態(tài)改變且存在線粒體自噬障礙電鏡結(jié)果顯示正常大鼠腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)正常(圖1H)，存在完整的線粒體自噬過程(圖1J～N)。18WDN大鼠腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞線粒體腫脹、線粒體嵴消失或數(shù)量降低(圖1I)，自噬體和溶酶體數(shù)量顯著降低，未觀察到完整的線粒體自噬過程(圖1O～P)。免疫熒光共聚焦結(jié)果顯示，DN大鼠腎間質(zhì)線粒體標(biāo)記蛋白VDAC和自噬蛋白LC3較NC組降低，共定位表達(dá)減少(圖1Q)，DN組自噬蛋白LC3較NC組降低，而巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD68較NC組升高(圖1R)。

高糖干預(yù)條件下，RAW264.7細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化且存在線粒體自噬障礙體外研究發(fā)現(xiàn)，30 mmol/L葡萄糖干預(yù)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞后，M1活化標(biāo)志物TNF-α、iNOS隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，同時(shí)LC3、Beclin-1表達(dá)顯著降低，p62明顯升高，VDAC逐漸降低(圖2)。免疫熒光結(jié)果顯示，NC組巨噬細(xì)胞LC3 和VDAC存在共定位，而30 mmol/L葡糖糖干預(yù)24h后LC3 和VDAC表達(dá)降低，共定位明顯減少，提示高糖誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞線粒體自噬存在障礙(圖3D)。

高糖干預(yù)條件下，調(diào)節(jié)線粒體自噬能改變巨噬細(xì)胞M1/M2表型首先，選擇自噬體生成抑制劑(3-MA)和自噬體生成激活劑(RAPA)最佳干預(yù)濃度(圖3A、B)。1.5 mmol/L的3-MA與100 nmol/L的RAPA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

然后，用1.5 mmol/L的3-MA干預(yù)30 mmol/L葡萄糖預(yù)處理的巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LC3和Beclin-1表達(dá)降低，iNOS和TNF-α表達(dá)升高，提示抑制巨噬細(xì)胞自噬體生成能促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞進(jìn)一步向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用100 nmol/L的RAPA干預(yù)30 mmol/L葡萄糖預(yù)處理的巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LC3、Beclin-1、MR和Arg-1表達(dá)均升高，提示激活自噬體生成能促進(jìn)高糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向的M2型轉(zhuǎn)化(圖3)。

最后，通過透射電子顯微鏡，我們?cè)赗APA 干預(yù)組的巨噬細(xì)胞中觀察到完整的線粒體自噬過程(圖4)。

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本情況及線粒體自噬和巨噬細(xì)胞表型變化A～D：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本情況;E～G：線粒體自噬和巨噬細(xì)胞表型變化；H～I(xiàn)：大鼠腎組織線粒體形態(tài)和自噬；白色箭頭：線粒體(×20000)；J～N:正常大鼠腎組織完整線粒體自噬過程(×20000)；O～P：18W DN大鼠腎組織線粒體自噬；紅色箭頭：自噬體；白色箭頭：自噬溶酶體；黑色箭頭：溶酶體(×20000);Q～R：18W大鼠腎組織巨噬細(xì)胞線粒體自噬；白色箭頭：CD68陽性巨噬細(xì)胞(×400);*：與NC組比較，P<0.05(n=10)

圖2 不同時(shí)間(A)和濃度(B)高糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞表型和線粒體自噬的影響A:在30 mmol/L高糖干預(yù)下不同時(shí)間后巨噬細(xì)胞自噬和表型的變化;B:不同濃度干預(yù)24h后巨噬細(xì)胞自噬和表型的變化;N：正常對(duì)照組，11 mmol/L葡萄糖；HG：高糖組，30 mmol/L葡萄糖；*：與NC組比較，P<0.01 (n=3)

圖3 不同干預(yù)條件下巨噬細(xì)胞線粒體自噬水平及表型變化A、B：不同濃度3-MA與RAPA對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響；*：P<0.05 vs 0 mmol/L 或 0 nmol/L；#：P<0.05 vs 1.0 mmol/L 或50 nmol/L,(n=3)；C～F：不同干預(yù)條件下RAW264.7細(xì)胞Western Blot及免疫熒光結(jié)果(×400)；NC：正常對(duì)照組，11 mmol/L葡萄糖；HG：高糖組，30 mmol/L葡萄糖； Mannitol：等滲對(duì)照組，30 mmol/L甘露醇

圖4 巨噬細(xì)胞完整線粒體自噬過程A:隔離膜形成并延伸；B:自噬體的形成；C:溶酶體趨化；D:自噬體與溶酶體融合；E:自噬溶酶體的降解

討 論

巨噬細(xì)胞M1/M2表型活化狀態(tài)對(duì)DN轉(zhuǎn)歸和預(yù)后有重要影響[2]。探討巨噬細(xì)胞在DN中的表型及其調(diào)控機(jī)制對(duì)于疾病的防治具有重要意義。近年來我們一直致力于研究慢性腎臟病巨噬細(xì)胞表型表達(dá)規(guī)律及其對(duì)腎臟病預(yù)后的影響。我們前期在DN大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎組織浸潤的巨噬細(xì)胞主要以M1型活化為主，M2型巨噬細(xì)胞所占比例下降[8]；同時(shí)體外研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型活化[9-10]。隨后我們?cè)谘芯緿N患者腎組織標(biāo)本時(shí)發(fā)現(xiàn)，人腎組織巨噬細(xì)胞在DN早期以M1型為主，晚期以M2型占主導(dǎo)地位。上述研究表明，DN腎組織浸潤的巨噬細(xì)胞存在M1/M2表型失衡，特定情況下兩者可以相互轉(zhuǎn)化并對(duì)組織損傷與修復(fù)發(fā)揮不同作用，然而巨噬細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

自噬的變化與巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控存在密切聯(lián)系[11]。Duan等[12]發(fā)現(xiàn)促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬體的生成能夠修復(fù)氧化損傷，并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。Guo等[13]在對(duì)db/db小鼠皮膚傷口愈合研究中發(fā)現(xiàn)，自噬調(diào)節(jié)劑IFN調(diào)節(jié)因子8(IRF8)通過上調(diào)巨噬細(xì)胞自噬體生成能促進(jìn)皮膚傷口愈合，并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答效應(yīng)。上述研究提示，自噬對(duì)巨噬細(xì)胞功能調(diào)節(jié)具有關(guān)鍵作用。

線粒體是細(xì)胞發(fā)生自噬的重要場(chǎng)所[14-15]。Lemasters早在2005年就首次提出線粒體自噬的概念并被廣泛關(guān)注，為多種代謝相關(guān)疾病的研究提供了新方向，但其在腎臟疾病方面的研究仍處于起步階段[16-17]。在阿霉素誘導(dǎo)的腎小球腎炎動(dòng)物模型研究中發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞線粒體自噬流受抑制，腎小球硬化程度和蛋白尿水平明顯加重[18]。研究表明，腎臟固有細(xì)胞線粒體自噬的異常在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[19-20]，然而，對(duì)于病理狀態(tài)下浸潤的巨噬細(xì)胞線粒體自噬變化及其生物學(xué)意義尚不清楚。

本文通過STZ誘導(dǎo)的大鼠模型發(fā)現(xiàn)，隨著DN的進(jìn)展，巨噬細(xì)胞浸潤增多，線粒體自噬水平下降，并且自噬體生成標(biāo)志物L(fēng)C3與M1型標(biāo)志物(iNOS)成負(fù)相關(guān)((r=-0.617,P<0.05))。我們通過體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，觀察到高糖條件下巨噬細(xì)胞線粒體自噬水平降低，巨噬細(xì)胞向M1分化。RAPA激活自噬體的生成后我們觀察到自噬體生成增多的同時(shí)巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)志物表達(dá)增高，而用3-MA抑制自噬體的生成后，巨噬細(xì)胞則表達(dá)更多的M1型標(biāo)志物。綜上所述，DN大鼠腎組織M1/M2表型與線粒體自噬流水平密切相關(guān)，線粒體自噬流可能參與DN大鼠腎組織巨噬細(xì)胞M1/M2表型轉(zhuǎn)化。

然而目前線粒體自噬調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型的機(jī)制尚不清楚。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription,STATs)是調(diào)控巨噬細(xì)胞 M1/M2 型活化的關(guān)鍵因子[21]。IFN-γ、LPS 等物質(zhì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1活化，這一途徑是經(jīng)由STAT1介導(dǎo)[22]。M2巨噬細(xì)胞活化主要由STAT3介導(dǎo)[23]。因此，STAT1/STAT3是調(diào)控巨噬細(xì)胞 M1/M2 型活化狀態(tài)的重要環(huán)節(jié)[24]。Kang等[25]在對(duì)胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，激活自噬能夠提高線粒體STAT3的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)胰腺癌的發(fā)展。但在糖尿病腎臟疾病中，能否通過增強(qiáng)線粒體自噬水平進(jìn)而升高巨噬細(xì)胞STAT3的轉(zhuǎn)錄活性，實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化這一機(jī)制仍未有研究證明。因此，線粒體自噬調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的分子學(xué)機(jī)制及特異性調(diào)節(jié)線粒體自噬的藥物有待進(jìn)一步研究。

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