潘晶 章科娜 柴可夫 錢俊文 杜月光

浙江中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 杭州 310053

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見的并發(fā)癥，也是糖尿病患者主要死因之一。DN的主要病變特點為腎小球和腎小管間質(zhì)區(qū)的纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，腎上皮細胞發(fā)生上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與腎纖維化的過程有關(guān)[1]。EMT是指上皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細胞的現(xiàn)象。近年有研究表明腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變，與腎臟病變的發(fā)展及腎功能障礙密切相關(guān)[2]。與EMT發(fā)生相關(guān)的通路有很多，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/細胞因子Smad是目前研究最多的。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1） 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）依賴的組蛋白去乙酰化酶，與抗氧化應(yīng)激、抗細胞衰老及調(diào)節(jié)能量代謝等細胞活動有關(guān)[3]。近年研究提示，可通過激活SIRT1使Smad3、Smad4去乙?；M而抑制TGF-β1/Smad途徑，阻止EMT的發(fā)生[4-5]。

三七是我國的名貴中藥，具有止血、散血、定痛等功效，在臨床上應(yīng)用廣泛。三七皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）為其主要有效成分，藥理作用涉及抗氧化、抗纖維化、調(diào)節(jié)免疫和改善微循環(huán)等多個方面[6]。臨床研究證實PNS治療DN安全、有效。前期研究發(fā)現(xiàn)PNS可降低DN大鼠TGF-β1表達，升高骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（bone morphogenic protein 7，BMP7）的表達，具有抗腎纖維化，保護腎臟的作用[7-8]。但PNS是否通過激活SIRT1，抑制腎小管上皮細胞EMT的發(fā)生從而起到抗腎纖維化作用，尚未見明確報道。為此，本研究通過觀察PNS對高糖誘導下的大鼠腎小管上皮細胞EMT的影響，從SIRT1/TGF-β1/Smad通路探討其機制，為PNS治療DN進一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株來源及主要試劑 大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）購于中國科學院上海分院。DMEM培養(yǎng)液（批號：C11885500BT）、胎牛血清購于美國Gibco公司。PNS購于云南植物藥業(yè)有限公司。白藜蘆醇（resveratrol，RSV）購于美國ApexBio公司（批號：A4182）；SIRT1抑制劑EX527購于美國 ApexBio公司（批號：A4181）；α-SMA 抗體（批號：ab21027），E-鈣黏著蛋白（E-cadherin，E-cad）抗體（批號：ab76055）、SIRT1抗體（批號：ab166821）、TGF-β1抗體（批號：ab179695）均購于美國Abcam公司。BAC蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：P0010）。Real-time RT-PCR試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司（批號：CW2695）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒scriptTMg DNA Clear cDNA Synthesis Kit購于美國 Bio-Rad公司（批號：1725035）。

1.2 細胞培養(yǎng) NRK-52E細胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)。采用胰蛋白酶消化傳代，2～3d傳代1次，傳代3次后用于實驗。待細胞成長鋪滿培養(yǎng)瓶70%～80%時，用無血清DMEM培養(yǎng)基同步12～16h。

1.3 細胞分組及干預(yù) 本研究中所用藥物濃度依據(jù)參考文獻及前期預(yù)實驗結(jié)果確定[9-10]。實驗分組為：①正常對照組（normal control group）：細胞以含有5.5mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；②高糖組（high glucosegroup，HG group）： 細 胞 以 含 有30mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；③RSV組：細胞以含有 30mmol·L-1葡萄糖和 50μg·mL-1RSV 的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；④EX527組：細胞以含有30mmol·L-1葡萄糖和 10μmol·L-1EX527 的 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；⑤PNS組：細胞以含有30mmol·L-1葡萄糖和 100μg·mL-1PNS的 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)；⑥EX527+PNS組：細胞以含有30mmol·L-1葡萄糖和10μmol·L-1EX527 的 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，EX527 干預(yù)1h后再加入終濃度為100μg·mL-1的PNS。各組繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細胞，用于進一步實驗。

1.4 免疫組化檢測細胞內(nèi)α-SMA、E-cad蛋白表達細胞接種于6孔板，體積20μL/孔，細胞數(shù)量約1×105個，每組設(shè)3個復(fù)孔。細胞鋪滿爬片后，棄去上清液，PBS清洗3次，10%多聚甲醛溶液室溫固定細胞30min，PBS 洗片 3次，加入 0.5%TritonX-100，洗凈后分別加入 α-SMA（1:100）、E-cad（1:100）一抗，放置于濕盒上防止干燥，4℃孵育過夜；PBS洗片3次，分別加入二抗（α-SMA為鼠抗，E-cad為兔抗），37℃孵育1h，PBS洗凈后顯微鏡下DAB顯色，蘇木素復(fù)染，水洗，樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.5 Real-time RT-PCR檢測細胞內(nèi)SIRT1、TGF-β1、α-SMA、E-cad、Smad3、Smad4 mRNA 的表達收集細胞，按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，檢測并計算RNA的純度和濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR Green熒光法進行PCR擴增。PCR引物序列由上海生工生物工程公司合成，具體序列見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃退火延伸1min，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔。取其循環(huán)閾值（Ct）均值，計算各組的△Ct，以 2-△△Ct表示基因的相對表達量（△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，△△Ct=各實驗組△Ct值-正常對照組△Ct值）。

1.6 Western blot檢測細胞內(nèi) SIRT1、TGF-β1、α-SMA、E-cad蛋白的表達 收集細胞，采用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，然后采用BCA定量試劑盒進行蛋白濃度定量。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，每孔上樣量60μg，電泳 2h左右。完畢后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，放到T-TBS（含5%脫脂奶粉），室溫封閉1h，分別加入一抗SIRT1（1:2 500）、α-SMA（1:500）、E-cad（1:500）、TGF-β1（1:1 000）等，4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗（1:5000）室溫孵育1h，顯色，采用Super Signal West Dura Extended Duration Substrate顯影和定影，Image J軟件分析條帶的光密度值。目的蛋白相對表達量=[目的蛋白（光密度值）/內(nèi)參蛋白（光密度值）]×10表示。

表1 PCR引物序列Tab.1 The sequence of the primers of PCR

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD-t法），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞內(nèi)α-SMA和E-cad蛋白的表達 免疫組化結(jié)果顯示，正常對照組細胞質(zhì)內(nèi)僅有極少量α-SMA的表達，細胞膜上E-cad表達明顯；高糖組細胞α-SMA的表達增加，E-cad表達減低，RSV組和PNS組均可見α-SMA的表達減低，E-cad表達增加，EX527+PNS組α-SMA的表達減低不明顯，E-cad表達增加不明顯。見圖1、2。

圖1 各組細胞內(nèi)α-SMA的表達（200×）Fig.1 The expression of α-SMA in each group(200×)

圖2 各組細胞內(nèi)E-cad的表達（200×）Fig.2 The expression of E-cad in each group(200×)

2.2 各組細胞內(nèi)α-SMA和E-cad mRNA的表達與正常對照組比較，高糖組α-SMA mRNA表達增高（P＜0.05），E-cad mRNA 明顯減低（P＜0.01）。與高糖組比較，RSV組和PNS組α-SMA mRNA表達均減低（P＜0.05），E-cad mRNA 表達均增高（P＜0.01）；以EX527抑制SIRT1后，EX527+PNS組α-SMA mRNA表達高于PNS組（P＜0.05）、E-cad mRNA的表達則低于 PNS組（P＜0.01）。見圖 3。

圖3 各組細胞內(nèi)α-SMA和E-cad mRNA的表達Fig.3 The mRNA expression of α-SMA and E-cad in each group

2.3 各組細胞內(nèi) TGF-β1、SIRT1、Smad3 和 Smad4 mRNA表達的變化 與正常對照組比較，高糖組細胞TGF-β1、Smad3和 Smad4 mRNA 表達增高（P＜0.05或P＜0.01），SIRT1 mRNA 表達明顯減低（P＜0.01）；與高糖組相比，RSV 組和 PNS組細胞 TGF-β1、Smad3和Smad4 mRNA 表達均減低（P＜0.05或 P＜0.01），SIRT1 mRNA 增高（P＜0.01）。EX527+PNS 組 TGF-β1、Smad3和Smad4 mRNA表達高于 PNS組（P＜0.05或 P＜0.01）、SIRT1 mRNA 的表達則低于 PNS 組（P＜0.01）。見圖 4、5。

2.4 各組細胞內(nèi)α-SMA和E-cad蛋白表達 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，高糖組細胞α-SMA蛋白表達增高（P＜0.01），E-cad蛋白表達減低（P＜0.01）。與高糖組比較，RSV組和PNS組細胞α-SMA蛋白表達減低（P＜0.01），E-cad蛋白表達增高（P＜0.01）。與PNS組比較，EX527+PNS組細胞α-SMA蛋白表達增高（P＜0.01），E-cad蛋白表達減低（P＜0.01）。見圖6。

圖4 各組細胞內(nèi)TGF-β1和SIRT1 mRNA的表達Fig.4 The mRNA expression of TGF-β1and SIRT1 in each group

圖5 各組細胞Smad3和Smad4 mRNA的表達Fig.5 The mRNA expression of Smad3 and Smad4 in each group

圖6 各組細胞內(nèi)α-SMA and E-cad蛋白的表達Fig.6 The protein expression of α-SMA and E-cad in each group

2.5 各組細胞內(nèi)TGF-β1和SIRT1蛋白表達 與正常對照組比較，高糖組細胞SIRT1的蛋白表達減低（P＜0.01），TGF-β1表達增高，差異明顯（P＜0.01）。與高糖組相比，RSV組和PNS組細胞SIRT1表達明顯增高（P＜0.01），而 TGF-β1則減低（P＜0.01）。與 PNS組比較，EX527+PNS組細胞內(nèi)SIRT1蛋白表達低于PNS組（P＜0.01），而TGF-β1表達高于PNS組（P＜0.01）。見圖7。

圖7 各組細胞內(nèi)TGF-β1和SIRT1蛋白的表達Fig.7 The protein expression of TGF-β1and SIRT1 in each group

3 討論

DN是糖尿病最常見的并發(fā)癥，也是導致終末期腎衰竭（end stage renal disease，ESRD）的主要原因之一。其主要病變特點為腎小球和腎小管間質(zhì)區(qū)域細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）發(fā)生進行性積聚，導致腎小球和腎小管間質(zhì)區(qū)的纖維化。目前認為，肌成纖維細胞與腎纖維化的發(fā)生關(guān)系最為密切，不但直接參與細胞基質(zhì)成分的過度合成和沉積，而且可以破壞原有的腎臟結(jié)構(gòu)[11-12]。Iwano等[13]對單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral occlusion，UUO）大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，腎間質(zhì)中新形成的成纖維細胞約有36%來源于EMT，由此可見EMT在DN腎間質(zhì)纖維化中起著重要作用。

EMT是一種由不能移動的有極性的上皮細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞的過程。在病理狀況下，上皮細胞發(fā)生去極化，喪失極性，轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞形態(tài)，細胞黏附能力下降，且這種改變通常伴有細胞間粘連蛋白如E－cad和γ－連環(huán)蛋白的表達下降，肌動蛋白骨架重組，間充質(zhì)細胞表型激活，間充質(zhì)細胞標志物如成纖維細胞特異蛋白-1（fibroblast specific protein-l，F(xiàn)SP-1）、α-SMA等活化，細胞遷移和運動的能力增強[14]。本實驗通過高糖刺激大鼠腎小管上皮細胞，結(jié)果顯示細胞膜上的E-cad表達減低，而細胞質(zhì)內(nèi)的α-SMA表達增加，提示高糖可導致腎上皮細胞發(fā)生EMT，與既往研究一致[9]。

許多因素可以誘導或促進EMT的發(fā)生，其中TGF-β1被認為是EMT過程的主要誘導因子。TGF-β1與TGF-βR結(jié)合，同時形成同源二聚物，發(fā)放跨膜信號誘導Smad2/3活化，并與Smad4組成混合體，激活細胞內(nèi)Smad4通路，負調(diào)節(jié)E-cad蛋白表達，上調(diào)波形蛋白、纖維粘連蛋白等間充質(zhì)細胞表型蛋白的表達，介導細胞遷移能力的提高，促進EMT的發(fā)生，可見TGF-β1/Smad是EMT發(fā)生的一條重要的信號通路[15]。本實驗結(jié)果表明，高糖作用下細胞TGF-β1、Smad3、Smad4表達上升，提示該通路被激活，可能與腎小管上皮細胞EMT有關(guān)。R-Smads的活性除了受到磷酸化水平的影響，也受到乙?；降恼{(diào)節(jié)。

SIRT1是一種依賴于NADH的組蛋白去乙?；?，在調(diào)節(jié)及維持細胞能量代謝中有重要作用[16]，在足細胞、腎小管上皮細胞有表達。研究表明，SIRT1激活可通過抑制炎癥、氧化應(yīng)激、腎纖維化、細胞凋亡和促進自噬等延緩DN發(fā)展[17]。Li等[18]通過免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可誘導NRK-52E細胞Smad3乙酰化水平增加。而SIRT1激活劑RSV可逆轉(zhuǎn)其乙?；?，從而減少腎纖維化。Huang等[4]通過對5/6腎切除大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，敲除SIRT1基因后，RSV的作用減弱，Smad3的乙?；皆黾?，同時TGF-β1的轉(zhuǎn)錄活性顯著提高，加重了腎功能損害，腎纖維化表現(xiàn)明顯，故提出SIRT1因子是保護腎臟纖維化的重要因素，且與TGF-β1/Smad3信號通路有關(guān)。本研究表明RSV干預(yù)后細胞 SIRT1表達明顯上升，TGF-β1及 Smad3、Smad4表達減低，E-cad表達增高而α-SMA減低，而使用SIRT1抑制劑EX527后則無明顯作用。結(jié)合上述文獻及本研究結(jié)果提示，SIRT1激活后可能是通過降低Smad3/4的乙?；?，從而逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生。

三七是我國名貴藥材，性甘，微苦，具有散瘀止血、消腫定痛的作用。長期的臨床應(yīng)用證實，三七治療DN有較為理想的效果。PNS是三七中的主要成分，在延緩腎小管間質(zhì)纖維化，改善腎功能中有明顯作用。體外實驗發(fā)現(xiàn)PNS對高糖誘導的腎系膜細胞具有保護作用，其機制是激活SIRT1，使核因子κB（nuclear factor κB,NF-κB）去乙?；M而抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[10]。研究表明，PNS對人肺泡上皮細胞EMT有抑制作用[19]，但具體機制尚不明確。本研究通過高糖刺激腎小管上皮細胞模擬EMT發(fā)生，使用PNS干預(yù)后，E-cad表達增加，α-SMA減少，提示PNS能夠緩解EMT的發(fā)生，與上述研究結(jié)果一致。同時，TGF-β1和 Smad 表達減低，SIRT1 表達增高，而EX527抑制SIRT1的表達后，PNS作用受到抑制，由此推斷PNS可能通過激活SIRT1，抑制TGF-β1/Smad通路，減少了EMT發(fā)生。

綜上所述，PNS阻止高糖刺激下的腎小管上皮細胞發(fā)生EMT，其機制可能是通過誘導激活SIRT1，抑制TGF-β1/Smad通路來完成的。該研究不僅在實驗上證明了PNS對腎臟的保護作用，也為其用于DN的臨床治療提供了理論依據(jù)。

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