陳園園 郝瑩 張瑾 張鑫 謝坤銘 丁銘 顧衛(wèi)紅

三核苷酸重復(fù)序列疾?。═RD）系致病基因內(nèi)三核苷酸重復(fù)序列拷貝數(shù)在細(xì)胞減數(shù)分裂過程中發(fā)生動態(tài)突變，異常擴(kuò)展導(dǎo)致的一組遺傳性疾病。正常人攜帶的三核苷酸重復(fù)序列在一定范圍內(nèi)存在多態(tài)性，并在代間傳遞過程中保持穩(wěn)定。當(dāng)重復(fù)序列拷貝數(shù)超過一定閾值時呈現(xiàn)出不穩(wěn)定性，部分呈現(xiàn)出逐代擴(kuò)展趨勢。目前已發(fā)現(xiàn)30余種由三核苷酸異常擴(kuò)展導(dǎo)致的疾?。??3］，相關(guān)重復(fù)序列包括胞嘧啶?腺嘌呤?鳥嘌呤（CAG）、胞嘧啶?胞嘧啶?鳥嘌呤（CCG）、鳥嘌呤?腺嘌呤?腺嘌呤（GAA）、胞嘧啶?胸腺嘧啶?鳥嘌呤（CTG）和鳥嘌呤?胞嘧啶?鳥嘌呤（GCG），主要位于基因編碼區(qū)、內(nèi)含子區(qū)和非翻譯區(qū)。脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)（SCA）有9種亞型屬于三核苷酸重復(fù)序列疾病，即SCA1型、SCA2型、SCA3型、SCA6型、SCA7型、SCA8型、SCA12型、SCA17型和齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮（DRPLA），三核苷酸重復(fù)擴(kuò)展次數(shù)通常＜200次；此外，亨廷頓?。℉D，致病基因為IT15基因）、類亨廷頓病2型（致病基因為JPH3基因）、脊髓延髓肌萎縮癥（SBMA，致病基因為SBMA基因）等也屬于三核苷酸重復(fù)序列疾病。

三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變的檢測可以采用基于毛細(xì)管電泳的片段分析、克隆測序、直接測序和蛋白印跡法等技術(shù)，其中，蛋白印跡法操作繁瑣，已較少用于常規(guī)基因檢測。目前的常規(guī)檢測方法是基于毛細(xì)管電泳的片段分析。本研究采用基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序檢測14例脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)患者（包括3例SCA2型、2例SCA7型、7例SCA8型和2例SCA17型）致病基因三核苷酸重復(fù)序列，比較兩種方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

對象與方法

一、研究對象

研究對象為2005年8月-2016年5月中日友好醫(yī)院運動障礙與神經(jīng)遺傳病研究中心收集的臨床擬診為脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)家系先證者，選取其中的SCA2型3例、SCA7型2例、SCA8型7例和SCA17型2例共14例，均為漢族，男性10例，女性4例；年齡10～58歲，平均（33.42±13.62）歲。本研究經(jīng)中日友好醫(yī)院道德倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有受試者及其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

二、研究方法

1.樣本采集 所有受試者空腹采集外周靜脈血各5 ml，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.8%的枸櫞酸鈉進(jìn)行抗凝，采用標(biāo)準(zhǔn)酚氯仿DNA提取法提取基因組DNA。

2.三核苷酸重復(fù)序列突變分析 采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、瓊脂糖凝膠電泳和基于毛細(xì)管電泳的片段分析進(jìn)行脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)致病基因動態(tài)突變分析。（1）PCR反應(yīng)：在Ensembl數(shù)據(jù)庫中檢索SCA2、SCA7、SCA8和SCA17基因重復(fù)序列，基于重復(fù)片段兩側(cè)序列采用Primer 3.0軟件設(shè)計引物序列并進(jìn)行同源比對，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，SCA2基因正向引物（F引物）序列：5'?TTTGGTAGCAACGGCAAC?3'，反向引物（R引物）序列：5'?CGGGCTTGCGGACATTGG?3'；SCA7 基因正向引 物 （F引 物 ） 序 列 ：5'?GGAGTCGAAAGCGAAAGCTA?3'，反向引物（R 引物）序列：5'?AACCCACAGATTCCACGACT?3'；SCA8基 因 正 向 引 物（F引 物 ） 序 列 ：5'?GGTCCTTCATGTTAGAAAACCTGGCT?3'，反向引物（R 引 物 ） 序 列 ：5'?TTTGAGAAAGGCTTGTGAGGACTGAGAATG ?3'；SCA17基因正向引物（F引物）序列：5'?GGGACGTTGACTGCTGAAC?3'，反向引物（R引物）序列：5?TTCTTCTTGCTTTCCACAGG?3'。熒光引物序列由上海普邁生物科技有限公司合成，SCA7、SCA8和SCA17基因正向引物經(jīng)D4熒光標(biāo)記，SCA2基因引物采用熒光標(biāo)記M13末端加尾法標(biāo)記。SCA2基因正向引物（F引物）序列：5'?TTTGGTAGCAACGGCAAC?3'，反向引物（R 引物 +M13引 物 ） 序 列 ：5'?CACGACGTTGTAAAACGACCGGGCTTGCGGAATT?GG?3'；SCA7基因正向引物（F熒光引物）序列：5'?TTTTTTGTTACATTGTAGGAGCG?3'，反向引物（R引物）序列：5'?AACCCACAGATTCCACGACT?3'；SCA8基因正向引物（F熒光引物）序列：5'?GGTCCTTCATGTTAGAAAACCTGGCT?3'，反向引物（R 引 物 ） 序 列 ：5'?TTTGAGAAAGGCTTGTGAGGACTGAGAATG ?3'；SCA17基因正向引物（F熒光引物）序列：5'?GGGACGTTGACTGCTGAAC?3'，反向引物（R引物）序列：5?TTCTTCTTGCTTTCCACAGG?3'。PCR 反應(yīng)體系共 25 μl，依次加入 dNTPs 2.50 mmol，2× GC 緩沖液Ⅰ12.50 μl，SCA2、SCA7、SCA8 和 SCA17 基因正向引物和反向引物各5 pmol，模板DNA 100 ng，Taq酶1 U，加滅菌去離子水補充至25 μl。SCA2基因PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，以94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s循環(huán)35次，72℃延伸10 min；SCA7基因PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃ 50 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min，每個循環(huán)減1℃共循環(huán)15次，94 ℃ 50 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共循環(huán)29次，72℃延伸10 min；SCA8基因PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃ 45 s、69℃ 30 s、72℃ 2 min，每個循環(huán)減0.50℃共循環(huán)20次，94℃45 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，共循環(huán)10次，72 ℃延伸10 min；SCA17基因PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。（2）瓊脂糖凝膠電泳：取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，電泳50 min，對于出現(xiàn)2條電泳條帶的樣品進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析。（3）基于毛細(xì)管電泳的片段分析：采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的CEQ?8000核酸分析儀對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段分析，包括 20 μl甲酰胺，以 0.25 μl CEQ DNA Size Standard Kit?600 片段作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)，1 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混勻后上樣；預(yù)設(shè)程序進(jìn)行電泳分離，分離條件為毛細(xì)管溫度達(dá)50℃時，90℃變性120 s，電壓2 kV下注入樣本30 s、電壓4.80 kV下電泳70 min，以預(yù)設(shè)分析參數(shù)進(jìn)行片段分析。

3.三核苷酸重復(fù)序列拷貝數(shù)計算 在Ensembl數(shù)據(jù)庫中檢索SCA2、SCA7、SCA8和SCA17基因及其包含的三核苷酸重復(fù)序列，在CEQ?8000核酸分析儀Analysis Parameters窗口STR Locus Tag界面設(shè)置重復(fù)次數(shù)與片段長度的對應(yīng)關(guān)系，以SCA17基因為例：正向引物經(jīng)D4熒光標(biāo)記，擴(kuò)增出287 bp片段，此片段包含38次CAG重復(fù)序列，因此設(shè)置CAG重復(fù)序列與片段長度的關(guān)系時，以287 bp對應(yīng)38次CAG重復(fù)序列為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)置。采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的GenomelabTMGeXP Genetic Analysis System軟件，以GS?600 LIZ片段為相對分子質(zhì)量標(biāo)記，計算樣本擴(kuò)增片段長度，并自動生成擴(kuò)增片段包含的重復(fù)序列。

4.動態(tài)突變的克隆測序 將14例樣本送檢寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行克隆測序，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別切膠回收后，克隆至TaKaRa pMD?18?T載體，選取陽性克隆進(jìn)行DNA測序，計算CAG重復(fù)序列。

結(jié) 果

一、SCA2基因CAG重復(fù)序列分析

對3例 SCA2型患者（編號：A15?71、A15?25和A16?9）的樣本進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序（表1）。SCA2正常等位基因CAG重復(fù)序列為14～32次，異常等位基因CAG重復(fù)序列為33～77次?；诿?xì)管電泳的片段分析顯示，3例樣本擴(kuò)展片段CAG重復(fù)序列分別為31、30和32次；毛細(xì)管電泳峰形特征為，大多數(shù)正常重復(fù)序列為單一銳利主峰，其右側(cè)有一矮峰，而擴(kuò)展重復(fù)序列為簇狀低矮爪形峰，CAG重復(fù)序列的計數(shù)以中間高峰為準(zhǔn)（圖1）。對3例樣本擴(kuò)展片段CAG重復(fù)序列分別選取3個不同菌落進(jìn)行克隆測序，其結(jié)果顯示，CAG重復(fù)序列分別為37/40/40、37/38/39和38/39/40次；每例樣本的不同克隆測序結(jié)果CAG重復(fù)序列存在差異，且同一例樣本的不同克隆測序結(jié)果亦存在堿基差異。

表1 SCA2、SCA7、SCA8和SCA17基因基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序結(jié)果Table 1. Results of expanded repeats numbers of SCA2,SCA7,SCA8 and SCA17 genes detected by capillary electrophoresis and clone sequencing

二、SCA7基因CAG重復(fù)序列分析

對2例SCA7型患者（編號：A20?13和 A20?13?2）的樣本進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序（表1）。SCA7正常等位基因CAG重復(fù)序列為4～27次，異常等位基因CAG重復(fù)序列為37～200次?；诿?xì)管電泳的片段分析顯示，2例樣本擴(kuò)展片段CAG重復(fù)序列分別為57和34次。對A20?13樣本擴(kuò)展重復(fù)序列進(jìn)行2次切膠回收克隆測序，第1次獲得的CAG重復(fù)序列為85次，第2次選取3個不同菌落進(jìn)行克隆測序，CAG重復(fù)序列分別為69、74和75次；對A20?13?2樣本擴(kuò)展重復(fù)序列進(jìn)行的克隆測序，CAG重復(fù)序列為45次。

三、SCA8基因CTA/CTG重復(fù)序列分析

對7例SCA8型患者的樣本進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序（表1）。SCA8正常等位基因重復(fù)序列為15～37次，異常等位基因重復(fù)序列＞100次，某些個體攜帶中間重復(fù)等位基因?；诿?xì)管電泳的片段分析顯示，7例樣本擴(kuò)展重復(fù)序列分別為99、111、104、92、89、104和75次?？寺y序顯示，7例樣本擴(kuò)展重復(fù)序列分別為97、116、104、90、90、102和76次。

圖1 SCA2基因毛細(xì)管電泳峰形圖顯示，正常片段呈單一銳利主峰（黑箭頭所示），擴(kuò)展重復(fù)序列呈簇狀低矮爪形峰（紅箭頭所示）Figure 1 Capillary electrophoresis of SCA2 gene. Normal amplicon showed a single sharp main peak(black arrow indicates)and expanded repeats showed a cluster of low claw?shaped peak(red arrow indicates).

四、SCA17基因CAG重復(fù)序列分析

對2例SCA17型患者（編號：A20?33和A19?45）的樣本進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序（表1）。SCA17正常等位基因CAG重復(fù)序列25～42次，異常等位基因CAG重復(fù)序列為45～66次?；诿?xì)管電泳的片段分析顯示，2例樣本短片段/擴(kuò)展片段CAG重復(fù)序列分別為37/50和36/45次?？寺y序顯示，A20?33樣本3個菌落短片段重復(fù)序列為37/36/36次、擴(kuò)展片段重復(fù)序列為51/50/52次，A19?45樣本2個菌落短片段重復(fù)序列為36/35次、擴(kuò)展片段重復(fù)序列為45/44次。

討 論

三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變是一種特殊的突變方式，多種疾病表現(xiàn)為患病后代的異常重復(fù)序列進(jìn)一步擴(kuò)展，導(dǎo)致發(fā)病年齡提前、疾病進(jìn)展加快，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和婚育。我們研究團(tuán)隊多年來致力于對此類突變患者進(jìn)行常規(guī)檢測，包括基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序，積累較為豐富的臨床經(jīng)驗。

基于毛細(xì)管電泳的片段分析有以下幾方面特點：（1）穩(wěn)定性佳，如本研究SCA7基因A20?13樣本，我們研究團(tuán)隊曾對多個樣本進(jìn)行重復(fù)分析，結(jié)果完全一致。（2）存在問題，相關(guān)基因CAG重復(fù)區(qū)及其兩側(cè)GC含量升高，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增產(chǎn)物遷移行為不同于堿基隨機(jī)組成的片段，毛細(xì)管電泳采用變性后的單鏈DNA，可以在電泳時產(chǎn)生“發(fā)卡”形二級結(jié)構(gòu)，形成局部不完全堿基互補的雙鏈DNA，導(dǎo)致DNA鏈變短，如果以GC含量相對均衡的內(nèi)參照物作為對照，判讀的單鏈DNA長度小于 實 際 長 度［4?6］。 本 研 究 SCA2 和 SCA7 基 因CAG重復(fù)序列基于毛細(xì)管電泳的片段分析結(jié)果均小于克隆測序結(jié)果。陳樸等［4］的研究顯示，SCA2和SCA7基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的高遷移率與其重復(fù)序列兩側(cè)GC含量升高密切相關(guān)，究其原因可能是由于側(cè)翼GC含量升高可以增加單鏈DNA形成更加復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的機(jī)會，從而使DNA鏈進(jìn)一步縮短，對其遷移率產(chǎn)生更加顯著的影響。

克隆測序有以下幾方面特點：（1）其優(yōu)點是可視性佳，直觀。（2）其缺點是步驟繁瑣；切膠時難以完全分開短片段和長片段；克隆過程中DNA復(fù)制忠實性較低，結(jié)果不穩(wěn)定。本研究對3例SCA2基因樣本行多個克隆測序，結(jié)果均不同，且出現(xiàn)多種堿基突變；對SCA7基因同一樣本的擴(kuò)展重復(fù)序列進(jìn)行2次切膠克隆測序，結(jié)果亦存在明顯差異。克隆測序結(jié)果的不穩(wěn)定性可能與大腸桿菌中序列異常重組有關(guān)，使三核苷酸產(chǎn)生不穩(wěn)定性擴(kuò)增［7?9］。轉(zhuǎn)入大腸桿菌的重組雙鏈 DNA 在 CTG?CAG處發(fā)生DNA雙鏈斷裂，產(chǎn)生2個缺口，遂在斷裂缺口處以其他雙鏈DNA為模板，在大腸桿菌復(fù)制和修復(fù)功能作用下經(jīng)組合形成新的雙鏈DNA。與斷裂前相比，重新組合的雙鏈DNA CAG重復(fù)序列擴(kuò)展。在基因重組過程中，CAG重復(fù)序列越多、越易形成“發(fā)卡”形結(jié)構(gòu)以穩(wěn)定 CAG 序列［7，10?13］。

采用基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序檢測SCA2和SCA7基因擴(kuò)展重復(fù)序列存在顯著差異，而SCA8和SCA17基因擴(kuò)展重復(fù)序列差異不顯著，究其原因，可能是由于SCA2和SCA7基因CAG重復(fù)序列較單純，在代間傳遞過程中易擴(kuò)展［14?15］；SCA8和SCA17基因重復(fù)序列不單純，尤其是SCA17基因，重復(fù)序列包含多個胞嘧啶?腺嘌呤?腺嘌呤（CAA）序列，可能對重復(fù)序列具有穩(wěn)定作用［16?17］。

通過長期的大量實驗和數(shù)據(jù)積累，我們認(rèn)為，基于毛細(xì)管電泳的片段分析是檢測基因動態(tài)突變的穩(wěn)定、可靠方法，在判讀重復(fù)序列時存在的差異是可以預(yù)知的，而且方法便于操作，適用于常規(guī)基因檢測。與此同時，我們結(jié)合家系患者的臨床表型特點和代間傳遞規(guī)律，對基于毛細(xì)管電泳的片段分析結(jié)果進(jìn)行判讀，以保證基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

近年來，基因測序技術(shù)發(fā)展迅速，但是目前應(yīng)用較為廣泛的二代基因測序由于讀長所限，難以對三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變進(jìn)行檢測。2013年，Loomis等［18］采用單分子實時測序（SMRT）首次獲得脆性X染色體綜合征（FRAX）基因三核苷酸重復(fù)序列的全長信息，為三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變的檢測提供新的技術(shù)。

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