榮成博 趙爽 宋爽 王晶 劉宇

（北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所 北京市食用菌工程技術研究中心，北京 100097）

白靈側(cè)耳（Pleurotus tuoliensis）是我國具有自主知識產(chǎn)權的珍稀食用菌品種［1-2］。野生白靈側(cè)耳主要寄生或腐生于傘形花科植物阿魏的根莖，在我國白靈菇僅產(chǎn)于新疆木壘、青河、托里、塔城和阿勒泰等地［3］。20世紀90年代我國實現(xiàn)人工栽培，商品名白靈菇［4］。白靈側(cè)耳子實體色澤潔白，風味獨特，被譽為草原上的牛肝菌［5］。白靈側(cè)耳營養(yǎng)豐富，且有很高的藥用價值，其多糖具有抗腫瘤［6］、增強機體免疫力［7］、抗氧化、降血脂［8］和改善心腦血管疾?。?］等功效。但由于白靈菇生長周期長、出菇整齊度差、畸形菇比例高等問題制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展［10］。探索參與白靈菇子實體發(fā)育形成的基因能夠為分子輔助育種提供有效、快速標記，為選育出具有優(yōu)良性狀的白靈菇菌株奠定基礎。

白靈菇子實體發(fā)育相關基因研究進展緩慢，陳苗苗等［11］通過mRNA差異顯示技術篩選白靈菇菌絲和原基兩個不同發(fā)育時期的差異，獲得了8個差異片段，分別與細胞色素P450、糖基轉(zhuǎn)移酶、擴展蛋白、糖苷水解酶家族3、核糖體蛋白L29、高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和未知蛋白具有同源性；Fu等［12］通過比較轉(zhuǎn)錄組分析了白靈側(cè)耳在后熟菌絲期、冷刺激的菌絲期、原基期和子實體形成期4個生長不同階段基因的表達情況，篩選出了不同時期的差異表達基因，主要涉及形態(tài)發(fā)生、基礎碳代謝、冷刺激和藍光反應相關基因。

本實驗室前期將白靈菇10號（JZB2106010）通過原生質(zhì)體單核化獲得兩個不同極性的單核體后進行自交，獲得一株具有鎖狀聯(lián)合、菌絲潔白濃密的雙核自交菌株 45×49（JZB2106103）［13］。出菇實驗表明JZB2106010能夠形成子實體，而JZB2106103不形成子實體。因此，JZB2106010和JZB2106103是挖掘白靈菇子實體發(fā)育相關基因的優(yōu)良實驗材料。本實驗分別對白靈菇菌株JZB2106010和JZB2106103進行了轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對部分差異表達基因進行熒光定量PCR驗證，發(fā)現(xiàn)了文獻報道之外的基因參與了白靈菇的子實體發(fā)育。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 白靈菇10號（JZB2106010）和白靈菇自交菌株45×49（JZB2106103）由北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所提供。

1.1.2 試劑 SYBR Premix Ex Taq II購自寶生物工程（大連）有限公司，RNase-Free DNase Set和RNeasy Mini kit購自Qiagen公司，瓊脂糖購自Sigma公司，PDB和PDA培養(yǎng)基購自Difco公司，Revert Aid First stand cDNA synthesis kit購自Thermo公司，所用引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 JZB2106010和JZB2106103在PDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 d，過濾收集菌絲，采用RNeasy Mini kit提取RNA，RNase-Free DNase Set消化殘余的DNA。通過瓊脂糖電泳和Nanodrop檢測RNA的完整性，OD260/280為1.8-2.2之間，28S：18S≥ 1。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序 用Oligo（dT）25磁珠進行mRNA的純化；mRNA破碎后，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈和第二鏈，構建測序文庫，利于cluster station制備測序樣品簇，Hiseq2000上機測序，每個菌株測定1個樣品。

1.2.3 生物信息學分析數(shù)據(jù) 過濾原始數(shù)據(jù)后，采用Trinity軟件進行序列組裝，利于Blast進行Unigene的比對；對Unigene進行GO注釋及功能分類統(tǒng)計；將Unigene和COG數(shù)據(jù)庫比對分析及功能分類統(tǒng)計；在KEGG網(wǎng)站進行代謝通路的分析；采用FPKM法進行基因表達量計算，進行基因差異表達分析。

1.2.4 熒光定量PCR（qPCR） 按照1.2.1進行RNA的提取以及DNA的消化，采用Revert Aid First stand cDNA synthesis kit 進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行熒光定量PCR，反應體系如下：上下游引物各10 pmol，cDNA 1 μL，SYBR Premix Ex Taq Mix 10 μL，RoxⅡ 0.4 μL，ddH2O補充水至20 μL。ABI7500進行熒光定量PCR檢測。每個樣品3個重復。

2 結果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)組裝注釋

白靈側(cè)耳JZB2106010和JZB2106103菌株采用Hiseq2000進行了轉(zhuǎn)錄組測序，采用Trinity進行序列的組裝拼接。JZB2106010獲得26 136個Unigene，JZB2106103獲 得 27 753個 Unigene， 共計獲得30 125個Unigene。通過blastx將Unigene序列比對到蛋白數(shù)據(jù)庫NR、Swiss-Prot、KEGG和COG（evalue＜0.00001）， 并 通 過 blastn 將 Unigene比對到核酸數(shù)據(jù)庫 Nt（evalue＜0.00001），得到跟給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。共計22 923個Unigene能夠比對到NR數(shù)據(jù)庫，占Unigene基因總數(shù)的76.1%。

2.2 Unigene的GO和COG分類

對Unigene進行GO功能注釋和分類，在生物過程（Biological process）、細胞組成（Cellular component）和分子功能（Molecular function）3個本體中，分別獲得15 821、8 250和10 647個注釋條目。COG是對基因產(chǎn)物進行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫，對白靈菇的Unigene進行了功能分類，其中4 203個Unigene被歸在了R類（General function prediction only）， 占 Unigene總 數(shù) 的 17.1%；其 中 2099個Unigene被歸在了K類（Transcription），占Unigene總數(shù)的8.6%（圖1）。

圖1 COG功能注釋

2.3 Unigene差異表達分析

由圖2可知，白靈側(cè)耳JZB2106103相對于JZB2106010有1 056個Unigene表達量上調(diào)，658個Unigene表達量下調(diào)。對差異表達基因進行GO功能分析，結果（圖3）顯示在生物過程中差異基因數(shù)目最多的是代謝過程（Metabolic process），共計224個基因；細胞組成中差異基因數(shù)目最多的是細胞膜（Membrane），共計64個基因；分子功能中差異基因最多的是催化活性（Catalytic activity）共計276個基因。

圖2 白靈側(cè)耳JZB2106010和JZB2106103的基因差異表達

圖3 白靈側(cè)耳JZB2106010和JZB2106103的差異表達基因功能分類

2.4 差異表達基因的驗證

選取代謝過程（metabolic process）和催化活性（catalytic activity）中部分差異表達量顯著的基因進行熒光定量PCR驗證，同時也選取白靈菇JZB2106010和JZB2106103差異表達量最大的Unigene7793進行驗證（引物設計見表1）。從圖3中可以看出Unigene7793、Unigene7650、Unigene9911、Unigene9496、Unigene9850、Unigene8969、Unigene9302、Unigene9849在不形成子實體的白靈菇JZB2106103中比JZB2106010表達顯著上調(diào)，其中Unigene7793的表達量上調(diào)幅度大，為1 046.41倍，Unigene8969基因表達量上調(diào)幅度在供試基因中最低，為8.75倍；CL4509和CL2173在JZB2106010表達顯著上調(diào)，分別是JZB2106103的3.33倍和8.33倍（表2）。結果顯示CL4509和CL2173的高表達利于白靈側(cè)耳子實體的發(fā)育，而其他8個基因的低表達有利于白靈側(cè)耳子實體的發(fā)育。

3 討論

食用菌子實體發(fā)育相關基因的研究是一項復雜且具有重要理論和實際意義的工作［14］。在食用菌中常通過分析菌絲期和子實體形成期基因差異表達情況分析與子實體發(fā)育相關的基因，包括mRNA差異顯示技術［15］、轉(zhuǎn)錄組技術、雙向電泳技術［16］和蛋白質(zhì)組分析［17］等。其中轉(zhuǎn)錄組技術優(yōu)勢顯著，該方法無需預先設計特異性探針，因此無需了解物種基因或基因組信息，直接對任何物種進行最全面的轉(zhuǎn)錄組分析，且高通量測序成本的降低為全局考慮食用菌子實體形成的基因表達狀態(tài)及調(diào)控提供便利。

近年來利用轉(zhuǎn)錄組測序在挖掘食用菌子實體發(fā)育相關基因上取得了一定的進展。Fu等［12］通過比較轉(zhuǎn)錄組分析了白靈菇在后熟菌絲期、冷刺激的菌絲期、原基期和子實體形成期4個生長不同階段基因的表達情況，篩選出了不同時期的差異表達基因，主要涉及形態(tài)發(fā)生、基礎碳代謝、冷刺激和藍光反應相關基因。Tao等［18］分別采集了草菇生長發(fā)育不同階段的樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序，菌絲體到原基期共得到1 503個差異表達基因，子實體形成的蛋形期到伸長期具有1 367個差異基因，通過對差異基因進行功能富集和代謝途徑分析表明，在原基期上調(diào)表達的基因主要涉及到對細胞和代謝過程的調(diào)節(jié)，下調(diào)的基因參與的主要生物過程為細胞組分的生物合成；蛋形期到伸長期顯著下調(diào)的是參與細胞分裂的基因。Yu等［19］對靈芝菌絲和子實體進行了轉(zhuǎn)錄組測序，在菌絲生長階段表達上調(diào)的是生物合成相關的基因，如氨基酸代謝合成，ATP合成等，而相反的在子實體階段與降解相關的基因表達上調(diào)，同時電子傳遞、能量代謝相關的基因在子實體中的表達量也上調(diào)。Zhou等［20］同樣采用轉(zhuǎn)錄組測序分析了毛木耳菌絲與子實體發(fā)育不同階段的基因差異表達，結果表明homeobox類型的轉(zhuǎn)錄因子在子實體中表達上調(diào)，而鋅指類轉(zhuǎn)錄因子在菌絲中表達上調(diào)，裂褶菌中具有同樣的結果。

表1 熒光定量PCR所用的基因及引物

表2 基因表達量的熒光定量PCR驗證

本實驗首次分別以能夠正常形成子實體的白靈菇雙核菌株JZB2106010和不能夠形成子實體的白靈菇雙核菌株JZB2106103為實驗材料，通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得了兩株菌基因差異表達數(shù)據(jù)，并進行富集分析，獲得了一些與白靈側(cè)耳子實體發(fā)育相關的基因，包括文獻已經(jīng)報道的基因（如碳代謝相關基因），JZB2106010和JZB2106103中具有表達差異的基因有22 個，包括CL3723.Contig1、CL3291.Contig1、Unigene1780等；選取部分表達量差異顯著的基因進行熒光定量PCR驗證，獲得了一些之前文獻未報道過的與白靈側(cè)耳子實體發(fā)育相關的基因。JZB2106010和JZB2106103中基因表達差異最大的Unigene7793，編碼 ATP依賴的DNA解旋酶，解旋酶是一類參與核酸代謝的重要保守酶類，如核酸復制、重組、修復和轉(zhuǎn)錄等［21］，本實驗結果表明DNA解旋酶基因的表達與子實體發(fā)育呈負相關。類苯丙烷類在維管植物的生長、發(fā)育中是必需的，苯丙氨酸裂解酶（PAL）是類苯丙烷類代謝途徑的第一步，參與黃酮類、苯丙烷類和木質(zhì)素等物質(zhì)的合成［22］，本實驗結果也發(fā)現(xiàn)了PAL與白靈側(cè)耳的子實體發(fā)育相關；乙醇氧化酶參與了真菌木質(zhì)素的降解［23］，在能夠形成子實體的白靈側(cè)耳中乙醇氧化酶基因表達量顯著提高，也說明它與白靈側(cè)耳子實體的發(fā)育相關。本研究發(fā)現(xiàn)的與白靈側(cè)耳子實體發(fā)育相關基因為白靈側(cè)耳的分子遺傳育種奠定基礎，后續(xù)應進一步明確基因功能以及遺傳性狀之間的關系。

4 結論

本實驗以JZB2106010和JZB2106103為實驗材料，進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了兩個菌株的差異表達基因并進行了功能富集分析，其中催化活性和代謝過程本體中差異基因數(shù)目最多，選取部分表達差異顯著的基因通過熒光定量PCR進行驗證，結果顯示編碼苯丙氨酸裂解酶的基因（CL4509）和編碼乙醇氧化酶的基因（CL2173）在JZB2106010中表達量顯著提高，與白靈側(cè)耳的子實體發(fā)育相關；另外還發(fā)現(xiàn)一個編碼DNA解旋酶的基因（Unigene7793）在JZB2106103中的表達量是JZB2106010的1046倍，實驗結果表明該基因的大量表達是JZB2106103不能結實的一個原因。

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