劉 娜,程傳濤,楊文彬,周 琦*

(1西安交通大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)用超聲研究室,西安 710004;2西安交通大學第二附屬醫(yī)院普通外科;*通訊作者,E-mail:zhouqi15@163.com)

甲狀腺癌是最常見的內分泌惡性腫瘤,且近10年發(fā)病率增長迅速[1],甲狀腺乳頭狀癌是主要的病理類型,占所有甲狀腺惡性腫瘤的86%[2]。甲狀腺癌影響人群廣泛,從青少年到老年人,女性發(fā)病率是男性3倍,男性發(fā)病高峰要晚于女性10-20年[3]。甲狀腺癌發(fā)病主要與基因變異有關,另外還有環(huán)境因素,目前被公認的環(huán)境因素為電離輻射[4]。甲狀腺癌根治術是目前治療甲狀腺癌的主要方式,雖然絕大多數(shù)患者手術切除后有很好的總體生存率,但仍有一部分患者死于轉移與復發(fā)。近年來研究發(fā)現(xiàn),對甲狀腺癌發(fā)生的分子機制的研究,有助于提供更加有效的治療手段[5]。lncRNA H19在人胚胎組織、骨骼肌肉組織大量表達,其調節(jié)通路與許多腫瘤如胃腸道腫瘤、結腸腫瘤和膀胱腫瘤的基因凋亡有關[6]。但關于它在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過程中所扮演的角色鮮有報道。此外,報道稱microRNA let7a在許多惡性腫瘤如結腸癌和喉癌中表達下調[7]。但尚無報道研究lnc RNA H19和miRNA let7a表達情況對于甲狀腺癌預后的影響,因此,探索二者與甲狀腺癌預后的相關性,期望為預測臨床結局及靶向治療和評價療效提供分子學依據(jù),是本研究的宗旨。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

收集從2009-01～2012-01在西安交通大學第二附屬醫(yī)院行甲狀腺癌根治術的131例甲狀腺癌組織和癌旁組織(距甲狀腺癌組織3-5 cm)為病例組。同期收集122例行甲狀腺部分切除術的甲狀腺良性腫瘤的正常甲狀腺組織作為對照組。所有標本用10%福爾馬林固定并石蠟包埋,切片厚度4 μm備用。

納入標準:①患者除了病理診斷為甲狀腺癌,其他器官沒有嚴重疾??；②患者尚未行甲狀腺癌術后為期3周的放射治療；③患者術前甲功正常；④患者無其他惡性腫瘤病史或放射線暴露史。

排除標準:①患者有遠處轉移或肺轉移(包括合并其他腫瘤或原發(fā)性肺癌)；②患者有精神疾患或情緒不穩(wěn)定無法配合；③患者有慢性疾病如心肌梗死、腦卒中、心衰和心房纖顫；④患者有放射治療病史。

1.2 實時定量聚合酶鏈反應檢測

采用TRIzol法提取病例組與對照組樣本組織標本RNA。按照TAKARA試劑盒說明反轉錄第一個單鏈DNA(TAKARA,寶生物工程大連有限公司),合成出的cDNA作為模板用于擴增H19和GAPDH(內參基因)。PCR引物序列見表1。

表1PCR引物序列

Table1PrimersequencesofPCR

基因 引物序列 GAPDH上游：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′下游：5′-GGCTGTTGTCTTACTTCTCATGG-3′ H19上游：5′-GAACACCTTAGGCTGGTGGG-3′下游：5′-ATGTTGTGGGTTCTGGGAGC-3′ let7a上游：5′-GCGCCTGAGGTAGTAGGTTG-3′下游：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′

PCR反應體系(20 μl)組成包括7.8 μl的雙蒸餾水,1.0 μl DNA模板,各0.4 μl上游和下游引物,0.4 μl ROX參考染料(50x),10.0 μlSYBR.反應流程:95 ℃條件下,預變性2 min,接著40個循環(huán),95 ℃,5 s;冷卻到60 ℃,34 s,延伸到68 ℃,30 s;取各個樣本的cDNA及其相對應的引物按照以上方法混合,然后進行PCR擴增,收集熒光信號,進行熔解曲線分析,反應結束后由系統(tǒng)自動計算相對定量的結果,每個樣本重復3次。

1.3 隨訪

對患者的隨訪主要通過門診復查、電話及郵件的方式,一般在術后1月進行一次,第一年每3個月隨訪一次,第二年每6個月隨訪一次,以后每一年隨訪一次,一直隨訪至2017年1月31號結束。隨訪率達到100%,所有患者相關的臨床數(shù)據(jù)都被隨訪記錄了5年。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。lncRNA H19和miRNA let7a表達情況的比較采用卡方檢驗和Fisher’s精確概率檢驗。ROC曲線評價lncRNA H19和miRNA let7a對甲狀腺癌的診斷價值。Kaplan-Meier法分析甲狀腺癌5年生存率,單因素和多因素分析影響甲狀腺癌預后因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床病理特征

病例組包括男性43例,女性88例,年齡15-78歲,平均年齡(45.3±8.2)歲。對照組包括男性38例,女性84例,年齡20-74歲,平均年齡(47.1±8.7)歲。年齡和性別兩組對比差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)。病例組中,87例腫瘤直徑≥1.0 cm,44例腫瘤直徑<1.0 cm。甲狀腺癌術后病理分型中,78例為甲狀腺乳頭狀癌,29例濾泡癌,24例髓樣癌。52例腫瘤突破包膜,79例腫瘤未突破包膜。根據(jù)2002年UICC(Union for International Cancer Control)指南里甲狀腺癌TNM分期[8],51例TNMⅠ+Ⅱ期,80例TNM Ⅲ+Ⅳ期,69例有淋巴結轉移,62例沒有淋巴結轉移。

2.2 miRNA let7a和lncRNA H19在甲狀腺癌組織、癌旁組織及正常甲狀腺組織中的表達

qRT-PCR結果顯示,miRNA let7a在甲狀腺癌組織、癌旁組織及正常組織表達分別為0.54±0.31,1.03±0.43和1.13±0.38,miRNA let7a在甲狀腺癌組織中表達降低(P<0.05)。lncRNA H19在甲狀腺癌組織、癌旁組織及正常甲狀腺組織中表達分別為4.02±0.85,3.24±0.73和3.07±0.81,lncRNA H19在甲狀腺癌組織中表達升高(P<0.05)。lncRNA H19和miRNA let7a在癌旁組織和正常甲狀腺組織中表達無明顯差異(P>0.05,見圖1)。

與癌旁組織和正常甲狀腺組織比較，*P<0.05圖1 lncRNA H19和miRNA let7a在甲狀腺癌(TC)組織中的表達Figure 1 The expression of lncRNA H19 and miRNA let7a in TC

2.3 ROC曲線評價miRNA let7a和lncRNA H19對甲狀腺癌的診斷價值

miRNA let7a ROC曲線下面積0.116 (95% CI 0.076-0.157),診斷閾值0.87,敏感度和特異度分別為84.0%和77.0%,約登指數(shù)0.61。lncRNA H19 ROC曲線下面積0.801(95% CI 0.747-0.855),診斷閾值3.58,敏感度和特異度分別為72.5%和75.4%。約登指數(shù)0.479。提示當miRNA let7a表達低于0.87或者lnc RNA H19表達超過3.58時,甲狀腺癌發(fā)生機會增加(見圖2)。

2.4 miRNA let7a和lncRNA H19表達水平與甲狀腺癌臨床病理特征的關系

根據(jù)約登指數(shù),選取靈敏度和特異度之和的最高點為截斷值,miRNA let7a診斷界點為0.87,≥0.87表示let7a高表達,<0.87表示let7a低表達。lncRNA H19診斷界點為3.58,≥3.58表示H19高表達,<3.58表示H19低表達。miRNA let7a和lncRNA H19表達情況在性別、年齡、組織病理分型和有無包膜浸潤組間比較差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miRNA let7a和lncRNA H19表達在腫瘤直徑≥1 cm和<1 cm組間比較,TNMⅠ+Ⅱ期和TNM Ⅲ+Ⅳ期組間比較,有無淋巴結轉移組間比較,差異分別有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。在腫瘤直徑≥1 cm,TNM Ⅲ+Ⅳ期,及伴隨淋巴結轉移組中,miRNA let7a低表達,相應的lncRNA H19高表達(P<0.05,見表2)。

2.5 miRNA let7a和lncRNA H19表達與甲狀腺癌預后的相關性

術后隨訪5年的131例患者中,53例患者存活,78例患者死亡,死亡率59.5%。131例患者術后病理證實,21.3%(28/131)周圍組織侵犯,10.7%(14/131)遠處轉移,6.1%(8/131)對側甲狀腺轉移,52.6%(69/131)頸部淋巴結轉移。遠處轉移的病例中,8例肺轉移,1例肝轉移,4例骨轉移,1例腎上腺轉移。其中乳頭狀癌死亡41例,髓樣癌死亡18例,濾泡狀癌死亡19例。其中64例死于該腫瘤,14例死于遠處轉移。Kaplan-Meier生存分析曲線顯示,miRNA let7a低表達者5年生存率35.2%(37/105),高表達者5年生存率61.5%(16/26),低表達者預后差,二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);lncRNA H19高表達者5年生存率28.44%(27/95),低表達者5年生存率72.2%(26/36),高表達者預后差,二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3)。

圖2 lncRNA H19和miRNA let7a表達對TC診斷的ROC曲線Figure 2 ROC curve analysis of lncRNA H19 and miRNA let7a expression for TC

表2lncRNAH19和miRNAlet7a表達水平與甲狀腺癌不同臨床病理特征的相關性

Table2AssociationoflncRNAH19andmiRNAlet7aexpressionwithdifferentclinicopathologicalfeaturesofTC

臨床病理特征總數(shù)lncRNAH19高表達(n=95)低表達(n=36)χ2PmiRNAlet7a高表達(n=40)低表達(n=91)χ2P性別2531011201240725 男4335(8140)8(1860)14(3256)29(6744) 女8860(6818)28(3182)26(2955)62(7045)年齡0137071100120912 <45歲5843(7414)15(2586)18(3103)40(6897) ≥45歲7352(7123)21(2877)22(3014)51(6986)腫瘤直徑8915000480530005 <10cm4425(5682)19(4318)21(4773)23(5227) ≥10cm8770(8046)17(1954)19(2184)68(7816)組織病理分型3644016204350805 乳頭狀癌7860(7692)18(2308)25(3205)53(6795) 濾泡狀癌2917(5862)12(4138) 9(3103)20(6897) 髓樣癌2418(7500)6(2500)6(500)18(7500)包膜浸潤2202013812970255 有5234(6538)18(3462)14(2692)38(7308) 無7961(7722)18(2278)26(3291)53(6709)TNM分期5771001625300<0001 Ⅰ+Ⅱ5131(6078)20(3922)29(5686)22(4314) Ⅲ+Ⅳ8064(8000)16(2000)11(1375)69(8625)淋巴結轉移5461001916130<0001 有6956(8116)13(1884)10(1449)59(8551) 無6239(6290)23(3710)30(4839)32(5161)

圖3 Kaplan-Meier曲線分析lncRNA H19和miRNA let7a表達與TC生存率的關系Figure 3 Kaplan-Meier curve analysis of the relationship between lncRNA H19, miRNA let7a expression and TC survival rate

2.6 單因素分析影響甲狀腺癌預后因素

預后相關單因素分析采用Log-rank檢驗,結果顯示腫瘤直徑≥1.0 cm,高的TNM分期和有淋巴結轉移時,平均生存率降低(P<0.05)?？傮w生存率(overall survival rate,OS)與性別、年齡、組織病理分型、有無包膜浸潤等臨床病理特征無明顯相關性(P>0.05,見表3)。

表3單因素分析影響甲狀腺癌預后因素

Table3UnivariateanalysisofprognosticfactorsforTCpatients

影響因素n總體生存期(月)χ2P 性別02610609 男435019±232 女885060±172 年齡05040478 <45歲585302±178 ≥45歲734840±201 腫瘤直徑353250001 <10cm446000±000 ≥10cm874339±192 組織病理分型40280133 乳頭狀癌785237±169 濾泡狀癌294993±308 髓樣癌244514±350 包膜浸潤00860769 有525056±178 無795038±222 TNM分期55670018 Ⅰ+Ⅱ515430±189 Ⅲ+Ⅳ804624±192 淋巴結轉移333860001 有694201±217 無625791±093

2.7 多因素分析影響甲狀腺癌預后因素

COX回歸模型結果提示,miRNA let7a和lnc RNA H19表達,腫瘤直徑,TNM分期和淋巴結轉移是影響甲狀腺癌預后的獨立風險因素(P<0.05)。年齡、性別、組織病理分型、有無包膜浸潤與甲狀腺癌預后無明顯相關性(P>0.05,見表4)。

3 討論

首先,從分子水平研究控制腫瘤生長、侵襲和轉移機制對腫瘤發(fā)生和治療至關重要。H19基因位于人染色體11p15,可轉錄成大小約2.3 kb的長鏈非編碼RNA,即lncRNA H19參與基因表達的調控過程[9],轉錄的H19保守印記基因簇也轉錄編碼胰島素樣生長因子2(IGF2),H19-IGF2基因對胚胎發(fā)育和生長控制有重要的作用,H19抑制胚胎胎盤生長,在胚胎發(fā)育過程中調節(jié)印記基因。然而它在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的角色,是致癌基因還是抑癌基因,依賴于腫瘤分型和細胞內成分[10]。有證據(jù)顯示lncRNA H19在不同惡性腫瘤多種病理狀態(tài)下呈現(xiàn)高表達[11],其表達上調提示了它可能的致癌屬性[12]。比如Wang等[13]發(fā)現(xiàn)了lncRNA H19在膽囊癌組織中高表達,并揭示了lncRNA H19表達與腫瘤尺寸及淋巴結轉移相關,Liu等[14]證實體外實驗中H19能夠促進膀胱癌細胞增殖,lncRNA H19在膀胱癌組織中表達高于其旁非腫瘤組織。還有研究證實了lncRNA H19在胃癌組織有高表達率,且與TNM分期和淋巴結轉移都是影響胃癌預后的獨立危險因素[15]。盡管lncRNA H19已被證實參與多種腫瘤發(fā)生[16],但它在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色鮮有報道。本研究結果顯示lncRNA H19在甲狀腺癌組織中表達較高,且高表達者5年生存率降低,提示lncRNA H19在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中有重要作用,表達水平影響甲狀腺癌預后,有可能作為抗腫瘤治療的潛在新靶點。

表4多因素分析影響甲狀腺癌預后因素

Table4MultivariateanalysisofprognosticforTCpatients

影響因素BSEWaldSig．Exp(B)95%CI 年齡-006402850050082209380537-1639 性別-007603070061080409270508-1691 腫瘤直徑18590431185710001?6414 2755-14937 組織病理分型-017201730988032008420601-1181 包膜浸潤-012302850188066508840506-1544 TNM分期-0795036747050030?04510220-0926 淋巴結轉移1455038414360001?42842019-9092 lncRNAH19表達-0818029477620005?04410248-0785 miRNAlet7a表達-0796039340960043?04510209-0975

*P<0.05

其次,本研究對組織中miRNA let7a和lncRNA H19水平進行檢測,發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在甲狀腺癌組織中升高,而miRNA let7a反而降低,說明兩者之間具有一定關聯(lián)性,lncRNA H19可能對miRNA let7a具有調控作用[17]。已經(jīng)確定lncRNA不僅能夠行使miRNA的功能,對下游基因進行調控,還能夠對miRNA產(chǎn)生調控作用[18]。本研究通過進一步與甲狀腺癌臨床病理特征相關性及預后相關因素進行分析,發(fā)現(xiàn)二者均與臨床分期相關聯(lián),lncRNA H19隨腫瘤的進展程度表達隨之升高,而miRNA let7a則隨之下降。且lncH19表達上調者或者let7a表達下調者,5年生存率減低,說明二者對腫瘤的進展存在一定作用。miRNA let7a被認為與抑癌基因有關,有很多目的基因,比如RAS和HMGA2,它還能通過靶向分子Aurora-B抑制子宮內膜癌細胞生長[19]。目前,研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19可以抑制let7a內源性功能,導致高遷移率組AT-hook2的消沉,AT-hook2在胰腺導管腺癌中能夠介導上皮細胞-間充質細胞轉換過程(epithelial mesenchymal transition,EMT),導致腫瘤轉移[20]。本研究結果也顯示出lncRNA H19的高表達降低了let7a的抑癌作用,二者呈負向調控,盡管二者具體調控機制尚不清楚,我們可以得出結論,miRNA let7a和lncRNA H19能夠進行篩選實驗作為良好標志物的候選,對甲狀腺癌早期診斷及預后判斷有提示功能[21]。而對其基因調控機制的研究有助于分子治療。

綜上所述,結果表明miRNA let7a和lncRNA H19可能在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,是影響甲狀腺癌預后的獨立危險因素。但由于受樣本量限制,其與甲狀腺癌患者的臨床病理特征的相關性尚不明確,因此,對未來進一步研究的期望,尚需要擴大樣本量進一步研究論證,細化腫瘤分期,繼續(xù)深入討論關于甲狀腺癌不同臨床病理特征的相關性的實驗。并對miRNA let7a和lncRNA H19調控機制及二者表達情況做更進一步遠期生存率的觀察,期望發(fā)現(xiàn)一種新的甲狀腺癌早期診斷和預后判斷的方法。

參考文獻：

[1] La VC, Malvezzi M, Bosetti C,etal. Thyroid cancer mortality and incidence: a global overview[J]. Int J Cancer, 2015, 136(9):2187-2195.

[2] Deirdre K, Catherine MK. Clinical overview of thyroid cancer and recent advances in treatment[J]. J Oncol Med Pract,2016,1(2):1-6.

[3] Schwaiger M, Scheidhauer K, Bamberg M. Multidisciplinary overview of the diagnosis and treatment of thyroid cancer[J]. Der Onkologe,2015, 21(7):574-576.

[4] Penha RCC, Lima SCS, Pinto LFR,etal. Radiation-induced senescence and thyroid cancer: a barrier or a driving force[J]. PAJAR,2015, 3(1):29-35.

[5] Reddi H, Kumar A, Kulstad R. Anaplastic thyroid cancer — an overview of genetic variations and treatment modalities[J]. Adv Genet, 2015, 5:43-52.

[6] Liz J, Esteller M. LncRNAs and microRNAs with a role in can-cer development[J]. Biochimica Et Biophysica Acta,2016, 1859(1):169-177.

[7] Xin Y, Zheng L. The role of microRNAs expression in laryngeal cancer[J]. Oncotarget, 2015, 6(27):23297-23305.

[8] Kim M, Kim WG, Oh HS,etal. Comparison of the seventh and eighth editions of the American Joint Committee on Cancer/Union for international cancer control Tumor-Node-Metastasis Staging System for differentiated thyroid cancer[J]. Thyroid, 2017, 27(9):1149-1155.

[9] Matouk IJ, Halle D, Gilon M,etal. The non-coding RNAs of the H19-IGF2 imprinted loci: a focus on biological roles and therapeutic potential in Lung Cancer[J]. J Transl Med,2015, 13(1):113-125.

[10] Looijenga LH, Verkerk AJ, De G N,etal. H19 in normal development and neoplasia[J]. Mol Reprod Dev,2015,46(3):419-439.

[11] Raveh E, Matouk IJ, Gilon M,etal. The H19 long non-coding RNA in cancer initiation, progression and metastasis-a proposed unifying theory[J]. Mol Cancer,2015, 14(1):184-198.

[12] 趙艷華,張新麗,張文玲.長鏈非編碼RNA在肺癌中的功能及機制研究[J].中國腫瘤臨床,2013,40(23):1473-1476.

[13] Wang SH, Wu XC, Zhang MD,etal. Long noncoding RNA H19 contributes to gallbladder cancer cell proliferation by modulated miR-194-5p targeting AKT2[J].Tumor Biol,2016, 37(7):1-10.

[14] Liu C, Chen Z, Fang J,etal. H19-derived miR-675 contributes to bladder cancer cell proliferation by regulating p53 activation[J]. Tumor Biol,2016, 37(1):263-270.

[15] Zhou X, Yin C, Dang Y,etal. Identification of the long non-coding RNA H19 in plasma as a novel biomarker for diagnosis of gastric cancer[J]. Sci Rep, 2015, 5(1):1-10.

[16] 魏晨晨,王朝霞.長鏈非編碼RNA H19在腫瘤研究中的進展[J].臨床腫瘤學雜志,2015,20(11):1041-1044.

[17] 蔚洪恩,王春芳,張傳森.內含子microRNA和基因調控[J].山西醫(yī)科大學學報,2010,41(8):745-747.

[18] Cai X, Cullen BR. The imprinted H19 noncoding RNA is a primary microRNA precursor[J]. RNA, 2007, 13(3):1-4.

[19] Mross K,Richly H,Frost A,etal.A phase I study of BI 811283, an Aurora B kinase inhibitor, in patients with advanced solid tumors[J]. Cancer Chemoth Pharm,2016,(2):1-13.

[20] Ma C, Nong K, Zhu H,etal. H19 promotes pancreatic cancer metastasis by derepressing let-7’s suppression on its target HMGA2-mediated EMT[J]. Tumour Biol, 2014, 35(9):9163-9169.

[21] 戴維德,馬娜,王川予,等.超聲引導細針穿刺標本BRAF V600E及CyclinD1聯(lián)合檢測對于甲狀腺癌患者頸部淋巴結轉移的預測價值[J].山西醫(yī)科大學學報,2017,48(6):589-592.