張?jiān)l(fā) 蓋春蕾 葉海斌

摘要 [目的]研究大黃對仿刺參非特異性免疫的影響。[方法]通過在餌料中添加2%、5%和10%不同比例的大黃粉來投喂仿刺參，分析其體腔液中溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）、堿性磷酸酶（AKP）及酸性磷酸酶（ACP）的酶活變化情況。[結(jié)果]LSZ活性在第21天時(shí)，3個(gè)劑量組分別較空白組提高了92.86%、96.43%和90.10%，酶活達(dá)到最高；SOD活性在第7天時(shí)，3個(gè)劑量組分別較空白組提高了4.36%、8.87%和9.28%；AKP活性，2%和5%劑量組均低于空白組，10%劑量組在第21天時(shí)達(dá)到最高值，其酶活與空白組差異極顯著（P<0.01）；2%和5%劑量組分別在第21、28天時(shí)ACP酶活達(dá)到最高，但與空白組間的差異不顯著（P>0.05），10%劑量組在第14天時(shí)酶活達(dá)到最高，與空白組間的差異極顯著（P<0.01），大黃對ACP活性的影響與添加劑量不呈正相關(guān)。[結(jié)論]拌餌投喂不同劑量的大黃對仿刺參體腔液中4種酶的影響不同：10%劑量組提高酶活的時(shí)間要早于2%和5%劑量組，因此建議拌餌投喂2%和5%大黃的飼料21 d或10%大黃的飼料14 d，可提高仿刺參的非特異性免疫，但持續(xù)投喂時(shí)間不宜過長，停止投喂14 d左右各免疫指標(biāo)可恢復(fù)至平常水平。

關(guān)鍵詞 大黃；仿刺參；溶菌酶；超氧化物歧化酶；堿性磷酸酶；酸性磷酸酶

中圖分類號(hào) S963.73 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）23-0057-04

Abstract [Objective]Effects of rhubarb on nonspecific immunity of Apostichopus japonicas were studied.[Method]By the addition of 2%，5% and 10% in different proportions to rhubarb feeding A. japonicas，the lysozyme （LSZ），superoxide dismutase （SOD），alkaline phosphatase （AKP） and acid phosphatase （ACP） enzyme activity in coelomic fluid of A. japonicas were analyzed.[Result]At day 21，LSZ activity was highest，increased by 92.86%，96.43% and 90.10% in the three dose groups，respectively，compared with the blank group.At day 7，SOD activity increased by 4.36%，8.87% and 9.28% in the three dose groups，respectively，compared with the blank group.AKP activity was lower in the 2% and 5% dose groups than in the blank group，and the 10% dose group reached the maximum value on day 21. Significant difference in enzyme activity between the dose group and the blank group （P<0.01）.ACP activity was the highest in the 2% and 5% dose groups at day 21 and 28，respectively，but the difference between them and the blank group was not significant （P>0.05）.10% dose group had the highest enzyme activity on day 14，and the difference between the 10% dose group and the blank group was significant （P<0.01）.The effect of rhubarb on ACP activity was not positively correlated with the added dose. [Conclusion]Different doses of rhubarb mixed with bait have different effects on 4 kinds of enzymes in cavity fluid of A. japonicas.The 10% dose group increased enzyme activity earlier than the 2% and 5% dose groups.Therefore，it is recommended to feed 2% and 5% rhubarb with baits for 21 days or 10% rhubarb for 14 days，which can improve the nonspecific immunity of A. japonicas.However，the duration of continuous feeding should not be too long，stop feeding 14 days，all immune indexes can be restored to normal level.

Key words Rhubarb；Apostichopus japonicas；Lysozyme；Superoxide dismutase；Alkaline phosphatase；Acid phosphatase

大黃是一種具有多種免疫作用的藥用植物。胥楠等[1]通過對比小鼠灌胃生理鹽水和大黃煎劑后腸道內(nèi)的IgA、總蛋白、補(bǔ)體C3、高密度脂蛋白（HDL）以及Ⅱ型磷脂酶A2活性和溶菌酶的含量，發(fā)現(xiàn)大黃能促進(jìn)腸黏膜上皮分泌多種免疫相關(guān)物質(zhì)。孫麗霞等[2]研究也表明大黃煎劑對小鼠特異性及非特異性免疫均有促進(jìn)作用。目前，大黃及大黃制劑已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中。陳孝煊等[3]曾報(bào)道，投喂含1%大黃水提取物的飼料可以明顯提高異育銀鯽血清和體表黏液溶菌酶的活性，且體表黏液溶菌酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血清中的溶菌酶活性；蘇永騰等[4]添加4種不同劑量的大黃蒽醌提取物，拌餌投喂羅氏沼蝦發(fā)現(xiàn)其可有效提高羅氏沼蝦機(jī)體免疫力，降低其對病原菌敏感性，提高羅氏沼蝦抗病力；李素瑩等[5]和王蕓等[6]以凡納濱對蝦為研究對象，分別將大黃粉和大黃水提取物添加到飼料中，結(jié)果表明二者均可顯著提高凡納濱對蝦的免疫力。但大黃如何影響仿刺參的免疫系統(tǒng)鮮見報(bào)道。筆者通過拌餌投喂不同劑量的大黃粉，研究其對仿刺參體腔液中的溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）、堿性磷酸酶（AKP）以及酸性磷酸酶（ACP）活性的影響，探討大黃對仿刺參非特異性免疫的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器。Anke TGL-16C離心機(jī)；DS-300電子天平；海爾BCD-206TD -20 ℃冰箱；水浴鍋；751型分光光度計(jì)；Backman DU640紫外可見分光光度計(jì)等。

1.1.2 試劑。大黃于粉碎機(jī)中粉碎后拌餌投喂（顆粒大小為100目左右），經(jīng)測定大黃粉中大黃酸含量為3.67 mg/g；酶活測定試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所；化學(xué)分析純冰乙酸等。

1.2 藥餌配制及分組

將仿刺參隨機(jī)分為3個(gè)劑量組和1個(gè)空白對照組。3個(gè)劑量組，即分別在空白飼料中添加2%、5%、10%的大黃粉；空白對照組，投喂比例為1∶1的鼠尾藻和海泥。每組設(shè)4個(gè)平行，每組8頭仿刺參，每2頭仿刺參的體腔液合為1個(gè)樣品。

1.3 材料及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用健康仿刺參（Apostichopus japonicus）購買于山東青島即墨某仿刺參養(yǎng)殖場，平均體重（38.9±4.3） g，試驗(yàn)期間飼養(yǎng)于即墨鰲山衛(wèi)試驗(yàn)基地，將4組仿刺參分別飼養(yǎng)于4個(gè)35 L的PVC桶中，試驗(yàn)前暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)期間全部投喂空白飼料，之后投喂含大黃粉的相應(yīng)藥餌。養(yǎng)殖期間，水溫（13.0±0.5）℃，pH7.8±0.1，鹽度31±1，每天投餌時(shí)間16：00，投餌量約為5%仿刺參總體重，次日09：00換水，換水時(shí)將全部海水換掉并清理殘餌糞便，24 h不間斷連續(xù)充氧，養(yǎng)殖時(shí)間為42 d。

1.4 仿刺參體腔液的采集

在試驗(yàn)開始后，各組按相應(yīng)劑量投喂28 d，之后全部投喂空白飼料14 d，于第7、14、21、28、42天自仿刺參的右側(cè)口后1/3處，使用1 mL的無菌注射器穿刺抽取體腔液0.25 mL，將每2頭仿刺參的體腔液合為1個(gè)樣品，離心分離其上清液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫相關(guān)酶活性測定

1.5.1 溶菌酶（LSZ）活性測定。溶菌酶活性采用試劑盒中的空白對照法測定。取0.2 mL仿刺參體腔液，加入2 mL應(yīng)用菌液混勻，置于37 ℃的水浴鍋中水浴15 min，立即取出置于0 ℃冰水浴中3 min，逐管取出倒入1 cm光徑比色皿中，利用751型分光光度計(jì)，在530 nm處以蒸餾水調(diào)節(jié)透光度100%，比色測定樣品的透光度值。另取0.2 mL蒸餾水和200 U/mL（即2.5 μg/mL）的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液按上述方法處理，得到空白透光度值和標(biāo)準(zhǔn)透光度值。計(jì)算公式如下：

溶菌酶活性（U/mL）=（樣品透光度值-空白透光度值）/（標(biāo)準(zhǔn)透光度值-空白透光度值）×200。

1.5.2

超氧化物歧化酶（SOD）、堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性的測定。SOD、AKP和ACP活性均按照試劑盒中方法測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS13.0軟件，對測得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA），試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式表示，當(dāng)P<0.05時(shí)表示數(shù)據(jù)間差異顯著。利用Sigmaplot 10.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃對仿刺參體腔液中溶菌酶（LSZ）活性的影響

由圖1可知，各劑量組中酶活性均呈現(xiàn)隨用藥時(shí)間推移先升高后降低的趨勢。在第21天前，2%劑量組和5%劑量組中酶活性均小于空白組，且2%劑量組在第14天時(shí)與空白組酶活性差異顯著（P<0.05），5%劑量組在第14天時(shí)酶活性與空白組酶活性差異顯著（P<0.05）；10%劑量組酶活性始終高于空白組，在第7天時(shí)酶活性較空白組提高了1倍。在第21天時(shí)，酶活性達(dá)到最高，各劑量組相對于空白組酶活性分別提高了92.86%、96.43%和90.10%，但此時(shí)劑量組與空白組之間差異不顯著（P>0.05），這可能與仿刺參存在個(gè)體間差異有關(guān)。隨著時(shí)間的推移（t>第21天），各劑量組與空白組酶活性之間的差距越來越小，在停止投喂藥餌14 d（即第42天）時(shí)，劑量組酶活性接近且略高于空白組。

2.2 大黃對仿刺參體腔液中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由圖2可知，2%劑量組和5%劑量組中酶活性呈現(xiàn)隨用藥時(shí)間增加先升高后降低的趨勢，在第21天達(dá)到最大值，10%劑量組酶活呈降低趨勢。酶活性在第7天時(shí)，3個(gè)劑量組分別較空白組提高了4.36%、8.87%和9.28%；連續(xù)給藥28 d，第28天時(shí)各劑量組酶活開始低于空白組，且差異性顯著（P<0.05），停止投喂藥餌14 d（即第42天）時(shí)，酶活又恢復(fù)到與空白組接近的水平。

2.3 大黃對仿刺參體腔液中堿性磷酸酶（AKP）活性的影響

由圖3可知，給藥期間，2%劑量組在第21天時(shí)酶活達(dá)到最高值，但始終低于空白組；5%劑量組在第28天時(shí)酶活達(dá)到最高值，此時(shí)酶活接近空白組，為空白組酶活的97.22%；10%劑量組在第21天時(shí)酶活達(dá)到最高值，為空白組酶活的6.99倍，與空白組間的差異極顯著（P<0.01）。停止投喂藥餌14 d（即第42天）時(shí)，各劑量組的酶活接近空白組。

2.4 大黃對仿刺參體腔液中酸性磷酸酶（ACP）活性的影響

由圖4可知，大黃對酶活的影響與劑量不呈正相關(guān)，2%和5%劑量組分別在第21、28天達(dá)到最高，但與空白組間的差異不顯著；10%劑量組在第14天時(shí)酶活達(dá)到最高，為空白組酶活的8.61倍（P<0.01）。停止投喂藥餌14 d（即第42天）時(shí)，各劑量組的酶活接近空白組。

3 討論

3.1 溶菌酶（LSZ）活性 LSZ廣泛存在于動(dòng)植物體的各種組織、血液和分泌物中，是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是生物體內(nèi)重要的非特異性免疫因子之一。LSZ在海洋無脊椎動(dòng)物中具有防御病害的作用[7]。此外，Jollès等[8]報(bào)道LSZ對一些海洋細(xì)菌還具有消化、濾食的作用。試驗(yàn)中2%和5%大黃劑量組LSZ酶活在第21天達(dá)到最高，10%劑量組在第7天比空白組酶活高了1倍，大黃能夠提高仿刺參體腔液中LSZ的活性，這與近年來大黃對LSZ活性影響的報(bào)道相似。蔡中華等[9]報(bào)道鯉魚攝食含有大黃提取液的飼料后各組織中的溶菌物質(zhì)增多，吞噬率、吞噬指數(shù)明顯提高；王蕓等[6]報(bào)道大黃提取物能夠提高凡納濱對蝦LSZ活性，大黃也能增強(qiáng)克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）和紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）血細(xì)胞的吞噬活性[3]。試驗(yàn)結(jié)果中，相對于空白組酶活，10%劑量組達(dá)到最強(qiáng)酶活的時(shí)間早于2%和5%劑量組。2%和5%劑量組的LSZ酶活在第7、14天時(shí)低于空白組，之后高于空白組。造成這種現(xiàn)象的原因可能是以下兩點(diǎn)：第一，大黃對副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、嗜水氣單胞菌等水中常見菌具有較強(qiáng)的抑菌效果[10-11]，該試驗(yàn)采用的是大黃混合鼠尾藻粉和海泥的拌餌投喂方式，投喂后一部分大黃溶于水中，相對于空白組，2%和5%劑量組的海水中致病菌的量較少，減少了環(huán)境中引起仿刺參免疫應(yīng)答的刺激。第二，仿刺參前腸中大量的微生物來源于食物中的藻類碎屑，在前腸中見到的大量弧菌和假單胞菌也是海藻和海泥中常見的類群[12]。大黃能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，增加腸道對細(xì)菌和毒素的排除作用[1]，減少了其自身體內(nèi)免疫的刺激物，但其劑量還達(dá)不到10%劑量組作為外源物刺激仿刺參立即引起免疫反應(yīng)，但隨著時(shí)間的延長，大黃對仿刺參持續(xù)的刺激會(huì)引起仿刺參的免疫反應(yīng)，從而使得后期酶活高于空白組。

3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性

SOD是生物體各組織中重要的抗氧化酶。Regoli等[13]認(rèn)為物種對環(huán)境突變的適應(yīng)能力還取決于它產(chǎn)生的抗氧化物能力。各劑量組第28天時(shí)的酶活均低于空白組，差異顯著（P<0.05）。其原因可能是以下兩點(diǎn)：第一，陳忻等[14]認(rèn)為大黃具有清除超氧自由基的作用，起到抗自由基損傷的功效。該試驗(yàn)中大黃能減少仿刺參體內(nèi)自由基的含量，發(fā)揮抗氧化作用，導(dǎo)致誘導(dǎo)性酶SOD活性降低。第二，長時(shí)間投喂大黃，產(chǎn)生了“免疫疲勞”。Ai等[15]和Scholz等[16]的研究顯示長期投喂β-葡聚糖不僅不能提高動(dòng)物的生長性能，而且會(huì)使飼養(yǎng)動(dòng)物出現(xiàn)免疫抑制現(xiàn)象，這與中醫(yī)所說的“久服大黃則苦寒傷脾，脾虛則免疫功能低下”一致[17]。該研究結(jié)果顯示，停止喂藥14 d后各劑量組仿刺參的SOD活性恢復(fù)到正常狀態(tài)。

3.3 堿性磷酸酶（AKP）活性

AKP是生物體內(nèi)的一種重要的代謝調(diào)控酶[18]，它對底物的專一性要求較低，是一種重要的解毒系統(tǒng)，并與一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)[19]。2%和5%劑量組的大黃對仿刺參的AKP具有抑制作用，其原因可能類似于第7、14天大黃對溶菌酶的抑制作用。在第21天時(shí)10%劑量組的大黃作為外源刺激物對仿刺參的AKP具有強(qiáng)烈的免疫提高作用，為空白組酶活的6.99倍，與空白組間的差異極顯著（P<0.01）。在養(yǎng)殖的前21 d，仿刺參體腔液中的AKP活性隨著大黃添加量的增多也相應(yīng)提高，這與聶月美[20]研究維生素C的添加量與中華鱉血漿中AKP活性的影響關(guān)系類似。

3.4 酸性磷酸酶（ACP）活性

ACP是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，起到預(yù)防感染，加快對異物的識(shí)別、吞噬和清除速度的作用[21]。ACP可以被外源刺激物激活[22]，柯浩等[23]報(bào)道大黃占最大比例的復(fù)方中草藥能夠維持雜色鮑血淋巴較高的ACP水平。該試驗(yàn)中3個(gè)劑量組的最高酶活分別為空白組的3.55倍、3.79倍和8.61倍，表明大黃可以提高仿刺參體腔液中ACP活性。

4 結(jié)論

拌餌投喂不同劑量的大黃對仿刺參體腔液中4種酶的影響不同：2%和5%劑量組的大黃對LSZ前14 d具有抑制作用，對AKP具有抑制作用，其原因可能是大黃減少了引起仿刺參免疫指標(biāo)上升的刺激物，10%能提高LSZ和AKP酶活。各劑量組的大黃都能提高SOD、ACP活性，但長時(shí)間的投喂會(huì)抑制SOD酶活。綜合來看，10%劑量組提高酶活的時(shí)間要早于2%和5%劑量組，因此建議拌餌投喂2%和5%大黃的飼料21 d或10%大黃的飼料14 d，可提高仿刺參的非特異性免疫，但持續(xù)投喂時(shí)間不宜過長，停止投喂14 d左右各免疫指標(biāo)可恢復(fù)至平常水平。

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