趙燦，吳永全

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 心臟中心，北京 100050）

我國(guó)成人糖尿病的患病率高達(dá)9.7%[1]，糖尿病是心房顫動(dòng)（以下簡(jiǎn)稱房顫）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2-3]。房顫可促使心臟電生理及結(jié)構(gòu)改變[4]。糖尿病與房顫高度相關(guān)[5-7]，但其致房顫的機(jī)制還不清楚。糖尿病可以導(dǎo)致心肌收縮功能異常[8-9]，這與鈣信號(hào)異常相關(guān)[10]。房顫也與鈣信號(hào)密切相關(guān)[11]。氧化應(yīng)激是兩者機(jī)制聯(lián)系的一個(gè)切合點(diǎn)，心臟鈣通道雷諾定受體（ryanodine receptor，RYR）是氧化應(yīng)激的靶點(diǎn)，因此糖尿病高血糖可能通過(guò)氧化應(yīng)激影響鈣信號(hào)[12]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究高糖對(duì)鈣信號(hào)的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠，1～3日齡，體重（5.75±0.33）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2 主要試劑

熒光染料fluo-4（中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所），L-Glucose、胰酶、Ⅰ型膠原酶、尿酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，α-actin一抗（美國(guó)Santa公司），α-actin二抗（杭州華安生物公司），BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），RYR2一抗（美國(guó)Millipore公司），RYR2二抗（英國(guó)Abcam公司），F(xiàn)KBP12.6一抗（美國(guó)Proteintech Group公司），β-actin（美國(guó)Epitomics公司），4%多聚甲醛（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，取出1～3日齡SD大鼠心房組織，用PBS清洗該組織塊2次，然后將組織剪成約1mm×1mm×1mm大??；加入4 ml酶消化液（0.1%胰酶和0.1%Ⅰ型膠原酶），混懸10 s，37℃條件下消化10min，用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后放置于4℃環(huán)境中。剩下的組織再加入3～4 ml酶消化液，混懸10 s，37℃條件下消化10min，按上述方法收集上清并終止消化后放置于4℃條件下，重復(fù)該步驟2、3次，直至組織完全被消化。用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1 200 r/min離心10min，棄上清，用含10% FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)基混懸沉淀細(xì)胞，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱，差速貼壁1 h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

1.4.1 第1部分實(shí)驗(yàn)分為4組：左旋葡萄糖（L-glucose，LG）組（5.5 mol右旋葡萄糖+17.5 mol左旋葡萄糖）、正常葡萄糖（normal glucose，NG）組（5.5 mol右旋葡萄糖）、高葡萄糖組（high glucose，HG）組（23.0 mol右旋葡萄糖）、HG+ 尿酸組（100μmol尿酸）。

1.4.2 第2部實(shí)驗(yàn)分為3組：①過(guò)氧化亞硝基陰離子（ONOO-）組：5.5 mol右旋葡萄糖孵育48 h后，給予5μmol ONOO-刺激6 h；②分解后的過(guò)氧化亞硝基陰離子（DC-ONOO-）組：5.5 mol右旋葡萄糖孵育48 h后，給予5μmol DC-ONOO-刺激6 h；③ONOO-+尿酸組：5.5 mol 右旋葡萄糖孵育48 h后，予以100μmol尿酸預(yù)處理6 h，再給予5μmol ONOO-刺激6 h。

1.5 大鼠心房肌細(xì)胞的培養(yǎng)

待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，在室溫下用4%多聚甲醛固定細(xì)胞。用PBS沖洗細(xì)胞，在4℃條件下，用0.1%Triton X-100透膜15min，洗滌細(xì)胞，4% BSA封閉細(xì)胞30min。加入按比例稀釋的α-actin一抗，在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜。洗滌細(xì)胞加入α-actin二抗，37℃條件下放置1 h。再次洗滌細(xì)胞后在倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察圖像。

1.6 鈣瞬變的測(cè)定

將心肌單細(xì)胞與10μmol/L鈣熒光指示劑Fluo-4 AM（上海賽默飛世爾科技有限公司）共同孵育，細(xì)胞外液灌流。將孵育好的心肌細(xì)胞置入LSM-Pascal型激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）的載物臺(tái)上，用溫育好的細(xì)胞外液覆蓋，在鏡下進(jìn)行觀察。調(diào)節(jié)激光共聚焦顯微鏡為線掃描的成像方式，觀察鈣瞬變，通過(guò)MATLAB 7.0軟件分析，得出鈣瞬變的特征。

1.7 Western blot檢測(cè)

Western blot檢測(cè)大鼠心房肌細(xì)胞RYR2、FKBP12.6。將提取的心房肌蛋白用BCA蛋白定量試劑盒定量，取45μl蛋白上樣到10% SDS-PAGE凝膠電泳。將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉+TBST在搖床上封閉1 h，加入相應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜，洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜后加入ECL試劑、曝光、顯影、定影、沖洗膠片及對(duì)膠片進(jìn)行掃描分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心房肌細(xì)胞的鑒定

大鼠心房肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，倒置相差顯微鏡下單個(gè)心房肌細(xì)胞呈扁平形、梭形、桿狀，某些細(xì)胞在貼壁后形成三角形，頂部突出，在部分視野中可觀察到自發(fā)性搏動(dòng)的細(xì)胞，采用免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，確定為大鼠心房肌細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

與陰性對(duì)照（見(jiàn)圖1A）相比，加入α-actin 蛋白的大鼠心房肌細(xì)胞在胞膜和胞漿中均呈綠色熒光（見(jiàn)圖1B），即α-actin檢測(cè)呈陽(yáng)性。

圖1 大鼠心房肌細(xì)胞 （×200）

2.2 各組鈣瞬變頻率和幅度比較

2.2.1 第1部分本實(shí)驗(yàn)觀察高糖及氧化應(yīng)激對(duì)大鼠心房肌細(xì)胞鈣瞬變幅度和頻率的影響，結(jié)果顯示，各組鈣瞬變頻率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組鈣瞬變幅度比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，HG組的鈣瞬變幅度與NG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.011，P=0.000），HG組高于NG組；HG+尿酸組鈣瞬變幅度為與HG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.380，P=0.001），HG+尿酸組低于HG組。見(jiàn)表1。

2.2.2 第2部分各組鈣瞬變頻率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組鈣瞬變幅度比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，DC-ONOO-組鈣瞬變幅度與ONOO-組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.808，P=0.005），氧化應(yīng)激刺激因子ONOO-可促進(jìn)鈣的釋放；ONOO-+尿酸組鈣瞬變幅度與ONOO-比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.309，P=0.001），氧化應(yīng)激抑制因子尿酸可以減弱ONOO-對(duì)鈣釋放的促進(jìn)作用。見(jiàn)表2。

2.3 各組RYR2和FKBP12.6蛋白表達(dá)水平比較

2.3.1 第1部分LG組、NG組、HG組、HG+尿酸組的RYR2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（1.047±0.978）、（0.940±0.016）、（0.564±0.620） 和（0.983±0.132），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.278，P=0.001）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，HG組RYR2蛋白相對(duì)表達(dá)量與NG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.169，P=0.001），HG組較NG組下降；LG組與NG組RYR2蛋白蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.870，P=0.175）；HG+尿酸組RYR2蛋白相對(duì)表達(dá)量與HG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.976，P=0.008），HG+尿酸組較HG組升高（見(jiàn)圖2、3）。LG組、NG組、HG組、HG+尿酸組的FKBP12.6蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.593±0.007）、（0.614±0.014）、（0.438±0.135） 和（0.804±0.507），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.813，P=0.002）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，HG組FKBP12.6蛋白相對(duì)表達(dá)量與NG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.950，P=0.031），HG組較NG組下降；LG組與NG組FKBP12.6蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.255，P=0.087）；HG+尿酸組FKBP12.6蛋白相對(duì)表達(dá)量與HG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.349，P=0.012），HG+尿酸組較HG組升高（見(jiàn)圖2、4）。

表1 第1部分鈣瞬變頻率和幅度比較 （±s）

表1 第1部分鈣瞬變頻率和幅度比較 （±s）

注：1）NG組與比較，P＜0.05；2）與HG組比較，P＜0.05

組別 細(xì)胞數(shù) 頻率 幅度LG 組 29 7.72±5.08 2.21±0.45 NG組 31 7.48±4.82 2.12±0.50 HG 組 29 8.10±6.02 2.66±0.601）HG+尿酸組 38 7.50±3.96 2.22±0.532)F值 0.158 6.400 P值 0.854 0.000

表2 第2部分鈣瞬變頻率和幅度比較 （±s）

表2 第2部分鈣瞬變頻率和幅度比較 （±s）

注：?與ONOO-組比較，P＜0.05

組別 細(xì)胞數(shù) 頻率 幅度ONOO-組 36 5.47±3.54 4.29±1.46 ONOO-+ 尿酸組 33 3.94±2.96 3.28±1.28?DC-ONOO-組 33 4.36±2.75 3.43±0.98?F值 2.120 6.932 P值 0.125 0.002

2.3.2 第2部分ONOO-組、DC-ONOO-組、ONOO-+尿酸組的RYR2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.423±0.051）、（0.673±0.042） 和（0.667±0.214），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=70.841，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，ONOO-組RYR2蛋白相對(duì)表達(dá)量與DC-ONOO-組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.586，P=0.003），DC-ONOO-組較ONOO-組升高；ONOO-+尿酸組RYR2蛋白相對(duì)表達(dá)量與ONOO-組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.082，P=0.000），ONOO-+尿酸組較ONOO-組升高（見(jiàn)圖5、6）。ONOO-組、DC-ONOO-組、ONOO-+尿酸組的FKBP12.6蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.230±0.217）、（0.849±0.051）和（0.857±0.050），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=165.062，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，ONOO-組FKBP12.6蛋白相對(duì)表達(dá)量與DC-ONOO-組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.308，P=0.000），DC-ONOO-組較ONOO-組升高；ONOO-+尿酸組FKBP12.6蛋白相對(duì)表達(dá)量與ONOO-組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.582，P=0.000），ONOO-+尿酸組較ONOO-組升高（見(jiàn)圖5、7）。

圖2 第1部分各組RYR2和FKBP12.6蛋白的表達(dá)

圖3 第1部分各組RYR2蛋白的表達(dá)水平比較 （±s）

圖4 第1部分各組FKBP12.6蛋白的表達(dá)水平比較 （±s）

圖5 第2部分各組RYR2和FKBP12.6蛋白的表達(dá)

圖6 第2部分各組RYR2蛋白的表達(dá)水平比較 （±s）

圖7 第2部分各組FKBP12.6蛋白的表達(dá)水平比較 （±s）

3 討論

糖尿病與房顫的發(fā)生密切相關(guān)[13]，糖尿病是房顫的高風(fēng)險(xiǎn)因素，與非糖尿病患者相比，糖尿病患者具有更高的房顫患病率，糖尿病病程越長(zhǎng)，血糖控制不良的患者，房顫發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)更大[14]。盡管有很多研究證實(shí)糖尿病與房顫密切相關(guān)，但是糖尿病致房顫的潛在機(jī)制還不清楚，而且既往大多研究是以心室肌細(xì)胞為研究對(duì)象。高血糖及氧化應(yīng)激是糖尿病的兩大特征，值得注意的是細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)異常也是糖尿病病理生理過(guò)程中的一個(gè)重要特征，而且可能與心律失常相關(guān)[15]。

近來(lái)有研究證實(shí)，心房肌細(xì)胞鈣信號(hào)異常是調(diào)控心房顫動(dòng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，鈣信號(hào)甚至可以成為房顫的一個(gè)創(chuàng)新的治療靶點(diǎn)[11]。鈣離子是最簡(jiǎn)單，同時(shí)也是最復(fù)雜的細(xì)胞信使。過(guò)去20多年的研究發(fā)現(xiàn)了鈣信號(hào)的基本單元鈣火花[16]，以及相關(guān)鈣信號(hào)事件，包括鈣波和鈣瞬變。心肌細(xì)胞內(nèi)鈣火花等鈣信號(hào)事件在心律失常的發(fā)生中起重要作用。鈣信號(hào)事件受多種Ca2+通道蛋白―RYR2及其上游調(diào)控因子―FKBP12.6的調(diào)節(jié)。通過(guò)這些鈣調(diào)控蛋白的作用，調(diào)節(jié)鈣通道蛋白的活性和鈣離子的釋放與重吸收[11，17]。

既往的研究已經(jīng)證明，在心室肌細(xì)胞中，糖尿病會(huì)使鈣信號(hào)出現(xiàn)異常，這與肌漿網(wǎng)RYR2及其磷酸化有關(guān)，并進(jìn)一步確認(rèn)RYR2及其調(diào)節(jié)蛋白FKBP12.6在心室肌鈣信號(hào)中的作用，盡管RYR2及其磷酸化可導(dǎo)致鈣釋放增加，但是心室肌細(xì)胞并不意味著心房肌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象，本研究是建立在心房肌細(xì)胞基礎(chǔ)上的。

本實(shí)驗(yàn)給予高糖刺激大鼠心房肌細(xì)胞48 h，HG組鈣釋放增加，HG組RYR2蛋白表達(dá)水平下降，應(yīng)用氧化應(yīng)激抑制因子―尿酸可減少鈣的釋放，而RYR2蛋白的表達(dá)上調(diào)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)RYR2蛋白的測(cè)定證實(shí)高糖刺激下鈣的釋放可能與鈣通道RYR2有關(guān)。而LG組與NG組在蛋白表達(dá)方面無(wú)差異，可以推斷鈣通道的激活是由高糖引起，而非高滲透壓所致，所以高糖可以激活RYR2信號(hào)傳導(dǎo)通路。

持續(xù)的高糖刺激可引起氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激，導(dǎo)致過(guò)量一氧化氮NO和O2-產(chǎn)生，兩者通過(guò)非酶促化學(xué)反應(yīng)可形成氧化活性極高的ONOO-[18]。RYR2等鈣通道調(diào)控蛋白含有大量的自由巰基，是活性氧和氮類氧化損傷的極好目標(biāo)。高糖對(duì)心房肌鈣信號(hào)的影響可能與高糖氧化應(yīng)激相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)顯示，給予外源性O(shè)NOO-刺激后，RYR2蛋白的表達(dá)與DC-ONOO-組有差異，鈣離子的釋放增多，說(shuō)明ONOO-參與鈣通道的活化。而高糖可以不斷產(chǎn)生內(nèi)源性O(shè)NOO-，是一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間的刺激，更能參與鈣通道活化，調(diào)節(jié)鈣信號(hào)的釋放。

尿酸是體內(nèi)核酸嘌呤的代謝產(chǎn)物，是體內(nèi)天然抗氧化物質(zhì)，是ONOO-的特異性清除劑。本研究結(jié)果顯示，加用尿酸后，與HG組相比，鈣釋放減少，鈣通道蛋白R(shí)YR2也出現(xiàn)相應(yīng)的改變，且ONOO-+尿酸組較ONOO-組鈣釋放減少，進(jìn)一步表明尿酸可以消除ONOO-的氧化應(yīng)激作用，影響鈣信號(hào)的釋放。

目前，高糖引起鈣通道RYR2蛋白表達(dá)改變的機(jī)制并不清楚。FKBPl2.6能和RYR2結(jié)合，其中FKBPl2.6對(duì)維持RYR2通道的穩(wěn)定是必需的。FKBPl2.6結(jié)合RYR2可以穩(wěn)定RYR2閉合狀態(tài)，減少Ca2+漏出，促進(jìn)RYR2之間在興奮收縮過(guò)程中的耦聯(lián)，增強(qiáng)開(kāi)閉的同步協(xié)調(diào)性[17]。本研究證實(shí)，高糖對(duì)RYR2蛋白表達(dá)的影響可能與其調(diào)節(jié)蛋白FKBPl2.6相關(guān)。

研究揭示，高糖可以激活RYR2鈣信號(hào)通路，增加鈣的釋放，氧化應(yīng)激抑制因子―尿酸可以減少鈣的釋放。高糖可能通過(guò)氧化應(yīng)激引起RYR2蛋白上游信號(hào)通路分子―FKBP12.6調(diào)控鈣信號(hào)。本研究在一定程度上為糖尿病致心律失常機(jī)制的研究提供了理論基礎(chǔ)。

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