周夢(mèng)玉 宋昕蔚 徐靜 付雪 李婷 朱雨晨 肖幸運(yùn) 毛一劍 曾大力 胡江 朱麗 任德勇 高振宇 郭龍彪 錢前 吳明國(guó) 林建榮 張光恒

水稻是世界主要糧食作物之一，超過(guò)一半的人口以稻米為主食[1]。隨著世界人口增加，耕地面積不斷減少，環(huán)境壓力逐漸加大，提高水稻單產(chǎn)成為解決世界糧食安全問(wèn)題的有效途徑之一。而隨著人們生活水平提高，對(duì)稻米品質(zhì)的要求也越來(lái)越高。水稻粒型不僅與水稻產(chǎn)量相關(guān)，還與稻米的外觀品質(zhì)、加工品質(zhì)、蒸煮和食味品質(zhì)存在密切的關(guān)系[2]。因此，開(kāi)展粒型性狀QTL研究，對(duì)克隆調(diào)控水稻粒型性狀關(guān)鍵基因、揭示產(chǎn)量構(gòu)成、探索粒型與稻米品質(zhì)相關(guān)性具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外的許多研究者們利用不同類型的遺傳群體構(gòu)建了多種遺傳圖譜。McCouch等[3]利用水稻基因組測(cè)序成果，采用電子PCR的方法繪制了一張包含2740個(gè)SSR分子標(biāo)記連鎖圖譜。Xu等[4]利用窄葉青8號(hào)與京系17秈粳雜交獲得的永久性DH群體，構(gòu)建了一個(gè)包含108個(gè)位點(diǎn)的水稻遺傳圖譜。張啟軍等[5]選用4個(gè)測(cè)序水稻品種作為作圖親本，兩兩組合，繪制了6張微衛(wèi)星連鎖圖譜。莊杰云等[6]利用24個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建了103個(gè)水稻主要栽培品種的分子指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。徐建軍[7]以一套用秈稻品種9311為受體、粳稻品種日本晴為供體構(gòu)建的128個(gè)染色體片段代換系為材料，利用多元回歸分析方法，繪制Bin圖譜。作圖群體為F2群體或回交群體時(shí)，屬于暫時(shí)性群體，只能使用一個(gè)有性世代，難以長(zhǎng)期維持。相比之下，重組自交系(RIL)群體和加倍單倍體(DH)群體由于遺傳上的純合性，遺傳干擾少，可永久繼代保存，適于進(jìn)行各種持續(xù)性研究[8]。

遺傳圖譜的構(gòu)建，為水稻數(shù)量性狀調(diào)控基因的定位與克隆提供了便利。研究者們利用各種不同類型的遺傳群體，報(bào)道了粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚和粒重等粒型相關(guān)性狀的QTL或基因。其中，粒長(zhǎng)QTL達(dá)103個(gè)，粒寬QTL達(dá)95個(gè)，粒厚QTL數(shù)量相對(duì)較少[9]，另有控制粒重QTL 233個(gè)。方先文等[10]以云南省地方秈稻品種苜蓿和江蘇省優(yōu)質(zhì)粳稻品種南京46為材料，構(gòu)建了包含202個(gè)SSR標(biāo)記的分子遺傳連鎖圖譜，并研究了RIL群體中粒長(zhǎng)、粒寬、籽粒長(zhǎng)寬比和粒厚等粒型相關(guān)性狀。Xia等[11]為了闡明籽粒形態(tài)的遺傳基礎(chǔ)，利用秈稻品種Jin 23B和圓粳稻品種QingGuAi構(gòu)建的一個(gè)回交群體，共檢測(cè)到10個(gè)粒型性狀的QTL，其中qGW1、qGS3和qGS7三個(gè)對(duì)籽粒形態(tài)有較大影響的QTL在兩年內(nèi)均被檢測(cè)到。Zhao等[12]為了解“南陽(yáng)占”大粒形態(tài)的遺傳基礎(chǔ)，利用南陽(yáng)占和珍汕97B的重組自交系群體2年內(nèi)共檢測(cè)到53個(gè)QTL，分布在11條染色體上。其中，粒寬和粒長(zhǎng)的QTL分別在第2和第3染色體上檢測(cè)到的頻率最高。Zhou等[13]用蜀恢527作為輪回親本與小粒品種雜交并回交，利用BC2F2群體將控制水稻粒長(zhǎng)的主效QTLLk-4(t)作為單個(gè)孟德?tīng)栆蜃?，定位在?染色體著絲粒附近遺傳距離為1.4 cM的范圍內(nèi)。這些粒型主效QTL定位加速推進(jìn)了水稻籽粒性狀調(diào)控基因的挖掘和高產(chǎn)分子育種的進(jìn)程。目前GL7、srs-3、GS3、GL3.1、GL4、GS5、GW2、qSW5、GW5和Ghd7[14-23]等多個(gè)水稻粒型相關(guān)主效QTL已被成功克隆,gw3.1、qGL7、qGL7-2、TGW3b和gw9.1[24-28]等也已完成精細(xì)定位。但是，由于構(gòu)建圖譜所使用的群體不同，親本材料遺傳背景存在差異，在基因組覆蓋面、標(biāo)記疏密程度和具體標(biāo)記類型等方面均有所不同，其QTL定位結(jié)果往往難以直接比較，不利于進(jìn)一步開(kāi)展QTL精細(xì)定位和基因克隆，這也限制了水稻粒型主效QTL快速、全面的克隆與挖掘。

本研究利用超級(jí)稻春優(yōu)84的兩個(gè)在遺傳背景上存在較大差異的親本晚粳稻品種春江16B(CJ16B)和廣親和中秈恢復(fù)系C84作為群體雜交親本，雜交并連續(xù)自交7代構(gòu)建衍生的重組自交系作為遺傳作圖群體，篩選含有158個(gè)SSR和STS分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜。通過(guò)對(duì)水稻粒型相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位、分析和驗(yàn)證，進(jìn)一步挖掘水稻重要農(nóng)藝性狀的調(diào)控基因，完善水稻產(chǎn)量建成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)制，為水稻新種質(zhì)資源的篩選鑒定和高產(chǎn)分子設(shè)計(jì)育種利用奠定材料基礎(chǔ)、提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 群體材料及遺傳圖譜構(gòu)建

以秈稻恢復(fù)系品種C84為父本、粳稻品種春江16B為母本雜交獲得F1，2013年夏從F1代單株上收取自交種，采用單粒傳法連續(xù)自交7代，獲得C84/春江16B重組自交系群體(RIL)，從中選取表型穩(wěn)定的188個(gè)株系用于遺傳圖譜的構(gòu)建。選取在C84和春江16B間呈多態(tài)性，并均勻分布到12條染色體上的69對(duì)SSR(simple sequence repeats)和89對(duì)STS(sequence tagged site)標(biāo)記，對(duì)188個(gè)重組自交系的基因型進(jìn)行分析鑒定，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。

1.2 材料種植及農(nóng)藝性狀調(diào)查

親本C84和春江16B及RIL群體，分別于2016年夏和2016年冬，種植在浙江省杭州市中國(guó)水稻研究所富陽(yáng)試驗(yàn)基地和海南省陵水市中國(guó)水稻研究所南繁基地，行株距為20 cm×20 cm,每株系種植4行，每行6株。按照常規(guī)大田管理方法進(jìn)行管理，并對(duì)病蟲(chóng)草害進(jìn)行防治。

成熟期對(duì)親本C84和春江16B及其188個(gè)重組自交系的粒型性狀進(jìn)行鑒定。挑選灌漿飽滿的籽粒，利用考種儀(萬(wàn)深SC-G型，杭州萬(wàn)深檢測(cè)科技有限公司)測(cè)定粒長(zhǎng)、粒寬、千粒重等，每株系3次重復(fù)，取平均值[29]。粒厚用游標(biāo)卡尺測(cè)量，每株系8次重復(fù)，取平均值。

1.3 遺傳圖譜構(gòu)建與QTL分析

用MapDraw 2.1進(jìn)行標(biāo)記間的連鎖分析，繪制遺傳連鎖圖譜[30]。通過(guò)SAS 9.2對(duì)雙親和重組自交系群體的粒型性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用QTLNetwork 2.1進(jìn)行QTL計(jì)算與分析。以P=0.005為閾值統(tǒng)計(jì)該標(biāo)記處是否存在與性狀有關(guān)的QTL，采用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)化成遺傳距離。QTL的命名參照McCouch等[31]的命名方式。

1.4 雙親基因克隆序列差異分析及dCAPs分子標(biāo)記差異位點(diǎn)驗(yàn)證

對(duì)雙親QTL區(qū)間內(nèi)他人已克隆的6個(gè)粒型主效QTL等位基因進(jìn)行測(cè)序，分析其序列差異，根據(jù)編碼區(qū)cDNA差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)dCAP標(biāo)記驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組自交系親本C84與春江16B粒型比較

對(duì)重組自交系親本C84和春江16B的粒型性狀在兩個(gè)環(huán)境條件下進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)籽粒長(zhǎng)度、寬度、厚度、長(zhǎng)寬比和千粒重等在杭州和陵水兩個(gè)環(huán)境下都存在一定程度的差異，但各性狀變化趨勢(shì)和差異程度不盡相同(表1)。C84和春江16B的粒長(zhǎng)在杭州分別為8.2 mm和7.4 mm，在陵水為7.8 mm和7.0 mm，兩者均相差0.8 mm，群體親本C84和春江16B粒長(zhǎng)在陵水相對(duì)杭州略有下降，均減少0.40 mm，降幅分別為4.87%和5.41%，群體株系平均粒長(zhǎng)下降了0.18 mm。粒寬的變化趨勢(shì)則不一樣，粳稻親本春江16B在兩地沒(méi)有差異，均為3.2 mm，而秈稻親本C84的粒寬則陵水比杭州增加0.2 mm，增幅達(dá)6.89%，群體株系平均粒寬增加0.11 mm，差異顯著。雙親籽粒厚度差異極顯著，不同環(huán)境變化不大，粒長(zhǎng)、粒寬的改變直接影響籽粒長(zhǎng)寬比，秈稻親本C84、粳稻親本春江16B和群體株系的長(zhǎng)寬比平均值陵水比杭州分別下降了10.71%、4.35%和5.95%。粒型改變往往導(dǎo)致千粒重發(fā)生變化，雖然兩親本在杭州和陵水的千粒重并沒(méi)有顯著的差異，但是群體株系的千粒重顯著增加，由杭州的22.17 g增加到陵水的22.98 g，增幅達(dá)3.65%。結(jié)果顯示，雙親在籽粒形態(tài)上均存在顯著差異，且受環(huán)境影響不大，因此，構(gòu)建的重組自交系群體可以用于粒型相關(guān)性狀的QTL定位。

表1 雙親(C84和春江16B)及其RIL群體2016年在杭州和陵水的粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚、長(zhǎng)寬比及千粒重Table 1.Grain length,width,thickness,length-to-width ratio and 1000-grain weight in C84 and CJ16B and their recombinant inbred line population in Hangzhou,Zhejiang Province and Lingshui,Hainan Province,China in 2016.

2.2 重組自交系群體粒型性狀分布及相關(guān)性分析

分別對(duì)在杭州、陵水兩個(gè)環(huán)境下的雙親及群體粒型性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，無(wú)論是在杭州還是陵水，群體中不同株系粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚、長(zhǎng)寬比及千粒重測(cè)定值均表現(xiàn)為連續(xù)分布，且有一定數(shù)量超親株系存在，基本符合正態(tài)分布(圖1)。說(shuō)明粒型為多基因控制的數(shù)量性狀，符合QTL定位的要求。

圖1 C84/CJ16B重組自交系群體粒型相關(guān)性狀分布Fig.1.Frequency distributions of grain shape traits in C84/CJ16B recombinant inbred lines.

表2 C84/CJ16B重組自交系群體粒型性狀間相關(guān)性分析Table 2.Correlationship analysis on grain shape traits in C84/CJ16B recombinant inbred lines.

對(duì)C84/春江16B重組自交系群體粒型性狀間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明同一性狀在不同的環(huán)境中呈極顯著正相關(guān)(表2)。杭州與陵水的群體株系的粒長(zhǎng)、粒寬和籽粒長(zhǎng)寬比等性狀均呈極顯著的正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.809、0.817和0.854；但粒厚及千粒重相對(duì)其他粒型性狀在兩地間的相關(guān)性較低，相關(guān)系數(shù)僅為0.270和0.529。推測(cè)這可能與雙親的遺傳背景、群體大小以及杭州、陵水特定環(huán)境中的光照條件存在一定的關(guān)系，同時(shí)，群體中不同株系對(duì)環(huán)境敏感性差異可能會(huì)影響籽粒的充實(shí)度，造成粒厚及千粒重較大程度分離所致。

2.3 遺傳圖譜的構(gòu)建

利用均勻分布在水稻12條染色體上的158個(gè)SSR和STS多態(tài)標(biāo)記對(duì)RIL群體的188個(gè)株系的基因型進(jìn)行鑒定，構(gòu)建了總長(zhǎng)度為1428.4 cM的遺傳連鎖圖譜，平均每條染色體覆蓋長(zhǎng)度為119.03 cM，相鄰分子標(biāo)記間的平均距離為9.04 cM，平均每條染色體上的標(biāo)記數(shù)13.2個(gè)(表3)。第1染色體及第4染色體上分子標(biāo)記相對(duì)較多，分別達(dá)17和18個(gè)，第9和第10染色體上分子標(biāo)記相對(duì)較少，分別只有10個(gè)和9個(gè)。第1染色體平均遺傳距離最大，達(dá)11.34 cM，第5染色體平均遺傳距離最小，為7.13 cM。所有標(biāo)記在染色體上分布較為均勻，但也存在一些間隔較大的區(qū)域(如第3染色體的H3-3－RM1479之間和第12染色體的RM1337－RM3739之間)和標(biāo)記較為密集的區(qū)域(如第2染色體的H2-3－RM262之間，第4染色體的H4-2－H4-8之間和第5染色體的H5-1－H5-6之間)。整體來(lái)看，距離適中，構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜適合進(jìn)行水稻相關(guān)農(nóng)藝性狀的QTL定位。

表3 本研究所用的標(biāo)記在水稻12條染色體上分布Table 3.Distribution of the markers used in the study on 12 chromosomes of rice.

2.4 粒型性狀的QTL定位

利用構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜，結(jié)合RIL群體188個(gè)株系及其親本的粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚、籽粒長(zhǎng)寬比、千粒重等5個(gè)粒型性狀在杭州、陵水的表型值，采用復(fù)合區(qū)間作圖法，對(duì)籽粒形態(tài)進(jìn)行了QTL分析，共檢測(cè)到30個(gè)粒型相關(guān)QTL(表4、圖2)。其中，粒長(zhǎng)QTL 9個(gè)，粒寬QTL 5個(gè)，粒厚QTL 5個(gè)，長(zhǎng)寬比QTL 6個(gè)和千粒重QTL 5個(gè)，單位點(diǎn)貢獻(xiàn)率3.51%～17.25%。

共檢測(cè)到9個(gè)粒長(zhǎng)QTL，貢獻(xiàn)率介于5.75%～14.40%，親本C84及春江16B均有增加粒長(zhǎng)的增效等位基因，但來(lái)自C84的增效等位基因數(shù)目比來(lái)自春江16B的要多，這與親本C84的籽粒長(zhǎng)度大于春江16B相符。其中qGL10在兩地均能被檢測(cè)到，位于第10染色體上RM6370－RM5689區(qū)間內(nèi)，杭州和陵水的貢獻(xiàn)率分別為11.97%和10.33%，其增效等位基因均來(lái)源于親本C84，該區(qū)間已有粒長(zhǎng)調(diào)控基因OsPCR1[32]被克隆。qGL1、qGL2.1和qGL2.2，qGL5、qGL11貢獻(xiàn)率均小于10%，其中，qGL2.1區(qū)間內(nèi)已有粒長(zhǎng)調(diào)控基因FUWA[33]被克隆，qGL5相應(yīng)區(qū)間內(nèi)已有粒長(zhǎng)調(diào)控基因JMJ703[34]，SRS3/OsKinesin-13A/sar1[35]被克隆。qGL7.1、qGL7.2及qGL12分別解釋粒長(zhǎng)10.09%、14.40%、11.04%的遺傳變異。

共檢測(cè)到5個(gè)粒寬QTL，除qGW1增效等位基因來(lái)源于親本C84之外，其余增效等位基因均來(lái)源于親本春江16B，且加性效應(yīng)值較大。qGW2.1和qGW2.2分別在兩地被檢測(cè)到，區(qū)間位置相鄰，貢獻(xiàn)率分別為9.58%和9.34%。粒寬QTL中貢獻(xiàn)率最高的是qGW5，其在兩年的試驗(yàn)中被重復(fù)檢測(cè)到，位于RM17954－H5-7標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，貢獻(xiàn)率分別為12.28%和11.44%，該區(qū)間內(nèi)已有粒寬調(diào)控基因qGW5[36]被克隆。qGW1和qGW6貢獻(xiàn)率分別為3.51%和7.06%，尚未見(jiàn)報(bào)道，可能是新的QTL位點(diǎn)。

共檢測(cè)到5個(gè)粒厚QTL。與粒寬相同，除qGT1增效等位基因來(lái)源于秈稻親本C84之外，其余增效等位基因均來(lái)源于母本春江16B。其中，位于第1染色體上RM8097－RM6703區(qū)間的qGT1在兩地均能被檢測(cè)到，杭州和陵水的貢獻(xiàn)率分別為12.75%和12.59%，該區(qū)間與千粒重QTLqTGW1.2重疊，可能受同一基因控制，說(shuō)明千粒重與粒厚關(guān)系密切。qGT2.2定位于第2染色體H2-5－H2-6區(qū)間內(nèi)，解釋9.51%遺傳變異，該區(qū)間同時(shí)定位到qGL2.2及qGLW2.2。qGT2.1、qGT6和qGT9貢獻(xiàn)率均小于10%，至今均尚未見(jiàn)報(bào)道，可能是影響籽粒形態(tài)發(fā)育相關(guān)的新QTL調(diào)控位點(diǎn)。

表4 RILs的粒型相關(guān)性狀的QTL定位結(jié)果Table 4.QTLs for grain shape-related traits of recombinant inbred lines.

在杭州和陵水分別檢測(cè)到了2個(gè)和5個(gè)控制籽粒長(zhǎng)寬比的QTL。其中，qGLW5在杭州和陵水兩地均能被檢測(cè)到，貢獻(xiàn)率分別為17.25%及12.75%。qGLW2.1、qGLW2.2及qGLW2增效等位基因均來(lái)源于父本C84，位置相鄰，分別解釋籽粒長(zhǎng)寬比13.88%、15.61%、12.95%的遺傳變異。qGLW11及qGLW12貢獻(xiàn)率相對(duì)較低，分別為7.79%和6.25%，增效等位基因來(lái)源于母本春江16B。

共檢測(cè)到5個(gè)控制千粒重的QTL。位于第5染色體上qTGW5，加性效應(yīng)值及貢獻(xiàn)率最高，貢獻(xiàn)率達(dá)10.55%，其增效等位基因來(lái)源于親本C84，能增加千粒重1.2472 g。qTGW1.1和qTGW1.2分別在杭州及陵水兩地被檢測(cè)到，位置相近，加性效應(yīng)及貢獻(xiàn)率也基本一致，其增效等位基因均來(lái)源于C84，qTGW1.1區(qū)間內(nèi)已有千粒重相關(guān)調(diào)控基因OsTRBF3[36]被克隆。加性效應(yīng)及貢獻(xiàn)率最低的qTGW9，貢獻(xiàn)率僅為4.55%，增效等位基因來(lái)源于C84，能增加千粒重0.8719 g。qTGW4加性效應(yīng)值為1.1454 g，貢獻(xiàn)率達(dá)7.41%。

圖2 水稻粒型相關(guān)性狀QTL在染色體上的分布Fig.2.Distribution of QTLs related to grain shape traits in rice chromosome.

利用杭州和陵水兩個(gè)群體檢測(cè)到的QTL，部分與已報(bào)道的QTL相同或相近，部分為首次報(bào)道。由于數(shù)量性狀的表現(xiàn)受基因、環(huán)境及其互作的影響，同一性狀在不同的定位群體中表現(xiàn)不一致，且同一群體在不同年份、不同環(huán)境中的表現(xiàn)結(jié)果也會(huì)有所不同。

2.5 雙親已克隆粒型主效QTL等位基因序列差異分析及分子標(biāo)記驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證利用春江16B和C84構(gòu)建的RIL連鎖遺傳圖譜進(jìn)行QTL定位的可靠性及挖掘重要粒型調(diào)控新基因的可能性，我們對(duì)定位獲得的粒形主效QTL區(qū)間，比較已克隆基因在雙親中的等位基因序列差異。本研究檢測(cè)到的粒型主效QTL區(qū)間內(nèi)共有6個(gè)已知克隆基因，第1染色體上的千粒重調(diào)控基因OsTRBF3已被克隆基因，第2染色體上的粒長(zhǎng)調(diào)控基因FUWA已被克隆，第5染色體上共有3個(gè)已知被克隆基因，分別是粒長(zhǎng)調(diào)控基因SRS3/OsKinesin-13A/sar1，粒寬調(diào)控基因qGW5和JMJ703(既調(diào)控粒長(zhǎng)也調(diào)控粒寬性狀)，第10染色體上粒長(zhǎng)調(diào)控基因OsPCR1為已被克隆基因。分別對(duì)雙親已知基因進(jìn)行克隆測(cè)序。表5列出了相關(guān)基因外顯子編碼區(qū)序列差異，可見(jiàn)除JMJ703基因在外顯子編碼區(qū)無(wú)差異之外，雙親在另外5個(gè)基因多個(gè)位點(diǎn)都表現(xiàn)出堿基差異，相應(yīng)位點(diǎn)氨基酸也不同。有兩個(gè)位點(diǎn)還由于堿基缺失導(dǎo)致編碼區(qū)翻譯移碼，基因功能發(fā)生變化。我們又根據(jù)雙親目標(biāo)基因測(cè)序的差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)dCAPs標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，每個(gè)目標(biāo)基因選取一個(gè)差異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)分子標(biāo)記(表6)，酶切驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)上述基因?qū)?yīng)堿基位點(diǎn)的確存在堿基差異(圖 3)。

表5 雙親(C84和春江16B)已克隆粒型主效QTL等位基因序列差異分析Table 5.Sequence variance analysis of the cloned grain shape main effect QTL allele in the two parents(C84 and CJ16B).

表6 雙親目標(biāo)基因差異位點(diǎn)dCAPs分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)Table 6.dCAPs molecular marker designed according to target gene difference site of the two parents C84 and CJ16B.

圖3 差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)dCAPs分子標(biāo)記驗(yàn)證結(jié)果Fig.3.Results of dCAPs markers in difference site verifying.

3 討論

水稻籽粒形態(tài)是多途徑、多基因調(diào)控的復(fù)雜遺傳性狀的綜合體現(xiàn)。本研究通過(guò)對(duì)杭州和陵水兩個(gè)環(huán)境的籽粒性狀比對(duì)，同一性狀在不同環(huán)境之間具有較高的相關(guān)性，說(shuō)明粒型性狀總體受環(huán)境影響較小，具較高的遺傳力，但不同性狀受環(huán)境影響存在差異。從表型上看，粒長(zhǎng)相對(duì)粒寬、粒厚、千粒重更容易受環(huán)境的影響。究其原因可能主要是由群體親本秈粳亞種遺傳背景差異、主效QTL/基因的等位變異以及微效QTL與環(huán)境互作協(xié)同調(diào)控的結(jié)果。

我們利用C84/春江16B重組自交系群體共定位到的30個(gè)與粒型性狀相關(guān)QTL，有5個(gè)QTL區(qū)間覆蓋了6個(gè)已克隆的主效粒型QTL/基因，其中qGL10、qGW5、qGT1和qGL/GW5在兩地中能同時(shí)被檢測(cè)到，貢獻(xiàn)率均穩(wěn)定在10%以上，分別覆蓋已克隆粒型基因OsPCR1、qGW5和JMJ703(JMJ703同時(shí)調(diào)控籽粒的長(zhǎng)度與寬度的發(fā)育)。其中qGL2.1、qGL7.1、qGW2.1、qGT2.1和qGL/GW2.2是在杭州群體中被檢測(cè)到，qGL2.2、qGL7.2、qGW2.2、qGT2.2和qGLW2是在陵水群體中被檢測(cè)到的，同一染色體上相應(yīng)QTL兩個(gè)標(biāo)記位置相鄰、加性效應(yīng)方向一致、貢獻(xiàn)率也基本相同，我們推測(cè)可能是受同一個(gè)QTL調(diào)控，由于環(huán)境效應(yīng)導(dǎo)致定位發(fā)生偏離。另外，我們發(fā)現(xiàn)RM17954－H5-7區(qū)間內(nèi)同時(shí)存在粒長(zhǎng)、粒寬、長(zhǎng)寬比和千粒重的QTL，說(shuō)明同一區(qū)間中可能存在多個(gè)影響籽粒形態(tài)發(fā)育的調(diào)控基因，或者存在“一因多效”的可能性。

利用不同材料構(gòu)建遺傳群體定位的QTL結(jié)果往往存在一定的差異。我們定位到的9個(gè)調(diào)控粒長(zhǎng)QTL的區(qū)間中，在3個(gè)區(qū)間內(nèi)已有粒型調(diào)控基因克隆，分別為第2染色體上的FUWA，第5染色體上的JMJ703、SRS3/OsKinesin-13A/sar1和第10染色體上的OsPCR1。FUWA在禾本科作物中進(jìn)化保守，通過(guò)限制細(xì)胞周期過(guò)程，能使籽粒變短、變寬、變厚[33]。JMJ703是水稻中一種活性H3K4特異性去甲基酶，參與控制轉(zhuǎn)座子的活性，突變體種子長(zhǎng)、寬以及厚度都下降[37]。SRS3在發(fā)育的器官中有高表達(dá)，影響細(xì)胞縱向長(zhǎng)度，調(diào)控水稻種子長(zhǎng)度[38]；OsKinesin-13A通過(guò)影響穎殼大小，進(jìn)而調(diào)控水稻穎果大??；sar1突變體的籽粒長(zhǎng)度以及其他器官如節(jié)間、葉片以及根部等均變短[35]。OsPCR1主要在水稻幼苗期的根中以及生殖期的第I和II節(jié)間表達(dá)，與野生型相比，OsPCR1敲除株系籽粒變輕，粒長(zhǎng)變短，粒重下降12%[32]。上述已知克隆基因?qū)λ玖Ｐ途酗@著的調(diào)控作用。另有4個(gè)粒長(zhǎng)QTLqGL-1[39]、qGL2-2[40]、qGL-11[39]和qGL-12[40]等與已報(bào)道的水稻粒型基因/QTL區(qū)間有重疊；同樣，5個(gè)粒寬QTL定位區(qū)間中，除了qGW1區(qū)段內(nèi)有1個(gè)基因（qGW5/JMJ703）被克隆外，qGW1、qGW6也有重疊區(qū)間的粒寬QTL報(bào)道[41,42]；而目前已挖掘的水稻粒厚QTL數(shù)量相對(duì)較少，在定位區(qū)間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)與已知粒厚QTL位置重疊。在所有檢測(cè)到的千粒重QTL中，除qTGW1.1為檢測(cè)到的新位點(diǎn)外，其余4個(gè)區(qū)間存在重疊區(qū)段的位點(diǎn)qTGW1-2/qTGW1-3[43]/Kw1-2[44]/tgwt1[45]、qGW-1[46]、gw4[47]、qTGWT-5[48]/gw5b/Gwt5a[49,50]等也已先后被報(bào)道。在該區(qū)間內(nèi)已有編碼單MYB組蛋白家族的端粒重復(fù)序列結(jié)合因子基因OsTRBF3被克隆，它影響籽粒千粒重[36]。說(shuō)明千粒重是一個(gè)籽粒形態(tài)與稻米胚乳發(fā)育相關(guān)的籽粒綜合性狀指標(biāo)，除了受環(huán)境和遺傳因素影響外，粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚等形態(tài)性狀發(fā)育與水稻千粒重也密切相關(guān)。另外，在我們的定位結(jié)果中，除了以上多個(gè)已知的粒型相關(guān)主效QTL相同或相鄰?fù)?，還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)新的粒型相關(guān)QTL調(diào)控位點(diǎn)，其中，粒長(zhǎng)4個(gè)、粒寬3個(gè)、粒厚5個(gè)及千粒重1個(gè)。由此，我們推測(cè)不同群體間同一性狀主效QTL定位結(jié)果的異同與構(gòu)建群體的雙親間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近、形態(tài)性狀多態(tài)性、差異等位基因的多寡以及連鎖圖譜的標(biāo)記數(shù)目存在密切關(guān)系。水稻粒型QTL的定位與克隆為發(fā)展分子選擇標(biāo)記、聚合有利基因及水稻超高產(chǎn)分子設(shè)計(jì)育種順利實(shí)施奠定理論基礎(chǔ)和提供基因新資源。

同時(shí)，我們結(jié)合C84、春江16B對(duì)定位區(qū)間內(nèi)的5個(gè)已知粒型等位基因序列進(jìn)行分析并根據(jù)差異位點(diǎn)開(kāi)展分子標(biāo)記驗(yàn)證，證實(shí)雙親目標(biāo)等位基因間確實(shí)存在編碼氨基酸的差異，我們推測(cè)該差異等位基因即為該QTL定位區(qū)間內(nèi)具粒型調(diào)控作用的目標(biāo)基因。說(shuō)明利用C84/春江16B構(gòu)建的重組高代自交系群體可以成功的用于水稻粒型性狀或者其他重要農(nóng)藝性狀的QTL的定位與挖掘。后期通過(guò)雙親全基因組SNPs掃描，加密區(qū)間內(nèi)的標(biāo)記數(shù)目，從而飽和該區(qū)段的內(nèi)的標(biāo)記數(shù)，以提高不同性狀QTL檢測(cè)準(zhǔn)確性，加速目標(biāo)基因的精細(xì)定位和圖位克隆。

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