陳秀博，晉文燕，吳曉輝，馬英

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070）

CDC25B是細(xì)胞周期的重要調(diào)控蛋白，它是調(diào)節(jié)CDK-cyclin復(fù)合物活性的重要因子[1]。由于其調(diào)節(jié)作用，CDC25B與癌癥緊密相連，也成為治療癌癥的潛在靶點(diǎn)。CDK-cyclin復(fù)合物在細(xì)胞周期調(diào)控中起核心作用，當(dāng)Cyclin A和CDK相結(jié)合后，CDK分子暴露了14位和15位的蘇氨酸和酪氨酸，激酶Weel能對14位和15位的蘇氨酸和酪氨酸進(jìn)行磷酸化，從而抑制了CDK的活性[2]。CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)還未見報(bào)道。本研究旨在研究CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物的結(jié)合模式，經(jīng)過分析其關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)，闡明了CDC25B與CDK2/Cyclin A蛋白間參與相互作用的殘基，為新型CDC25B抑制劑的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蛋白-蛋白對接 蛋白-蛋白對接是基于兩個已知蛋白的三維結(jié)構(gòu)，通過分子模擬方法預(yù)測復(fù)合物的近天然結(jié)構(gòu)。使用Discovery Studio v3.5中的ZDOCK[3-5]和RDOCK[6]模塊來實(shí)現(xiàn)蛋白與蛋白的對接計(jì)算。ZDOCK是一種基于快速傅里葉轉(zhuǎn)化相關(guān)性技術(shù)的剛性蛋白對接算法。RDOCK是一種基于CHARMm的能量優(yōu)化過程，用于優(yōu)化ZDOCK所尋找到的蛋白-蛋白復(fù)合物的結(jié)合構(gòu)型，并使用能量打分函數(shù)給這些結(jié)合構(gòu)型打分。

選取CDC25B蛋白作為對接的受體（PDB ID：4WH9）[7]，將從晶體庫[8]中下載下來的 CDK2/Cyclin A 的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：5CYI）[9]作為對接的配體。首先使用 Discovery Studio v3.5 中“prepare protein”[10-11]對受體蛋白和配體蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，包括去掉結(jié)晶水和處理二硫鍵，處理金屬離子，按照預(yù)期的溫度和pH為蛋白分子加上末端氫原子。然后使用Discovery Studio v3.5中的ZDOCK模塊預(yù)測CDC25B與CDK2/Cyclin A的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。設(shè)置旋轉(zhuǎn)采樣的配體方向歐拉角度步長為6，“RMSD Cutoff”為 6.0，“Interface Cutoff”為 9.0，“Maximum Number of Clusters”為 60，結(jié)合模式“Top Poses”為2000，其它參數(shù)均使用缺省值，進(jìn)行計(jì)算。采用ZRANK方法對ZDOCK對接得分進(jìn)行重新排序。最后，基于CHARMM polar H力場采用RDOCK方法對ZDOCK結(jié)果進(jìn)行重新優(yōu)化和打分，選出前五個E_RDOCK得分較低的構(gòu)象進(jìn)行下一步的分析。使用superimpose程序?qū)⑼ㄟ^RDOCK優(yōu)化后的5個結(jié)合模式中的CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白與晶體庫中已有蛋白的構(gòu)象進(jìn)行疊合比較，選出RMSD ＜3?[12]的構(gòu)象。

1.2 預(yù)測CDC25B蛋白與CDK2/Cyclin A蛋白的結(jié)合位點(diǎn) 蛋白-蛋白復(fù)合物是通過蛋白質(zhì)間的非共價相互作用形成的，其主要組成部分包括疏水相互作用、氫鍵相互作用、靜電相互作用等。疏水相互作用是指由于非極性基團(tuán)的存在，分子中極性基團(tuán)的靜電力和氫鍵力基團(tuán)有聚集在一起的傾向而對疏水基團(tuán)產(chǎn)生排斥，從而導(dǎo)致水分子結(jié)構(gòu)重排，水和水之間形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)，造成疏水基團(tuán)相互聚攏所產(chǎn)生的能量效應(yīng)和熵效應(yīng)。氫鍵相互作用是指由一個缺電的H原子和一個電負(fù)性強(qiáng)的原子或原子團(tuán)X（如F、O、N等）之間形成的一種弱相互作用。應(yīng)用“Analyze Protein Interface”模塊計(jì)算CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白的溶劑可及表面積（SAS）并分析CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白相互作用界面的關(guān)鍵氨基酸殘基?！癈alculate Interaction Energy”模塊計(jì)算CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白相互作用界面處的關(guān)鍵氨基酸殘基間的相互作用能。通過分析CDC25B蛋白與CDK2/Cyclin A蛋白結(jié)合界面處關(guān)鍵氨基酸殘基的相互作用預(yù)測CDC25B蛋白與CDK2/Cyclin A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 蛋白-蛋白對接的研究

2.1.1 獲得CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ZDOCK和RDOCK方法模擬得到CDC25B與CDK2/Cyclin A的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。ZDOCK算法是基于傅立葉快速轉(zhuǎn)換技術(shù)的大分子剛性對接算法，并且充分考慮了配體蛋白的柔性，在蛋白-蛋白的對接中具有很高的準(zhǔn)確性；而RDOCK算法是基于CHARMM力場能量的最小化并應(yīng)用靜電勢能和去溶劑化能組成的自由能打分函數(shù)來預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)準(zhǔn)確性的方法。

通過ZDOCK算法共產(chǎn)生了60簇包括2 000個構(gòu)象并且通過ZDOCKScore進(jìn)行排名，選取前100個結(jié)構(gòu)進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。應(yīng)用RDOCK算法對選取的復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)E_DOCK Score進(jìn)行排名。E_RDOCK Score得分越低，表明該pose對接結(jié)果越好，越接近真實(shí)的對接構(gòu)象。選出前5個E_RDOCK Score較低的構(gòu)象（表1），應(yīng)用superimpose程序?qū)⑦@5個構(gòu)象中的CDC25B和CDK2/CyclinA蛋白與晶體庫中已有蛋白的構(gòu)象進(jìn)行疊合。將這5個構(gòu)象中的CDC25B蛋白與此蛋白的構(gòu)象進(jìn)行疊合后，其RMSD 值分別為 0.32?，0.40?，0.35?，0.44?，0.36?。CDK2/Cyclin A蛋白的RMSD值分別為0.40?，0.38 ?，0.42?，0.34?，0.43?。RMSD 值越小，代表其構(gòu)象越接近真實(shí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。因此，選擇pose 1（圖1A）為目標(biāo)對象分析CDC25B蛋白與CDK2/Cyclin A蛋白結(jié)合界面處關(guān)鍵氨基酸殘基的相互作用，預(yù)測CDC25B蛋白與CDK2/Cyclin A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。

表1 ZDOCK和RDOCK對接后得分Tab 1 Docking score(ZDOCK and RDOCK)

圖1 (A)CDC25B蛋白與CDK2/Cyclin A蛋白對接模式圖；(B)CDC25B蛋白與CDK2/Cyclin A蛋白結(jié)合界面處關(guān)鍵氨基酸殘基相互作用圖Fig 1 (A)The docking model of CDC25B and CDK2/Cyclin A;(B)The interaction of key residues in CDC25B and CDK2/Cyclin A surface

2.2 CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物相互作用分析 以上一步得到的最優(yōu)結(jié)構(gòu)pose 1為目標(biāo)，應(yīng)用“Analyze Protein Interface”和“Calculate Interaction Energy”模塊分析CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物之間的相互作用。

2.2.1 疏水相互作用分析 疏水/親水間的平衡是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要特征，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水作用在一定程度上決定了其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，它是支撐蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定必不可少的部分，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有極其重要的影響。圖2是CDC25BCDK2/Cyclin A復(fù)合物疏水性氨基酸殘基的分布圖，藍(lán)色為親水性氨基酸殘基，棕色為疏水性氨基酸殘基，顏色深淺和親疏水性大小呈正相關(guān)，親水性到疏水性的區(qū)間為-3.0至3.0。表2和表3列出了CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物界面處所含極性殘基和非極性殘基的SAS值。統(tǒng)計(jì)分析表明CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白結(jié)合界面處的Polar Contact Surface Area 值分別為 396.89 ?2和429.32 ?2，Nonpolar Contact Surface Area 值分別為429.32 ?2和 376.70 ?2，應(yīng)用半經(jīng)驗(yàn)法對 CDC25BCDK2/Cyclin A復(fù)合物的疏水率（hydrophobicity）進(jìn)行定量描述，

其中NONSAS和POLSAS分別表示 HNRPKAGPS復(fù)合物結(jié)合界面處非極性基團(tuán)和極性基團(tuán)的溶劑可接近表面積總和，下標(biāo)1和2分別表示CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白，代入上述公式計(jì)算得到CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白之間的疏水率為48.88%。CDC25B蛋白中GLY380，PHE475，ARG490，LEU540，ARG544，LEU545 氨基酸殘基和 CDK2/Cyclin A 蛋白中 LYS9，LEU37，ILE49，ILE52，LEU54，VAL69，THR72，GLU73，LEU76，LYS89，ASP92，LYS129，ARG150，ALA151，PHE152，THR165，ARG169，SER181，PHE213，ARG214，ARG217（CDK2），VAL175，ASP177，LEU186，MET189，GLU230，LEU263，GLU274，LYS288，LEU292，ARG293，GLU295，LEU299，ASP305，LEU320（Cyclin A）氨基酸殘基表現(xiàn)出了疏水性質(zhì)，使兩蛋白間形成了較強(qiáng)的疏水界面。

2.2.2 氫鍵和共軛作用分析 氫鍵和共軛作用是分子相互作用中重要的作用力，對整個系統(tǒng)的穩(wěn)定起著重要的作用。圖1B所示，CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物相互作用界面處共含有1個Pi相互作用和6個氫鍵來維持其三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。CDC25B：ARG485 的 NH 和 CDK2/Cyclin A：TRP167形成Pi-Cation相互作用。表4列出了CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白結(jié)合界面處所有參與氫鍵形成的氨基酸殘基及其氫鍵鍵長，它們主要是由一側(cè)亞基上氨基酸殘基的羰基氧和另一側(cè)亞基氨基酸殘基的酰胺氫或巰基氫相互作用所形成。由表4可知結(jié)合界面處有4對氨基酸殘基間（TYR382：OH-TYR382：HH；ASP206：OD2-ASP210：OD1；ARG488：HH-ASP206：O；ARG492：HH-ASP206：OD2；ARG492：HE-ARG492：HH;SER207：OG-ASP210：OD2）的氫鍵鍵長均小于2.7?，屬于短強(qiáng)氫鍵，是穩(wěn)定CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物結(jié)構(gòu)的主要作用力。

表2 CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物界面處CDC25B極性殘基和非極性殘基的SAS值Tab 2 The SAS of CDC25B polar and nonpolar residues in the surface of CDC25B-CDK2/Cyclin A complex

表3 CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物界面處CDK2/Cyclin A極性殘基和非極性殘基的SAS值Tab 3 The SAS of CDK2/Cyclin polar and nonpolar residues in the surface of CDC25B-CDK2/Cyclin A complex

圖2 CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物結(jié)合界面處的疏水分布Fig 2 Distribution of hydrophobic of CDC25B-CDK2/Cyclin A complex surface

表4 CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物結(jié)合界面處殘基間氫鍵統(tǒng)計(jì)Tab 4 Hydrogen bond statistics of CDC25B-CDK2/Cyclin A complex surface

2.2.3 相互作用能分析 為了確定CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白相互作用中起作用的重要氨基酸殘基，本實(shí)驗(yàn)在CHARMm力場下計(jì)算了CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白位于界面處的各氨基酸殘基的相互作用能。計(jì)算結(jié)果顯示CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白的總相互作用能為-41.697kcal/mol，其中范德華（VDW）作用能和靜電作用能分別為-14.219kcal/mol和-27.478kcal/mol，靜電作用能明顯大于VDW作用能，這說明靜電作用是促使復(fù)合物結(jié)構(gòu)形成的主要驅(qū)動力。表5列出了CDC25B-CDK2/Cyclin A結(jié)合界面處重要氨基酸殘基的相互作用能。在CDC25B蛋白的結(jié)合界面處的 氨 基 酸 殘 基 包 括 GLY380，TYR382，ARG485，ARG488，GLU489，ARG490，ARG492，TYR497，在CDK2/CyclinA蛋白的結(jié)合界面處的氨基酸殘基包括THR165，TRP167，ASP206，SER207，ASP210，PHE213，它們之間的相互作用能對CDC25B-CDK2/CyclinA復(fù)合物活性區(qū)域結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起著重要作用。以上這些分析揭示了CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白的結(jié)合模式及起相互作用的氨基酸殘基，為之后研究CDC25B蛋白與CDK2/Cyclin A相互作用奠定基礎(chǔ)。

表5 CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物結(jié)合界面處殘基的相互作用能統(tǒng)計(jì)Tab 5 Interaction statistics of CDC25B-CDK2/Cyclin A complex surface

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過蛋白-蛋白對接方法模擬了CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)，并應(yīng)用“Analyze Protein Interface”和“Calculate Interaction Energy”模塊分析兩蛋白之間的相互作用。應(yīng)用ZDOCK和RDOCK的方法，對CDC25B蛋白與CDK2/Cyclin A蛋白進(jìn)行對接，并根據(jù)對接得分及superimpose程序，挑選出得分最高，RMSD值最小的構(gòu)象（pose 1）。最后應(yīng)用“Analyze Protein Interface”和“Calculate Interaction Energy”模塊，對pose 1的疏水相互作用，氫鍵相互作用，相互作用能進(jìn)行計(jì)算分析，預(yù)測得到CDC25B-CDK2/Cyclin A復(fù)合物的結(jié)合模式及起相互作用的氨基酸殘基（CDC25B：GLY380，TYR382，ARG485，ARG488，GLU489，ARG490，ARG492，TYR497；CDK2/CyclinA：THR165，TRP167，ASP206，SER207，ASP210，PHE213）。為之后研究CDC25B蛋白與CDK2/Cyclin A蛋白相互作用奠定了基礎(chǔ)，同時也為抗癌藥物的研究發(fā)展提供了新的思路。

[1]Kristja’nsdo’ttir K,Rudolph J.Cdc25 phosphatases and cancer[J].Chem Biol,2004,11(8)：1043

[2]MorganOD.Principal of CDKregulation[J].Nature,1995,374(6518)：131

[3]Wiehe K,Pierce B,Mintseris J,et al.ZDOCK and RDOCK performance in Capri rounds 3,4,and 5[J].Proteins,2005,60(2)：207

[4]Chen R,Li L,Weng Z P.ZDOCK：an initial-stage protein-docking algorithm[J].Proteins,2003,52(1)：80

[5]Chen R,Weng Z P.A novel shape complementarity scoring function for protein-protein docking[J].Proteins,2003,51(3)：397

[6]Li L,Chen R,Rdock W Z.Refinement of rigid-body protein docking predictions[J].Proteins,2003,53(3)：693

[7]Lund G,Dudkin S,Borkin D,et al.Inhibition of CDC25B phosphatase through disruption of protein-protein interaction[J].ACS Chem Biol,2015,10(2)：390

[8]Zardecki C,Dutta S,Goodsell D S,et al.RCSB protein data bank：a resource for chemical,biochemical,and structural explorations of large and small biomolecules[J].J Chem Educ,2016,93(3)：569

[9]Martin M,Anscombe E,Meschini E,et al.Identification and characterization of an irreversible inhibitor of CDK2[J].Eur J Cancer,2014,50(6)：106

[10]Spassov V Z,Flook P K,Yan L S.LOOPER：a molecular mechanics-based algorithm for protein loop prediction[J].Protein Eng Des Sel,2008,21(2)：91

[11]Spassov V Z,Yan L.A fast and accurate computational approach to protein ionization[J].Protein Sci,2008,17(11)：1955

[12]Kingsley L J,Esquivel-Rodriguez J,Yang Y A,et al.Ranking protein-protein docking results using steered molecular dynamics and potential of mean force calculations[J].J Comput Chem,2016,37(20)：1861