石江鵬，張春芬，鄧舒，侯麗媛，肖蓉，李芙蓉，董艷輝，聶園軍，王亦學(xué)，曹秋芬,

?

蘋果純合基因型新種質(zhì)的性狀鑒定與培養(yǎng)

石江鵬1，張春芬2，鄧舒2，侯麗媛3，肖蓉2，李芙蓉1，董艷輝3，聶園軍4，王亦學(xué)3，曹秋芬1,3

（1山西大學(xué)生物工程學(xué)院，太原 030006；2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，太原 030031；3山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031；4山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，太原 030031）

【目的】蘋果花藥培養(yǎng)獲得的純合基因型株系來(lái)自不同的花粉粒，因此不同株系的植物學(xué)特征、生物學(xué)特性，以及誘導(dǎo)培養(yǎng)、生根的條件等都存在差異。本研究對(duì)不同個(gè)株系試管苗的倍性、表型特征、生根培養(yǎng)條件進(jìn)行觀察分析，選出蘋果純合基因型株系適宜的生根條件及綜合性狀較好的株系，加強(qiáng)蘋果種質(zhì)資源創(chuàng)新。【方法】采用花藥培養(yǎng)獲得的‘嘎啦’‘富士’‘紅星’純合基因型株系，利用流式細(xì)胞儀分析每個(gè)株系倍性，探索組培苗的生根培養(yǎng)條件，觀察每個(gè)株系的根系、葉片形態(tài)特征?！窘Y(jié)果】經(jīng)蘋果花藥培養(yǎng)獲得32個(gè)純合基因型株系，其中單倍體1株、三倍體1株、四倍體3株、二倍體27株，‘紅星’蘋果純合基因型株系的倍性分化率最大，為28.57%。IBA濃度影響再生株系的生根率、根長(zhǎng)及根數(shù)，蘋果純合基因型株系的最適宜生根濃度為IBA 2—3 mg·L-1。各個(gè)株系的葉數(shù)、根長(zhǎng)、根數(shù)、株高、葉形指數(shù)（葉長(zhǎng)度/葉寬度）、葉柄有一定差異。‘紅星’純合基因型DH0-1、DH0-3、DH0-4、DH0-7株系，‘富士’純合基因型DH1-3株系，‘嘎啦’純合基因型DH2-2、DH2-4、DH2-12、DH2-20株系綜合性狀較好（植株高、根系長(zhǎng)、葉數(shù)和根數(shù)多）?！t星’純合基因型株系的移栽成活率最高，為28.57%?！窘Y(jié)論】蘋果純合基因型株系的主要倍性為二倍體。與二倍體株系相比，單倍體株系葉基窄、葉柄細(xì)、葉色和葉緣鋸齒較淺，而多倍體株系表現(xiàn)為葉基更闊、葉柄較粗、葉色和葉緣鋸齒變深。

蘋果花藥培養(yǎng)；倍性分析；純合基因型；生根激素；性狀分析

0 引言

【研究意義】單倍體育種是現(xiàn)代育種的一項(xiàng)重要內(nèi)容，單倍體植株經(jīng)誘變后再進(jìn)行染色體加倍形成雙單倍體純系，可以縮短育種周期，豐富種質(zhì)資源[1]。花藥培養(yǎng)是人工誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的有效途徑，目前已在小麥、辣椒、甜橙等多種植物上廣泛應(yīng)用，并成功與雜交育種、轉(zhuǎn)基因相結(jié)合形成一套較為完整的育種技術(shù)體系[2-4]。蘋果為基因組高度雜合木本植物，童期長(zhǎng)，加上自交不親和，導(dǎo)致通過(guò)多代自交獲得純合植株的方法難以實(shí)現(xiàn)[5]。蘋果花藥培養(yǎng)獲得具有配子體來(lái)源的純合基因型植株，該植株目標(biāo)性狀穩(wěn)定，便于遺傳分析，提高了選擇效率[6]。同時(shí)，蘋果花藥培養(yǎng)獲得的每個(gè)株系均來(lái)自不同的花粉粒，因此具有獨(dú)一性、唯一性，是進(jìn)行雜交育種、遺傳分析的重要材料[7]。來(lái)自不同花粉粒的株系，其植物學(xué)特征、生物學(xué)特性，以及誘導(dǎo)培養(yǎng)、生根的條件等都有差異，因此對(duì)每個(gè)株系試管苗的倍性、生長(zhǎng)特性、特征、生根培養(yǎng)條件及試管苗生根移植到田間后的性狀進(jìn)行觀察分析，對(duì)蘋果新種質(zhì)的創(chuàng)新具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蘋果花藥培養(yǎng)開(kāi)始于20世紀(jì)70年代末。1990年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所相繼獲得10個(gè)品種的胚狀體，以及‘元帥’‘赤陽(yáng)’‘祝光’‘國(guó)光’‘富士’‘紅玉’‘新紅星’‘金冠’8個(gè)花藥培養(yǎng)的再生植株，經(jīng)染色體觀察和同工酶分析證明來(lái)源于花粉[8]。Zhang等[9]以‘紅星’蘋果花藥為試材，發(fā)現(xiàn)在蘋果花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體形成的過(guò)程中，花藥中的小孢子在經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的低溫誘導(dǎo)后才能獲得胚性潛能。溫鑫等[10]用SSR標(biāo)記對(duì)30個(gè)‘嘎啦’蘋果花藥培養(yǎng)再生株系進(jìn)行基因型鑒定，經(jīng)檢測(cè)全部株系為純合基因型。H?FER等[11-13]經(jīng)多年研究，獲得單倍體來(lái)源的蘋果植株共100多株，并證明通過(guò)蘋果花藥培養(yǎng)獲得的再生植株，與供體相比，其結(jié)實(shí)率低，形態(tài)特征發(fā)生了變化。【本研究切入點(diǎn)】蘋果營(yíng)養(yǎng)豐富、口感爽脆，是中國(guó)果實(shí)產(chǎn)量最高的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，中國(guó)的蘋果主栽品種多數(shù)由外國(guó)引進(jìn)[14]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于蘋果花藥培養(yǎng)的研究不斷深入，但關(guān)于蘋果花藥培養(yǎng)獲得的純合基因型株系表型方面的鑒定、倍性分析，以及生根條件的篩選尚未得到大量、有效的重復(fù)驗(yàn)證，更沒(méi)有后續(xù)相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)‘嘎啦’‘富士’‘紅星’的純合基因型株系進(jìn)行倍性分析，篩選其最適的生根條件，并對(duì)32個(gè)株系進(jìn)行表型多樣性分析，進(jìn)一步選育優(yōu)良的蘋果新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2013—2016年每年4月初，采集山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)所蘋果基地的‘紅星’‘富士’‘嘎啦’蘋果（Borkh.）的健壯花蕾，經(jīng)過(guò)蘋果花藥培養(yǎng)獲得再生植株。本研究以花藥培養(yǎng)再生植株為材料[15-16]，經(jīng)SSR鑒定均為單倍體來(lái)源[10]，其中包括‘紅星’7株、‘富士’5株、‘嘎啦’20株（表1中DH0：‘紅星’；DH1：‘富士’；DH2：‘嘎啦’）。

1.2 再生植株倍性分析

取2—3片0.5 cm2左右再生植株嫩葉置于預(yù)冷的干凈培養(yǎng)皿中，加入1 mL WBP細(xì)胞裂解液，用刀片快速切碎后靜置1—3 min，經(jīng)直徑50 μm濾網(wǎng)過(guò)濾于EP管中，濾液中加入核糖核酸酶和熒光染料（propidium iodide，PI），濃度為50 μm?mL-1，4℃靜置20 min。利用流式細(xì)胞儀（BD C6）進(jìn)行倍性分析。以雜合二倍體‘嘎啦’試管苗葉片為對(duì)照。

1.3 生根培養(yǎng)基的篩選

取生長(zhǎng)旺盛的繼代組培苗為材料，當(dāng)再生植株不定芽長(zhǎng)度為3 cm左右時(shí)，對(duì)其剪切并轉(zhuǎn)移至添加不同IBA濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定根誘導(dǎo)處理，培養(yǎng)基為1/2 MS+2 %蔗糖+0.6 %瓊脂，IBA濃度設(shè)3個(gè)處理，分別為1 mg·L-1（T1）、2 mg·L-1（T2）、3 mg·L-1（T3）。置于25℃溫室光照培養(yǎng)（光照強(qiáng)度3 000 lx，光照時(shí)間14 h/d）。以上共3個(gè)處理，每個(gè)處理15株。40 d后開(kāi)始統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理的生根率（生根株數(shù)/總株數(shù)），并從每個(gè)處理中選取根系較發(fā)達(dá)的3株測(cè)量植株主根數(shù)和平均根長(zhǎng)，以篩選適宜蘋果純合基因型株系生根的激素濃度。

1.4 生根試管苗的性狀觀察

將蘋果純合基因型株系接入生根培養(yǎng)基后從生根培養(yǎng)的3個(gè)處理中選取葉片充分展開(kāi)，根系長(zhǎng)勢(shì)較好的3株，在40 d后觀察統(tǒng)計(jì)試管苗生長(zhǎng)狀態(tài)、長(zhǎng)勢(shì)、葉色、葉片形狀等。測(cè)量試管苗葉片的葉長(zhǎng)度、葉寬度、葉柄長(zhǎng)度，計(jì)算葉形指數(shù)（葉長(zhǎng)度/葉寬度）。測(cè)量植株主根數(shù)、根長(zhǎng)度和株高。觀察生長(zhǎng)情況并拍照，分析不同株系的性狀差異。觀察記載方法參照《果樹(shù)種質(zhì)資源描述符—記載項(xiàng)目及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》[17]。

1.5 生根苗馴化、移栽

生根培養(yǎng)40 d后每個(gè)株系選取10株進(jìn)行馴化移栽。置于室內(nèi)自然光照下培養(yǎng)5—7 d后，去掉瓶蓋加入自來(lái)水10 mL左右，煉苗3 d。將組培苗的根部殘留培養(yǎng)基用清水沖洗干凈，移栽到含有草炭、蛭石、珍珠鹽的花盆中（比例為1﹕1﹕1），在花盆上蓋一層保鮮膜后放入光照培養(yǎng)箱（光照培養(yǎng)：12 h、25℃，暗培養(yǎng)：12 h、21℃），3周后轉(zhuǎn)移至溫室條件進(jìn)行培養(yǎng)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用 Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)；用SPSS 20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并使用Duncan法對(duì)不同處理進(jìn)行多重分析，≤0.05認(rèn)為具有顯著性差異，圖表中所有數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SE）[18]。

2 結(jié)果

2.1 蘋果純合基因型株系倍性分析

對(duì)‘嘎啦’‘富士’‘紅星’的32個(gè)蘋果純合基因型株系進(jìn)行倍性分析。結(jié)果表明，有單倍體、二倍體、三倍體和四倍體4種不同的倍性（表1、圖1）。其中單倍體（n）1株、二倍體（2n）27株、三倍體（3n）1株、四倍體（4n）3株，二倍體占84.38%，說(shuō)明蘋果純合基因型株系的主要倍性為二倍體?！吕病皇俊t星’蘋果純合基因型株系的倍性分化率具有差異性，其中‘紅星’蘋果純合基因型株系的倍性分化率最大，為28.57%，‘富士’‘嘎拉’蘋果純合基因型株系的倍性分化率分別為20%和10%。

表1 ‘紅星’‘富士’‘嘎啦’蘋果純合基因型株系倍性

H0：‘紅星’蘋果純合基因型株系；DH1：‘富士’蘋果純合基因型株系；DH2：‘嘎啦’蘋果純合基因型株系。下同

DH0: ‘Red Star’homozygous lines; DH1: ‘Fuji’homozygous lines; DH2: ‘Gala’homozygous lines. The same as below

2.2 蘋果純合基因型株系生根培養(yǎng)

2.2.1‘紅星’蘋果純合基因型株系生根培養(yǎng) 由表2可知，與T1培養(yǎng)基相比，T2、T3培養(yǎng)基的生根率較高，T1培養(yǎng)基生根率為6.67%—70%，而T2、T3培養(yǎng)基生根率均為53.33%—100%。從根長(zhǎng)來(lái)看，IBA濃度對(duì)大多數(shù)‘紅星’純合基因型株系的根長(zhǎng)影響不明顯，DH0-3株系在T2培養(yǎng)基根長(zhǎng)最長(zhǎng)，為20.83 cm，在T3和T1培養(yǎng)基的最大根長(zhǎng)分別為20.13 cm和18.13 cm（圖2-A）。分析7個(gè)株系的生根數(shù)，生根數(shù)最多的培養(yǎng)基主要為T2或T3培養(yǎng)基，DH0-7株系在T3培養(yǎng)基中生根數(shù)為22.33條，而在T1培養(yǎng)基中僅為1條。說(shuō)明IBA濃度不足顯著降低了生根率和根數(shù)，根長(zhǎng)也有所減小，但影響不顯著。綜上所述，從生根率、生根數(shù)、根的長(zhǎng)度來(lái)看，‘紅星’蘋果純合基因型株系以1/2 MS培養(yǎng)基中添加2—3 mg L-1IBA（T2、T3培養(yǎng)基）為宜。其中，T2培養(yǎng)基中生根率達(dá)到最高的有4個(gè)株系，略好于T3培養(yǎng)基。

圖1 流式細(xì)胞儀對(duì)再生植株倍性分析

表2 不同IBA濃度對(duì)‘紅星’蘋果純合基因型株系根系形態(tài)的影響

同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（＜0.05），‘-’表示該濃度下的植株不生根。T1—T3分別表示IBA濃度1、2和3 mg L-1的處理。下同

Different lowercases in a column indicate significant differences at 0.05 level. ‘-’ indicating that the plant does not root at this concentration. T1, T2 and T3 mean the root mediums with concentrations of IBA 1, 2 and 3 mg L-1, respectively. The same as below

2.2.2 ‘富士’蘋果純合基因型株系生根培養(yǎng) 如表3所示，從生根率來(lái)看，‘富士’純合基因型株系在T2培養(yǎng)基生根率最高，T1培養(yǎng)基生根率為0—53.33%，T2培養(yǎng)基生根率為26.67%—100%，T3培養(yǎng)基生根率為6.67%—86.67%。分析所有株系的根長(zhǎng)和根數(shù)，在T2、T3培養(yǎng)基的根長(zhǎng)和根數(shù)顯著高于T1培養(yǎng)基（＜0.05），DH1-3株系在T2、T3培養(yǎng)基的根長(zhǎng)分別為21.00 cm和18.37 cm，而在T1培養(yǎng)基的根長(zhǎng)僅為14.00 cm；DH1-1株系在T1、T2、T3培養(yǎng)基的根數(shù)分別為3.00、18.33、17.00條（圖2-B）。表明激素濃度明顯影響‘富士’純合基因型株系的生根率、根長(zhǎng)和根數(shù)，‘富士’純合基因型株系在添加2—3 mg L-1IBA的培養(yǎng)基中（T2、T3培養(yǎng)基），根的長(zhǎng)勢(shì)最好，其中，T2培養(yǎng)基好于T3培養(yǎng)基。

表3 不同IBA濃度對(duì)‘富士’蘋果純合基因型株系根系形態(tài)的影響

2.2.3 ‘嘎啦’蘋果純合基因型株系生根培養(yǎng)基分析 表4表明，‘嘎啦’純合基因型株系的生根率高達(dá)100%，其中DH2-7株系在3個(gè)培養(yǎng)基均為100%（圖2-C），DH2-5、DH2-13、DH2-18在T2、T3培養(yǎng)基中生根率一樣，為100%；DH2-2株系在T1、T2培養(yǎng)基中的生根率最高，為100%。除此之外，其余‘嘎啦’純合基因型株系在T1培養(yǎng)基的生根率低于T2、T3培養(yǎng)基，T2培養(yǎng)基的生根率略好于T3培養(yǎng)基。DH2-1、DH2-8、DH2-9、DH2-15、DH2-19、DH2-20株系在T1、T2、T3培養(yǎng)基的根長(zhǎng)無(wú)顯著差別（＞0.05），而其他株系在T1培養(yǎng)基的根長(zhǎng)顯著低于T2或T3培養(yǎng)基（＜0.05），且T2、T3培養(yǎng)基的根長(zhǎng)基本無(wú)差別，其中，DH2-11株系在T2、T3培養(yǎng)基的根長(zhǎng)為20.70 cm，而在T1培養(yǎng)基中僅為14.50 cm。分析20個(gè)株系在3個(gè)培養(yǎng)基中的生根數(shù)，生根數(shù)最多的培養(yǎng)基主要為T2或T3培養(yǎng)基，T2培養(yǎng)基的生根數(shù)略好于T3培養(yǎng)基。DH2-20株系在T2培養(yǎng)基中生根數(shù)為86.67條，而在T1培養(yǎng)基中僅為27條（圖2-D）。綜上所述，激素濃度是‘嘎啦’純合基因型株系生根率、生根數(shù)及生根長(zhǎng)度的限制因子之一，在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2—3 mg·L-1的生根激素（T2、T3培養(yǎng)基），生根狀態(tài)最好。

2.3 蘋果純合基因型株系性狀分析

2.3.1‘紅星’蘋果純合基因型株系性狀分析 如表5所示，‘紅星’純合基因型株系DH0-2、DH0-5株系葉數(shù)較少，分別為12.33和15.00，DH0-1株系的葉數(shù)最多，為27.00；DH0-1、DH0-4、DH0-7株系的根數(shù)顯著較高（＜0.05），為17.67—22.33條，而其余株系根數(shù)僅為4.33—11.00條。從根長(zhǎng)來(lái)看，DH0-3株系根長(zhǎng)最大，為18.17 cm（圖3-A），其他株系根長(zhǎng)最長(zhǎng)為5.73 cm（DH0-2株系，圖3-B）；‘紅星’純合基因型株系的株高差異不明顯；DH0-1、DH0-3、DH0-4、DH0-7株系的葉柄較長(zhǎng)，為0.77—0.87 cm。表明‘紅星’純合基因型的大部分株系性狀較好，其中DH0-1、DH0-3、DH0-4、DH0-7株系的綜合性狀明顯好于其他株系，且4個(gè)株系的葉形指數(shù)差異不顯著，說(shuō)明它們的葉片形狀無(wú)顯著差別。

2.3.2‘富士’蘋果純合基因型株系性狀分析 從表6可以看出，‘富士’蘋果純合基因型株系葉數(shù)差異較小，為15.33—22.67片；比較所有株系的根數(shù)，DH1-3株系根數(shù)顯著最多（＜0.05），為26.00條；從根長(zhǎng)來(lái)看，DH1-2、DH1-3株系根長(zhǎng)為19.00—22.27 cm，而其他株系僅為4.43—7.93 cm；‘富士’蘋果純合基因型DH1-5株系的株高最高，為3.33 cm（圖3-C），DH1-1株系的株高僅為1.97 cm（圖3-D）；分析葉柄長(zhǎng)度，DH1-2、DH1-3株系的葉柄較長(zhǎng)，分別為1.53和1.17 cm。表明‘富士’純合基因型DH1-3株系的綜合性狀好，葉形指數(shù)較小，葉片形狀呈闊圓形。

表4 不同IBA濃度對(duì)‘嘎啦’蘋果純合基因型株系根系形態(tài)的影響

表5 ‘紅星’蘋果純合基因型株系性狀

2.3.3‘嘎啦’蘋果純合基因型株系性狀分析 表7表明，‘嘎啦’蘋果純合基因型DH2-5株系葉數(shù)最少，為11.33片，DH2-4株系葉數(shù)最多，為36.67片；就根數(shù)而言，DH2-20株系根數(shù)多達(dá)85.67條（圖3-E），DH2-2、DH2-7株系根數(shù)少于DH2-20株系，但顯著多于其他株系（＜0.05），分別為41.67和43.67條；從根長(zhǎng)來(lái)看，DH2-7株系根長(zhǎng)最大，為35.27 cm（圖3-F），而其他株系的根長(zhǎng)最大僅為22.10 cm（DH2-10株系）；比較株高，DH2-2株系株高顯著最高，為5.57 cm（圖3-G），DH2-8株系株高顯著最矮，為1.67 cm（圖3-H）；‘嘎啦’蘋果純合基因型株系葉柄長(zhǎng)度無(wú)明顯差別。綜上所述，‘嘎啦’純合基因型DH2-2、DH2-4、DH2-7、DH2-20株系的綜合性狀好（圖3-E—G），相較DH2-4、DH2-7株系，DH2-2、DH2-20株系的葉形指數(shù)較大，所以葉片形狀呈窄長(zhǎng)形。

A：‘紅星’純合基因型DH0-3株系在T1、T2、T3培養(yǎng)基生根；B：‘富士’純合基因型DH1-1株系在T1、T2、T3培養(yǎng)基生根；C：‘嘎啦’純合基因型DH2-7株系在T1、T2、T3培養(yǎng)基生根；D：‘嘎啦’純合基因型DH2-20株系在T1、T2、T3培養(yǎng)基生根

A：‘紅星’蘋果純合基因型DH0-3株系；B：‘紅星’蘋果純合基因型DH0-2株系；C：‘富士’蘋果純合基因型DH1-5株系；D：‘富士’蘋果純合基因型DH1-1株系；E：‘嘎啦’蘋果純合基因型DH2-20株系；F：‘嘎啦’蘋果純合基因型DH2-7株系；G：‘嘎啦’蘋果純合基因型DH2-2株系；H：‘嘎啦’蘋果純合基因型DH2-8株系

2.4 蘋果不同倍性純合基因型株系葉片形態(tài)特征

葉片形態(tài)特征可被用作鑒定植物倍性水平的指示標(biāo)記（如莖的粗度、葉色、葉緣、葉片形狀和葉形指數(shù)等）[19-20]。本研究中，蘋果純合基因型株系的單倍體、多倍體變異株系和二倍體株系在葉片形態(tài)特征上表現(xiàn)出明顯差異。

蘋果純合基因型單倍體、多倍體株系葉片形態(tài)特征表現(xiàn)出了表型變異的多樣性。葉形指數(shù)在單倍體、二倍體和多倍體之間表現(xiàn)差異顯著（表5—7），單倍體DH2-3株系的葉形指數(shù)（3.07）顯著大于其他倍性株系，二倍體的葉形指數(shù)為1.40—2.29，三倍體DH0-7株系、四倍體DH0-5株系的葉形指數(shù)分別為1.88和1.71。二倍體為橢圓形（圖4-A），單倍體的葉片形狀為狹橢圓形（圖4-B），多倍體為廣橢圓形（圖4-C—F）。單倍體DH2-3株系葉片呈窄長(zhǎng)形（圖4-B），而三倍體、四倍體葉片呈闊圓形（圖4-C—F）。與二倍體DH2-20株系相比，單倍體葉基更窄，葉柄較細(xì)（圖4-B）；而多倍體株系的葉基變得更闊，葉柄較粗（圖4-C—F）。不同倍性株系葉色、葉緣鋸齒的變異也表現(xiàn)出多樣性，單倍體的葉色、葉緣鋸齒較淺（圖4-B），多倍體的葉色、葉緣鋸齒一般變深（圖4-C—F）。這一結(jié)果表明葉色、葉片形狀、葉形指數(shù)、葉緣變異及葉柄長(zhǎng)度都可用做蘋果純合基因型株系不同倍體變異早期選擇的有效指示標(biāo)記。

表6 ‘富士’蘋果純合基因型株系性狀

表7 ‘嘎啦’蘋果純合基因型株系性狀

2.5 生根苗馴化、移栽

經(jīng)移栽后，‘紅星’純合基因型DH0-3、DH0-4株系，‘富士’純合基因型DH1-3株系，‘嘎啦’純合基因型DH2-2、DH2-4、DH2-6、DH2-7、DH2-11株系成活（圖5）。

A：‘嘎啦’蘋果純合基因型二倍體株系（DH2-20）；B：‘嘎啦’蘋果純合基因型單倍體株系（DH2-3）；C：‘紅星’蘋果純合基因型三倍體株系（DH0-7）；D：‘紅星’蘋果純合基因型四倍體株系（DH0-5）；E：‘嘎啦’蘋果純合基因型四倍體株系（DH2-15）；F：‘富士’蘋果純合基因型四倍體株系（DH1-2）

A：‘紅星’純合基因型DH0-3株系；B：‘紅星’純合基因型DH0-4株系；C：‘富士’純合基因型DH1-3株系；D：‘嘎啦’純合基因型DH2-2株系；E：‘嘎啦’純合基因型DH2-4株系；F：‘嘎啦’純合基因型DH2-7株系

3 討論

本研究中的32個(gè)純合基因型株系有4種不同的倍性（單倍體、二倍體、三倍體、四倍體），其中主要倍性為二倍體。H?FER等[21]研究發(fā)現(xiàn)花藥培養(yǎng)獲得的再生植株染色體倍數(shù)變化多樣，在通過(guò)花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)的植株中，87.5%是二倍體，而單倍體、三倍體和四倍體胚胎的發(fā)生率非常低。TESTILLANO[22]、GRIGGS[23]等研究表明，再生植株染色體自然加倍現(xiàn)象是由于單倍體細(xì)胞發(fā)生了核融合或核內(nèi)加倍。筆者課題組使用SSR標(biāo)記對(duì)花藥來(lái)源植株鑒定揭示了再生植株100%的純合性，32個(gè)株系均為單倍體來(lái)源的再生植株，可以排除二倍體由體細(xì)胞發(fā)育而來(lái)[10,15]。

組培過(guò)程中，不同的品種、外植體在培養(yǎng)基中添加不同濃度、種類的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（如BA、IBA、KT等）對(duì)生根率、根長(zhǎng)、根數(shù)有一定的影響[24-25]。在誘導(dǎo)試管苗生根時(shí)，以MS或1/2 MS為基本培養(yǎng)基[26]。DOBRáNSZKI等[27]報(bào)道‘皇家嘎啦’蘋果在培養(yǎng)基中添加2 mg?L-1IBA時(shí)，生根狀況良好；‘旭’蘋果在添加1 mg?L-1IBA的培養(yǎng)基中生根良好；‘Prima’蘋果在3 mg?L-1IBA水平上生根狀態(tài)良好。謝璇等[28]研究表明，‘紅富士’蘋果組培苗在添加IBA 1 mg?L-1、蔗糖20 mg L-1的1/2 MS培養(yǎng)基適宜不定根誘導(dǎo)。有關(guān)蘋果純合基因型株系生根培養(yǎng)條件的報(bào)道較少，本試驗(yàn)表明IBA濃度對(duì)‘紅星’‘富士’‘嘎啦’蘋果純合基因型株系的生根有影響，以1/2 MS培養(yǎng)基中添加2—3 mg?L-1生根誘導(dǎo)激素（IBA）為宜。

陳銀全等[29]研究表明，由于花粉來(lái)源的株系配子體豐富，因此不同的植株性狀表現(xiàn)多樣化。蘋果花藥來(lái)源不同株系的樹(shù)種習(xí)性和葉片形態(tài)有很大差異[13]。與供體葉相比，蘋果花藥來(lái)源植株的葉長(zhǎng)、寬度、果實(shí)顯著變小，花的形態(tài)也發(fā)生了改變[30-31]。通過(guò)對(duì)葉片大小和生長(zhǎng)習(xí)性的測(cè)定，蘋果花藥培養(yǎng)株系比雜合母本植株的活力更低[32-33]。LI等[34]描述了×再生系的不同倍性間葉片形態(tài)和植物大小的差異。本研究中‘紅星’蘋果純合基因型DH0-1、DH0-3、DH0-4、DH0-7株系，‘富士’蘋果純合基因型DH1-3株系，‘嘎啦’蘋果純合基因型DH2-2、DH2-4、DH2-12、DH2-20株系的性狀較好。

蘋果純合基因型單倍體、二倍體、多倍體株系的生長(zhǎng)形態(tài)具有差異性，本研究中單倍體、二倍體、多倍體株系的葉基、葉片形狀、葉柄、葉色、葉緣鋸齒具有明顯差異。除此之外，還有其他性狀的變異，如單倍體的葉形變得更窄長(zhǎng)，表現(xiàn)為葉形指數(shù)增大。從分子機(jī)制方面分析，不同倍性株系生長(zhǎng)形態(tài)多樣性可能是由于染色體加倍后引起染色體結(jié)構(gòu)的改變或表觀遺傳的修飾[35]，也可能是因?yàn)榛虻淖兓黾恿嘶虮磉_(dá)的多樣性而導(dǎo)致表型變異[36-37]。由于材料有限，本研究只對(duì)不同倍性的植株表型變異進(jìn)行了觀察分析，但RIDDLE等[38]表明不同種或不同基因型的單倍體、多倍體其表型變異也不同，所以還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

蘋果花藥培養(yǎng)獲得的32個(gè)純合基因型株系中，‘紅星’蘋果有1個(gè)三倍體、1個(gè)四倍體；‘富士’蘋果有1個(gè)四倍體；‘嘎啦’蘋果有1個(gè)單倍體、1個(gè)四倍體，蘋果純合基因型株系的主要倍性為二倍體，且‘紅星’蘋果純合基因型株系的倍性分化率最大，為28.57%。單倍體株系葉基窄、葉柄細(xì)、葉色和葉緣鋸齒較淺，而多倍體株系與之相反。除此之外，還有其他性狀的變異，如單倍體的葉形變得更窄長(zhǎng)，表現(xiàn)為葉形指數(shù)增大。IBA濃度2—3 mg?L-1為蘋果純合基因型株系組培的最適濃度?！t星’純合基因型DH0-1、DH0-3、DH0-4、DH0-7株系，‘富士’純合基因型DH1-3株系，‘嘎啦’純合基因型DH2-2、DH2-4、DH2-7、DH2-20株系優(yōu)于同一品種其他株系?！t星’純合基因型株系的移栽成活率最高，為28.57%。

[1] GERMANà M A. Doubled haploid production in fruit crops.2006, 86(2): 131-146.

[2] 王煒, 陳琛, 歐巧明, 葉春雷, 羅俊杰. 小麥花藥培養(yǎng)的研究和應(yīng)用. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2016, 30(12): 2343-2354.

WANG W, CHEN C, OU Q M, YE C L, LUO J J. Research and application of wheat anther culture., 2016, 30(12): 2343-2354. (in Chinese)

[3] CARDOSO J C, MARTINELLI A P, GERMANà M A, LATADO R R. In vitro anther culture of sweet orange (L. Osbeck) genotypes and of a‘Hamlin’ hybrid., 2014, 117(3): 455-464.

[4] ZHAO J, ZOU X X, ZHANG Z Q, YANG B Z, ZHOU S D. Influences of carbon sources and plant growth regulators on anther culture efficiency of pepper., 2010, 11(4): 102-105.

[5] H?FER M.androgenesis in apple., 2003, 60(1): 287-292.

[6] 李佳. 百合單倍體培養(yǎng)及細(xì)胞學(xué)觀察[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2011.

LI J. Haploid culture and cytology observation in lilium [D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2011. (in Chinese)

[7] ZHANG C F, SATO S, TSUKUNI T, SATO M, OKADA H, YAMAMOTO T, WADA M, MATSUMOTO S, YOSHIKAWA N, MIMIDA N, TAKAGISHI K, WATANABE M, CAO Q F, KOMORI S. Elucidating cultivar differences in plant regeneration ability in an apple anther culture., 2016, doi: 10.2503/ hortj.MI-094.

[8] 薛光榮, 牛健哲, 楊振英, 史永忠, 費(fèi)開(kāi)韋. 蘋果花藥培養(yǎng)技術(shù)及8個(gè)主栽品種的花粉植株培育成功. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 1990, 23(3): 86-87.

XUE G R, NIU J Z, YANG Z Y, SHI Y Z , FEI K W. The technique of apple anther culture and the successful culture of pollen plantlets of 8 main apple cultivar., 1990, 23(3): 86-87. (in Chinese)

[9] ZHANG C, TSUKUNI T, IKEDA M, SATO M, OKADA H, OHASHI Y, MATSUNO H, YAMAMOTOT, WADA M, YOSHIKAWA N, MATSUMOTO S, LI J, MIMIDA N, WATANABE M, SUZUKI A, KOMORI S. Effects of the microspore development stage and cold pre-treatment of flower buds on embryo induction in apple (Borkh.) anther culture.2013, 82(82): 114-124.

[10] 溫鑫, 鄧舒, 張春芬, 侯麗媛, 石江鵬, 聶園軍, 肖蓉, 秦永軍, 曹秋芬. ‘嘎啦’蘋果花藥培養(yǎng)種質(zhì)創(chuàng)新. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(14): 2793-2806.

WEN X, DENG S, ZHANG C F, HOU L Y, SHI J P, NIE Y J, XIAO R, QIN Y J, CAO Q F. Regeneration of new germplasms using anther culture of apple cultivar ‘Gala’.2017, 50(14): 2793-2806(in Chinese)

[11] H?FER M. Regeneration of androgenic embryos in apple (Brokh.) via anther and microspore culture.,2005, 27(4): 709-716.

[12] H?FER M, GRAFE C, BOUDICHEVSKAJA A, LOPEZ A, BUENO M A, ROEN D. Characterization of plant material obtained byandrogenesis and in situ parthenogenesis in apple.2008, 117(3): 203-211.

[13] H?FER M, FLACHOWSKY H. Comprehensive characterization of plant material obtained by in vitro androgenesis in apple.2015, 122(3): 617-628.

[14] 翟衡, 史大川, 束環(huán)瑞. 我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢(shì). 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2007, 24(3): 355-360.

ZHAI H, SHI D C, SHU H R. Current state and developing trend of apple industry in China., 2007, 24(3): 355-360. (in Chinese)

[15] 張春芬, 鄧舒, 肖蓉, 孟玉平, 曹秋芬. 蘋果花藥培養(yǎng)再生植株的倍性鑒定及SSR分析. 園藝學(xué)報(bào), 2015, 42(S1): 2580.

ZHANG C F, DENG S, XIAO R, MENG Y P, CAO Q F. Ploidy identification and SSR analysis of regenerated plants in apple anther culture., 2015, 42(S1): 2580. (in Chinese)

[16] 任瑩. 蘋果單倍體育種技術(shù)探究[D]. 太原: 山西大學(xué), 2015.

REN Y. Research on Haploid breeding technique in anther culture [D]. Taiyuan: Shanxi University, 2015. (in Chinese)

[17] 蒲富慎. 果樹(shù)種質(zhì)資源描述符—記載項(xiàng)目及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn). 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1990: 23-37.

PU F S.. Beijing: China Agricultural Press, 1990: 23-37. (in Chinese)

[18] 崔佩佩, 劉鵬, 劉佳琪, 王勁松, 武愛(ài)蓮, 董二偉, 丁玉川, 焦曉燕. 不同養(yǎng)分配比對(duì)高粱根系生長(zhǎng)及養(yǎng)分吸收的影響. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 25(11): 1643-1652.

CUI P P, LIU P, LIU J Q, WANG J S, WU A L, DONG E W, DING Y C, JIAO X Y. Effect of different nutrient co mbinations on root growth and nutrient accumulation in sorghum., 2017, 25(11): 1643-1652.

[19] ZENG S H, CHEN C W, HONG L, LIU J H, DENG X X. In vitro induction, regeneration and analysis of autotetraploids derived from protoplasts and callus treated with colchicine in Citrus.2006, 87(1): 85-93.

[20] KAWASE K, YAHATA M, NAKAGANA S, HARAGUCHI K, KUNITAKE H. Selection of autotetraploid and its morphological characteristics in Meiwa Kumquat (Fortunella crassifolia Swingle) (Breeding & Germplasm Resources).1975, 4(11): 141-146.

[21] H?FER M.androgenesis in apple-improvement of the induction phase., 2004, 22(6): 365-370.

[22] TESTILLANO P, GEORGIEV S, MOGENSEN H L, CORONADO M J, DUMAS C, RISUENO M C, MATTHYS-ROCHON E. Spontaneous chromosome doubling results from nuclear fusion during in vitro maize induced microspore embryogenesis., 2004, 112(7): 342-349.

[23] GRIGGS R, ZHENG M Y. Nuclear fusion during early stage of microspore embryogenesis indicates chromosome doubling in wheat ()., 2016, 07(3): 489-499.

[24] 鐘曉紅, 戴思慧, 馬定渭. 核果類果樹(shù)莖尖培養(yǎng)研究進(jìn)展. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2003, 20(5): 388-392.

ZHONG X H, DAI S H, MA D W. Advances of research in shoot-tip culture on stone fruit crops., 2003, 20(5): 388-392. (in Chinese)

[25] 肖祖飛. 童性對(duì)蘋果砧木綠枝扦插生根的影響[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

XIAO Z F. Impact of the juvenility on the adventitious rooting of leafy cuttings in apple rootstocks [D]. Beijing: China Agriculture University, 2014. (in Chinese)

[26] KAUSHAL N, MODGIL M, THAKUR M, SHARMA D R . In vitro clonal multiplication of an apple rootstock by culture of shoot apices and axillary buds., 2005, 43(6): 561-565.

[27] DOBRáNSZKI J, SILVA J A T D. Micropropagation of apple-a review., 2010, 28(4): 462-488.

[28] 謝璇, 許軻, 謝閩新, 朱元娣. 蘋果莖尖培養(yǎng)快繁體系的優(yōu)化. 植物生理學(xué)報(bào), 2015, 51(12): 2152-2156.

XIE X, XU K, XIE M X, ZHU Y D. Optimization of rapid micropropagation system of apple meristem-tip culture., 2015, 51(12): 2152-2156. (in Chinese)

[29] 陳銀全, 沈漢清, 柯昉. 水稻花培育種研究及新進(jìn)展. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1997, 12(2): 6-10.

CHEN Y Q, SHEN H Q, KE F. Studies and advances on rice anther culture breeding., 1997, 12(2): 6-10. (in Chinese)

[30] VANWYNSBERGHE L, KDE W, COART E, KEULEMANS J. Limited application of homozygous genotypes in apple breeding., 2005, 124(4): 399-403.

[31] OKADA H, OHASHI Y, SATO M, MATSUNO H, YAMAMOTO T, KIM H, TUKUNI T, KOMORI S. Characterization of fertile homozygous genotypes from anther culture in apple., 2009, 134(6): 641-648.

[32] CAO H, BISWAS MK, LU¨ Y, AMAR MH, TONG Z, XU Q, XU J, GUO W, DENG X. Doubled haploid callus lines of valencia sweet orange recovered from anther culture.,2011, 104(3):415-423.

[33] GERMANA MA, ALEZA P, CARRERA E, CHEN C, CHIANCONE B, COSTANTINO G, DAMBIER D, DENG XX, FEDERICI CT, FROELICHER Y, GUO W W, IBá?EZ V, JUáREZ S, KWOK K, LURO F, MACHADO M A, NARANJO M A, NAVARRO L, OLLITRAULT P, RíOS G, ROOSE M L, TALON M, XU Q, GMITTER JR F G. Cytological and molecular characterization of three gametoclones of Citrus clementina., 2013, 13(1): 129-150.

[34] LI Y, LI H, CHEN Z, JI L X, YE M X, WANG J, WANG L, AN X M. Haploid plants from anther cultures of poplar ()., 2013, 114(1): 39-48.

[35] CHEN Z J，HA M，SOLTIS D. Polyploidy: Genome obesity and its consequences., 2007, 174(4): 717-720.

[36] ADAMS K L, WENDEL J F. Novel patterns of gene expression in polyploidy plants., 2005, 21(10): 539-543.

[37] HA M, KIM E D, CHEN Z J. Duplicate genes increase expression diversity in closely related species and allopolyploids., 2009, 106(7): 2295-2300.

[38] RIDDLE N C, KATO A, BIRCHLER J A. Genetic variation for the response to ploidy change inL., 2006, 114(1): 101-111.

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Morphological Identification and Cultivation of New Germplasm of Apple Homozygous Genotypes

SHI JiangPeng1, ZHANG ChunFen2, DENG Shu2, HOU LiYuan3, XIAO Rong2, LI FuRong1, DONG YanHui3, NIE YuanJun4, WANG YiXue3, CAO QiuFen1,3

(1College of Biological Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006;2Pomology Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031;3Biotechnology Research Center, Shanxi Academy of Agriculture Sciences, Taiyuan 030031;4Agricultural resource and Economic Research Institute, Shanxi Academy of Agriculture Sciences, Taiyuan 030031)

【Objective】Homozygous genotype lines were obtained by anther culture of different apple pollen grains, so their botanical characteristics, biological characteristics, and their induced culture, root conditions were different. In this study, the ploidy, characteristics and root conditions of each line were observed and analyzed. Appropriate rooting conditions and good combinations of lines for selecting apple homozygous genotypes are of great significance to the innovation of apple germplasm resources.【Method】The homozygous genotype lines of ‘Gala’, ‘Fuji’ and ‘Red Star’ were obtained by apple anther culture. The ploidy level of homozygous genotype lines was studied using flow cytometry, root and leaf morphology and root conditions of each line were observed and recorded. 【Result】 A total of 32 homozygous lines were obtained by apple anther culture. The results of flow cytometry showed that there were 1 haploid, 1 triploids, 3 tetraploids and 27 diploids. The ploidy rate of 'Red Star' homozygous genotype was the highest, about 28.57%. The root rate, root length and root number of homozygous lines were affected by IBA concentration of rooting medium. When the concentration of IBA was 2-3 mg·L-1, the root features of apple homozygous lines were the best. The leaf number, root length, root number, plant height, leaf length/width and petiole length of each line were different. ‘Red Star’ homozygous genotype lines (DH2-1, DH0-3, DH0-4, DH0-7), ‘Fuji’ homozygous genotype line (DH1-3) and ‘Gala’ homozygous genotype lines (DH2-2, DH2-4, DH2- 12, DH2-20) have a good traits (plants are taller, roots are longer, and the number of roots and leaves are more). The survival rate of ‘Red Star’ homozygous genotype was the highest, about 28.57%. 【Conclusion】The main ploidy of apple homozygous genotype was diploid. Compared with the diploid lines, the haploid lines had a narrow leaf base, finer petiole, the leaf color and the leaf margin were shallow, while the polyploid lines showed wider leaf base, thicker petioles, leaf color and leaf edge serrated deep.

apple anther culture; ploidy analysis; homogeneous genotype; root hormone; trait analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.10.015

2017-10-11；

2017-12-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（31372033）、山西省國(guó)際合作項(xiàng)目（201603D421001）、山西省青年科技研究基金（201502115，201601D202068）、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（2016zyzx35）

石江鵬，E-mail：425323239@163.com。通信作者曹秋芬，E-mail：qiufengcao@163.com