秦素潔 ，趙玉芬 ，魏安智 3，李國松 4，趙京獻 ，郭偉珍

（1.河北省林業(yè)科學研究院，河北 石家莊 050061；2.河北省林木良種工程技術中心，河北 石家莊050061；3.西北農林科技大學，陜西 楊凌 712100；4.河北省林木種苗管理站，河北 石家莊 050081）

日本山椒Zanthoxylum piperitumDe Candolle為蕓香科花椒屬落葉小灌木，株高3 m 左右，雌雄異株，有些變異品種無刺或少刺。其果皮、青果、種子、枝干、嫩芽等均有重要的應用價值。日本山椒喜溫暖、濕潤的氣候條件，其耐寒性、耐熱性中等，抗病能力強，尤其具有較強的抗流膠病能力[1-2]。與國內的花椒品種相比，日本山椒優(yōu)良品種具有豐產與穩(wěn)產性好、抗逆性強和風味獨特、無皮刺、食用及藥用價值高等優(yōu)點[2]。河北省林業(yè)科學研究院自2000年以來陸續(xù)引進日本山椒品種7個，經過多年的引種試驗，確定了石家莊以南地區(qū)為日本山椒的適宜栽培區(qū)，山東半島及長江流域為其最佳栽培區(qū)域[1]。

花椒生產上以實生繁殖為主，導致了品種退化、產量降低、株間整齊度差等問題的出現。利用組織培養(yǎng)可以快速高效地育苗，從而為生產提供大量的優(yōu)質苗木。由于受引種的限制，日本花椒目前多采用組織培養(yǎng)、嫁接繁殖等方法[3]進行繁殖；郭偉珍曾對日本朝倉花椒進行了硬枝扦插育苗試驗[4]。有關花椒組織培養(yǎng)和再生的研究主要集中在利用花椒帶芽莖段進行快速繁殖上[3-11]，也有以花椒葉片、葉柄實現再生的研究報道[5,12-14]。但是，目前相關文獻報道的花椒葉片、葉柄離體培養(yǎng)均先通過誘導愈傷組織再進行芽的分化，且存在芽的誘導率低、產生芽的誘導時間長等問題。而對山椒的整個復葉離體高頻誘導不定芽直接再生的研究卻未見報道。為此，本文探討了一種簡便、高效的山椒復葉離體再生的方法和途徑，以期為山椒的組培快繁和遺傳育種提供技術支持，同時為其他樹種尤其是復葉樹種的離體高頻再生提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試外植體為‘琉錦山椒’Zanthoxylum piperitum‘Riyujin-Sansho’和‘花山椒’Zanthoxylum piperitum.Var.froma inerme試管苗的復葉。

圖1 復葉外植體接種狀態(tài)Fig.1 Compound leaf explants inoculation

1.2 方 法

1.2.1 葉片離體培養(yǎng)

取繼代培養(yǎng)30 d的試管苗中、上部1～3個幼嫩復葉，垂直葉軸橫切2刀刻傷，葉背面朝下，將整個復葉平鋪接種在不定芽再生培養(yǎng)基上（如圖1所示）。每處理10瓶，每瓶接種1個復葉，重復3次。不定芽再生誘導培養(yǎng)基設用如下幾種組合培養(yǎng)基：處理Ⅰ為MS＋6-BA 1.0 mg·L-1＋IBA 0.2 mg·L-1；處理Ⅱ為 MS ＋ 6-BA 1.5 mg·L-1＋IBA 0.2 mg·L-1；處理Ⅲ為 MS ＋ 6-BA 2.0 mg·L-1＋IBA 0.2 mg·L-1；處理Ⅳ為 MS ＋ 6-BA 3.0 mg·L-1＋IBA 0.2 mg·L-1。附加瓊脂 6 g·L-1，白砂糖 30 g·L-1，培養(yǎng)基的pH值為5.8。培養(yǎng)室溫度設為（25±2）℃，暗培養(yǎng)10 d后轉入光照培養(yǎng)，光照強度為2 000 lx，光照時間為16 h·d-1，在此條件下培養(yǎng)20 d，共培養(yǎng)30 d后調查芽的再生芽數量、再生率及生長情況。

采用SPSS數據處理軟件進行方差分析，采用Duncan新復極差法進行多重比較。

1.2.2 復葉葉軸刻傷

試驗中對整個葉軸進行橫切刻傷處理，將同一復葉葉軸上刻傷的程度分為深度（葉軸的2/3）和淺度（葉軸的1/3）兩種，以不刻傷為對照。每處理10瓶，每瓶接種1個復葉，重復3次，將‘琉錦山椒’接種在Ⅱ號培養(yǎng)基上，將‘花山椒’接種在Ⅰ號培養(yǎng)基上，其他培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)30 d后調查芽的再生數量和再生率。

1.2.3 繼代培養(yǎng)與生根培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)基設用MS＋6-BA0.5 mg·L-1＋IBA0.2 mg·L-1（即處理Ⅴ）。將復葉離體誘導的不定芽芽叢接種于Ⅴ號培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，每隔25～30 d繼代培養(yǎng)1次。

生根培養(yǎng)基設用1/4 MS＋IBA 0.2 mg·L-1＋NAA 0.3 mg·L-1＋2.5%蔗糖＋0.6%瓊脂（即處理Ⅵ）。當苗高為2.5～3.0 cm時，將其接種在Ⅵ號培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，每品種接種5瓶，每瓶10株，重復2次。培養(yǎng)的光照時間為10～12 h·d-1。共培養(yǎng)30 d后調查2個品種的生根率、生根條數及根長度。

2 結果與分析

2.1 不同品種對日本山椒試管苗離體復葉不定芽再生能力的影響

不同濃度的6-BA與IBA組合培養(yǎng)基處理對日本山椒離體復葉不定芽再生的影響情況如表1。由表1可知，不同品種試管苗離體復葉的不定芽再生能力有所不同。在供試的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號培養(yǎng)基上，‘琉錦山椒’誘導芽的再生率分別為83.33%、90%、66.77%、66.77%，每復葉再生芽的數量分別達到了4.17、5.42、5.80、3.61 個；而‘花山椒’誘導芽的再生率分別為80%、76.67%、66.33%、60.33%，每復葉再生芽的數量分別達到了4.16、3.47、2.90、2.26 個。‘琉錦山椒’的芽再生率和再生芽數量均高于‘花山椒’，這與品種的基因型有著明顯的關系。

表1 不同濃度的6-BA與IBA培養(yǎng)基處理對日本山椒離體復葉不定芽再生的影響?Table 1 Effect of different concentrations of 6-BA with IBA on the organ regeneration from in vitro cultured leaves of Z.piperitum DC.

2.2 不同濃度的6-BA與IBA組合培養(yǎng)基處理對日本山椒離體復葉不定芽再生能力的影響

不同濃度的6-BA和IBA組合培養(yǎng)基處理對日本山椒離體復葉的不定芽再生能力有著顯著的影響。當IBA的濃度為0.2 mg·L-1時，隨著6-BA濃度的增加，‘琉錦山椒’不定芽的再生率和再生芽數量均呈先升高后下降的變化趨勢。當6-BA濃度為1.0 mg·L-1時，‘琉錦山椒’的不定芽再生率為83.33%，每復葉再生芽的數量為4.17 個；當6-BA濃度達到1.5 mg·L-1時，芽再生率最高達到了90%，每復葉再生芽的數量達到5.42 個，芽再生率和再生芽數量均達了顯著性差異；當6-BA濃度增加到2.0 mg·L-1時，芽再生率迅速下降，而再生芽的數量達到最高值，與濃度為1.5 mg·L-1的6-BA處理的再生率間存在顯著性差異，但其再生芽數量間卻無顯著性差異；當6-BA濃度增加到3.0 mg·L-1時，芽再生率不再下降，但再生芽的數量卻明顯減少，和前3種濃度處理間存在5%的顯著性差異。隨著6-BA濃度的增加，誘導出的芽體逐漸變小。這一結果說明，6-BA濃度的過低或過高都會抑制日本山椒復葉的芽再生率和再生芽的數量，只有適宜的濃度才能達到高頻再生。方差分析結果表明，‘琉錦山椒’的最適誘導培養(yǎng)基為Ⅱ號組合培養(yǎng)基，即MS＋6-BA1.5 mg·L-1＋IBA0.2 mg·L-1。

隨著6-BA濃度的增加，‘花山椒’的再生芽率、再生芽數量、誘導的芽體大小均呈遞減趨勢。當6-BA濃度為1.0 mg·L-1時，其再生芽率與濃度為1.5 mg·L-1的6-BA處理間沒有顯著性差異，而與濃度分別為2.0、3.0 mg·L-1的6-BA處理間在5%水平上均有顯著性差異；其再生芽的數量高于其他3個處理，并達到了1%的極顯著性差異水平。分析結果表明，‘花山椒’的最佳誘導培養(yǎng)基為Ⅰ號培養(yǎng)基，即為MS＋6-BA 1.0 mg·L-1＋IBA 0.2 mg·L-1。

2.3 刻傷處理對日本山椒離體復葉不定芽再生能力的影響

將接種的2個品種復葉暗培養(yǎng)10 d轉為光培養(yǎng)5 d后，小葉片開始增厚變綠，部分小葉片翹離培養(yǎng)基面，接種20 d后，均開始有再生芽萌發(fā)，但2個品種的表現不同。‘琉錦山椒’深度切傷的斷面有少量綠色愈傷組織形成，但是沒有產生新的再生芽體；淺度刻傷的傷口自動愈合，沒有愈傷組織形成?！ㄉ浇贰疃惹袀臄嗝嫣幮纬闪溯^多的淡黃色愈傷組織，也沒有芽體生成。復葉的小葉葉腋處不具腋芽，僅有總葉柄葉腋處具腋芽[15]。但在植物生長調節(jié)劑調控和刻傷的刺激下，2個品種均在小葉葉腋處（小葉和葉軸連接處）直接產生了不定芽及芽叢（如圖2A與B所示）。刻傷處理對日本山椒離體復葉不定芽再生的影響情況見表2。表2表明，與不刻傷處理（對照）相比，刻傷處理對2個品種的復葉離體再生不定芽均有促進作用，但部分葉軸有隆起現象（如圖2C所示），仍能正常生長。

圖2 ‘琉錦山椒’和‘花山椒’的復葉芽體直接再生情況Fig.2 Regeneration bud of ‘Riyujin-Sansho’ and Var.froma inerme

表2 刻傷處理對日本山椒離體復葉不定芽再生的影響Table 2 Effects of carved injury on regeneration of leaves in vitro for Z.piperitum DC.

2.4 繼代培養(yǎng)與生根培養(yǎng)

2.4.1 繼代培養(yǎng)

將復葉離體誘導的不定芽芽叢接種至繼代增殖培養(yǎng)基（Ⅴ號培養(yǎng)基，即為MS＋6-BA 0.5 mg·L-1＋IBA 0.2 mg·L-1）上進行壯苗增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)25～30 d后繼代培養(yǎng)1次，結果分別如圖3A與B所示。

2.4.2 生根培養(yǎng)

將生長健壯、苗高在2.5～3.0 cm以上的嫩尖切下接種到Ⅵ號生根培養(yǎng)基上，在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，莖基部開始膨大，培養(yǎng)15 d開始有疏松的白色愈傷組織形成，培養(yǎng)20 d有根生成，并迅速伸長，但是，2個品種均存在生根不均勻的現象（如圖3 A與B所示）。

圖3 ‘琉錦山椒’和‘花山椒’的壯苗與增殖狀態(tài)Fig.3 Subculture of ‘Riyujin-Sansho’ and Var.froma inerme

日本山椒離體復葉不定芽的生根表現如表3。由表3可知，培養(yǎng)30 d后，‘琉錦山椒’的生根率、平均生根條數、平均最長根長均略高于‘花山椒’，這可能與品種特性及繼代分化培養(yǎng)過程中激素的積累有關。

圖4 ‘琉錦山椒’和‘花山椒’的生根狀態(tài)Fig.4 Roots of ‘Riyujin-Sansho’ and Var.froma inerme

2.5 煉苗與移栽管理

當根長至0.5～1.0 cm時，將試管苗移至煉苗室，打開瓶口煉苗4～5 d。當試管苗生長健壯、葉色轉濃綠時可將其移栽到育苗箱的蛭石中，注意洗凈培養(yǎng)基，用塑料薄膜覆蓋好，溫度控制為18～25 ℃，空氣相對濕度為85%。幼苗長出新根后逐步揭開薄膜，每隔7 d噴1次殺菌劑和營養(yǎng)液，移栽后的溫濕度管理是影響成活率的關鍵因素。移栽30 d統(tǒng)計得到，‘琉錦山椒’與‘花山椒’的移栽成活率分別達到了79.5%和76%，移栽40 d后可移栽上缽。

3 結論與討論

日本花椒（山椒）雌雄異株，不同品種之間以及雌株與雄株之間的基因型和表現型均有較大差異。本試驗以‘琉錦山椒’和‘花山椒’為材料，在培養(yǎng)過程中芽的誘導率和再生芽數量及生長表現也有很大差異，其受基因型的影響較大，相對于‘琉錦山椒’而言，‘花山椒’所需激素水平要低些。

以往的花椒葉片離體培養(yǎng)研究中報道，不論是田間幼葉還是試管苗幼葉，大多采用了低細胞分裂素（6-BA 0.3 ～ 0.5 mg·L-1或 TDZ 0.03 mg·L-1）與低濃度生長素（2,4-D 0.2～0.5 mg·L-1、NAA 0.05～0.20 mg·L-1）配比的培養(yǎng)基。姜長陽等人[12]報道了以花椒幼葉為外植體，以MS＋BA 0.5 mg·L-1＋2-4D 0.2 mg·L-1＋ NAA 0.05 mg·L-1和 MS ＋ BA 0.3 mg·L-1＋ NAA 0.1 mg·L-1培養(yǎng) 120 ～ 130 d 后愈傷組織分化芽的誘導率達到10%。王港等人[13]以‘鳳椒’嫩葉為試材，以MS＋2,4-D 0.5 mg·L-1＋BA 0 .5 mg·L-1為培養(yǎng)基，結果產生的愈傷組織誘導率達到90%；在MS＋TDZ 0.03 mg·L-1＋BA 0.1 mg·L-1中培養(yǎng) 60 d后其愈傷組織分化芽的誘導率達70%。曾曉芳分別以日本‘朝倉花椒’試管苗的葉片、葉柄為試材，以WPM＋6-BA 0.5 mg·L-1＋NAA 0.2 mg·L-1為最佳培養(yǎng)基，葉片的愈傷組織分化率最高僅為2.52%，葉柄的誘導分化率最高為60%，且培養(yǎng)60 d才分化出芽，他們因此認為，葉片不適合作為外植體進行培養(yǎng)[15]。

有些研究者認為，細胞分裂素的濃度對增值系數的影響存在極顯著差異[16-19]。王瑞等人認為，細胞分裂素濃度越高，增值系數則越大[16]；而秦新惠等人認為，隨著6-BA質量濃度降低，增值系數越來越高，降至0.1～0.5 mg·L-1，增值系數達到最大[17]；陳容等人、暴甜等人的研究結果均表明，6-BA濃度過高或過低均不利于不定芽的形成和增殖[18-19]，這與本試驗結果“6-BA（細胞分裂素）濃度過低或過高均不利于芽的再生”一致。當6-BA 1.0 ～ 1.5 mg·L-1與 IBA 0.2 mg·L-1的配比為5.0～7.5∶1.0時，培養(yǎng)30 d，‘琉錦山椒’與‘花山椒’的再生芽誘導率分別達到90%和80%，每復葉的再生芽數量分別達到5.42和4.16 個，高于王平等人[20]對蜆殼花椒試管苗葉片的試驗結果（經愈傷組織誘導后，在6-BA 0.5 mg·L-1＋NAA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基上，不定芽再生率為61%，再生芽數量達到3.2個）；李曉東等[21]選取胡椒木當年生枝條的幼嫩葉片作為外植體，將其接種在MS ＋ 6-BA 1.0 mg·L-1＋ NAA 0.7 mg·L-1，經過 6 周的培養(yǎng)，芽的誘導分化率最高達到91.7%。本試驗結果與李曉東等人的誘導率相近，但芽的誘導時間比其縮短了近2周。

前人對蘋果試管苗的研究結果表明，不同切傷方法對葉片發(fā)生不定芽能力的影響沒有明顯差異，而切傷與不切傷對葉片不定芽的發(fā)生能力卻有很大影響，從再生率、每葉發(fā)生的不定芽數、再生力等方面看，切傷處理的均比不切傷的高，這說明切傷是促進不定芽發(fā)生的重要刺激因素[22]。柴慈江等人研究了珠美海棠葉片不同的切傷方式，結果表明，以橫切主脈處理的切口處芽的再生率為最高[23]。本試驗在葉軸上刻傷后，對不定芽的再生有明顯的刺激作用，提高了芽的再生率和再生芽數量，這與孫清榮在蘋果葉片上的研究結論一致[22]。

離體培養(yǎng)過程中出現了部分小葉和部分葉軸拱起而脫離了培養(yǎng)基表面的現象，但是，再生芽生長沒有受到影響，部分葉軸拱起可能是由切傷和葉片的增厚所致，但不影響營養(yǎng)物質的運輸。本試驗中還出現了另外一種現象，即葉軸的中后端比前端容易誘導出芽，這可能與復葉不同部位的組織成熟度有關。

總之，以‘琉錦山椒’與‘花山椒’試管苗復葉離體培養(yǎng)，直接誘導不定芽的再生體系，不僅越過愈傷組織階段，且再生率及再生芽數量均較高，大大縮短了外植體的出芽時間。以試管苗復葉為外植體，取材數量多、便捷、極大地降低了外植體的污染率，經過直接器官發(fā)生途徑誘導分化的不定芽，轉接到壯苗繼代增殖培養(yǎng)基上能正常生長發(fā)育，且能在生根培養(yǎng)基中生根。山椒復葉離體誘導不定芽的直接再生是山椒離體高頻再生的新途徑。本文僅對日本山椒的2個品種的復葉進行了離體培養(yǎng)和再生試驗，而對其他品種特別是國內花椒品種的相關研究尚需深入展開。

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