段珍珍DUAN Zhen-zhen 周才瓊,2 -,2 袁 敏 常 榮

(1. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2. 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

枇杷[Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl]為薔薇科(Rosaceae)蘋果亞科枇杷屬(EriobotryaLindl.)植物，果肉富含蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、富馬酸及草酰乙酸等[1]，含不同種類的胡蘿卜素、三萜類和多酚類等成分[2]。枇杷含水量高，不耐貯藏，鮮果貨架期短，因此其深加工備受關(guān)注。枇杷深加工主要集中在枇杷飲料[3-4]和枇杷果酒[5-6]的研發(fā)。

果醋主要以水果或果品加工下腳料為原料，經(jīng)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵釀制而成。果醋有很多種類，有用于烹飪調(diào)味，也有用于飲用保健，其中應(yīng)用于烹飪的酸度最高達5%，飲料果醋的酸度較低(為1%)[7]?，F(xiàn)有報道集中于果醋的工藝研究，大多在釀造出果醋原醋基礎(chǔ)上，調(diào)配大量果汁、蜂蜜、添加劑等兌制而成酸甜可口的果醋飲品[8-9]。有少量報道了研制有明確用途的果醋，如調(diào)味型蘋果醋、葡萄醋[10-11]和保健型沙棘果醋[12]。果醋進一步的研究包括雪利醋功能作用[13]、柿果醋發(fā)酵過程中香氣成分和有機酸的動態(tài)變化[14]及果醋陳化后熟等[15]。這些研究極少涉及果醋醋酸發(fā)酵最重要的基礎(chǔ)——醋基的研究，枇杷果醋更少見報道。作為后續(xù)醋酸發(fā)酵的醋基，其有機酸含量及組成極大程度影響果醋的風味品質(zhì)。因此酒精發(fā)酵工藝的選擇是優(yōu)良品質(zhì)的保證，作為醋基的枇杷酒中的有機酸主要來自枇杷果實、工藝需求的外源添加酸和酒精發(fā)酵過程中酵母代謝產(chǎn)物，是枇杷醋風味品質(zhì)構(gòu)成基礎(chǔ)。為此，本研究采用紅肉枇杷為試驗材料，以有機酸組成和含量、枇杷醋酒精發(fā)酵相關(guān)特征為依據(jù)，研究酵母種類及接種量、發(fā)酵pH、發(fā)酵溫度和加糖量等對枇杷醋醋基酒精含量和有機酸的影響，通過單因素和響應(yīng)面試驗探究枇杷醋醋基的最佳釀造工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

紅肉枇杷：金華1號，西南大學農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)研究室科研基地；

白砂糖：重慶市北碚區(qū)天生街永輝超市；

安琪釀酒干酵母：分別為Ya、Yb和Yc，安琪酵母股份有限公司；

帝伯仕釀酒干酵母：Yd，煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

1.1.2 主要試劑

果膠酶：酶活力≥50萬 U/g，成都科龍化工試劑廠；

檸檬酸、檸檬酸鉀、鄰苯二甲酸氫鉀等：分析純，成都科龍化工試劑廠；

磷酸二氫鉀：優(yōu)級純，成都科龍化工試劑廠；

異抗壞血酸：純度99%，瑞士阿達瑪斯試劑；

甲醇：色譜純，天津四友精細化學品有限公司；

檸檬酸標準品(純度≥97.0%)、草酸標準品(純度≥99.5%)：中國食品藥品檢定研究院；

L-蘋果酸標準品、L-酒石酸標準品：純度HPLC ≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

琥珀酸標準品(純度≥99.5%)、乳酸標準品(純度≥91.2%)：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

乙酸標準品：純度≥99.8%，美國Sigma-aldrich公司。

1.2 主要設(shè)備

pH計：PHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

折射儀：WZS手持式，上海儀電物理光學儀器有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：HH.B11.500-BS-II型，上海躍進醫(yī)療器械廠；

恒溫培養(yǎng)振蕩器：ZWY-2102C型，上海智誠分析儀器制造有限公司；

電子天平：FA2004A型，上海精天電子儀器有限公司；

高效液相色譜儀：LC-2010AD型，日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵基本工藝過程及操作要點

(1) 護色：成熟枇杷果實洗凈、去核及果蒂，0.05%亞硫酸氫鈉溶液在(25±3) ℃浸泡30 min護色，瀝水備用。

(2) 打漿：護色后枇杷果加入0.05%亞硫酸氫鈉和0.01% 異抗壞血酸進行打漿。

(3) 酶解：將枇杷果打漿后加入果膠酶0.18 g/kg，調(diào)pH至3.5， 于35 ℃酶解8 h(出汁率90%)，85 ℃滅菌15 min，用保鮮膜將滅菌后的枇杷果汁封口并迅速冷卻至室溫，得枇杷果汁(可溶性固形物8.2%，總酸0.3%)。

(4) 酵母活化及篩選：用5%的糖水溶解酵母，38 ℃水浴活化，30 min后有細膩泡沫出現(xiàn)為活化成功。然后選用1.1.1 所列4種酵母分別接種，控制糖度在20%，pH 3.5，25 ℃ 恒溫發(fā)酵7 d后，測定各指標，選擇適合枇杷醋酒精發(fā)酵(醋基)的菌種。

(5) 發(fā)酵：調(diào)整枇杷果汁pH和初始糖度，將酵母活化后接種，在一定溫度下發(fā)酵7 d檢測分析。

1.3.2 枇杷醋酒精發(fā)酵工藝單因素試驗

(1) 發(fā)酵pH對枇杷醋酒精發(fā)酵的影響：固定反應(yīng)條件為枇杷果汁糖度20%、酵母接種量0.10%、發(fā)酵溫度25 ℃、發(fā)酵時間7 d，考察發(fā)酵pH(3.0，3.5，4.0，4.5，5.0)對枇杷醋酒精發(fā)酵的影響。

(2) 酵母菌接種量對枇杷醋酒精發(fā)酵的影響：固定反應(yīng)條件為枇杷果汁糖度20%、發(fā)酵pH 3.5、發(fā)酵溫度25 ℃、發(fā)酵時間7 d，考察酵母接種量(0.05%，0.1.0%，0.40%，0.70%，1.00%)對枇杷醋酒精發(fā)酵的影響。

(3) 發(fā)酵溫度對枇杷醋酒精發(fā)酵的影響：固定反應(yīng)條件為枇杷果汁糖度20%、發(fā)酵pH 3.5、酵母接種量0.10%、發(fā)酵時間7 d，考察發(fā)酵溫度(20，24，28，32 ℃)對枇杷醋酒精發(fā)酵的影響。

(4) 初始糖度對枇杷醋酒精發(fā)酵的影響：固定反應(yīng)條件為發(fā)酵pH 3.5、酵母接種量0.10%、發(fā)酵溫度25 ℃、發(fā)酵時間7 d，考察初始糖度(12%，16%，20%，24%)對枇杷醋酒精發(fā)酵的影響。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化枇杷醋醋基發(fā)酵條件 在單因素試驗基礎(chǔ)上，固定初始糖度16%，研究發(fā)酵溫度、酵母接種量和初始pH對枇杷醋醋基發(fā)酵的影響，以發(fā)酵酒精度和總有機酸含量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計，優(yōu)化發(fā)酵最佳工藝。

1.3.4 有機酸組成分析 根據(jù)文獻[16]，修改如下：

(1) 標準溶液制備：準確配制各有機酸標準母液，分別稱取蘋果酸標準品91.7×10-3g，酒石酸標準品63.6×10-3g，草酸標準品105.7×10-3g，檸檬酸標準品130.2×10-3g，乳酸標準品99.8×10-3g，乙酸標準品0.5 mL，分別定容至5 mL，稱取琥珀酸標準品257.3×10-3g，定容至10 mL。根據(jù)樣品中有機酸含量將有機酸標準母液稀釋成不同濃度混合有機酸標準工作液，用0.45 μm水相濾膜過濾后進樣，確定各有機酸出峰時間。將稀釋成不同濃度的混合有機酸標準工作液進樣分析，有機酸標準曲線橫坐標為濃度，縱坐標為峰面積，進行線性回歸分析。

(2) 樣品溶液制備：取樣品于4 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋5倍，用0.45 μm水相濾膜過濾，進樣分析，計算各有機酸含量。

(3) HPLC分析：Hypersil ODS(C18)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫28 ℃；檢測波長210 nm；流速0.6 mL/min；進樣量15 μL；流動相為99%的用磷酸調(diào)節(jié)pH為 2.50的0.06 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液和1%的甲醇溶液。

1.3.5 其他指標

(1) 酒精度：按GB/T 15038—2006的酒精計法執(zhí)行。

(2) 可溶性固形物(TSS)：按GB/T 15038—2006的糖度計直接測定執(zhí)行。

(3) pH：按GB/T 15038—2006的pH計法執(zhí)行。

(4) 失重：按式(1)計算。

m=m1-m2，

(1)

式中：

m——失重，g；

m1——開始發(fā)酵時發(fā)酵液及發(fā)酵裝置的總重量，g；

m2——發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液及發(fā)酵裝置的總重量，g。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 試驗平行3次，結(jié)果以平均數(shù)±標準偏差表示；采用SPSS 22.0和Excel進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，Duncan法做多重比較，分析數(shù)據(jù)間的差異；用Design-expert 8.0.6設(shè)計響應(yīng)面試驗方案及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷鮮果有機酸組成分析

酶解前枇杷果漿有機酸含量組成分析見表1，顯示其主要由蘋果酸組成，占總有機酸含量的83.81%，與文獻[17]報道蘋果酸是枇杷主要的有機酸相符，其次是琥珀酸和酒石酸，有少量乙酸、檸檬酸和草酸。

2.2 枇杷醋酒精發(fā)酵酵母的篩選

由表2可知，各處理樣品酒精度、TSS及pH值比較接近，各酵母發(fā)酵后酒精度在11.4%～12.2%Vol，均遠高于后續(xù)醋酸發(fā)酵時所需酒精量，但采用高糖發(fā)酵可更好地觀察酵母菌對糖的利用情況，有一定參考價值。有機酸組成分析見表3，與枇杷鮮果有機酸組成含量相比(表1)，蘋果酸快速下降，含量僅為鮮果的47.4%～53.2%，其他各處理有機酸含量急劇上升，乳酸和乙酸占比較高，表明酵母發(fā)酵顯著改變了有機酸組成及酸味特點。試驗各組蘋果酸、乳酸、酒石酸和草酸有顯著差異(P<0.05)。乳酸、乙酸、蘋果酸和檸檬酸分別占總有機酸含量的24.96%～29.33%，22.89%～25.05%，15.14%～16.51%，12.15%～14.02%，乳酸和乙酸占比較高，Yb和Yd總有機酸含量顯著高于Ya和Yc，Yb中乙酸、檸檬酸和琥珀酸含量最高，Yd中乳酸、蘋果酸和酒石酸最高，但Yb酸味感更柔和圓潤。綜合考慮，選用Yb作為枇杷醋酒精發(fā)酵最優(yōu)發(fā)酵菌種。

表1 枇杷鮮果有機酸組成分析Table 1 Analysis of organic acid composition of fresh loquat

表2 不同釀酒酵母對發(fā)酵的影響Table 2 Effects of different yeast with fermentation

表3不同酵母接種發(fā)酵對有機酸含量的影響?

Table 3 Effects of different yeast on organic acids content g/L

酵母草酸酒石酸蘋果酸乳酸乙酸檸檬酸琥珀酸合計 Ya0.275±0.007ab0.863±0.023bc2.606±0.057b4.526±0.524ab3.781±1.151a2.181±1.001a1.929±0.286a16.160±0.702b Yb0.280±0.008a0.909±0.025ab2.763±0.021ab4.555±0.100ab4.571±2.013a2.559±0.974a2.612±0.409a18.249±1.389a Yc0.261±0.009b0.844±0.022c2.634±0.082b4.071±0.574b3.875±1.052a1.965±0.680a2.309±0.797a15.961±0.726b Yd0.287±0.013a0.952±0.035a2.929±0.205a5.440±0.537a4.245±1.624a2.253±0.895a2.439±0.499a18.544±1.326a

? 同列不同小寫字母表示不同發(fā)酵菌種的均值差異顯著(P<0.05)。

2.3 枇杷醋酒精發(fā)酵單因素試驗

2.3.1 溫度對枇杷醋酒精發(fā)酵的影響 由表4可知，24，28 ℃ 下發(fā)酵時酒精度較高，失重較多，發(fā)酵較完全；發(fā)酵后的殘?zhí)请S溫度上升而增加。有機酸組成分析見表5，與枇杷鮮果有機酸組成(表1)相比，蘋果酸略有下降，其他各有機酸均不同程度增加。低溫發(fā)酵利于檸檬酸積累，高溫發(fā)酵利于乳酸積累(P<0.05)。檸檬酸有愉快清新的酸感，酸味爽快，后苦時間短[18]。蘋果酸保持穩(wěn)定，與Kandylis等[19]報道溫度會影響蘋果酸的分解不符，可能與枇杷果汁中蘋果酸的存在形式有關(guān)。感官品評顯示在較低溫度下發(fā)酵的枇杷醋醋基酸味感更均衡柔和，綜合考慮選取24 ℃為最適發(fā)酵溫度。

表4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響Table 4 Effects of different fermentation temperatures with fermentation

表5 發(fā)酵溫度對有機酸含量的影響?Table 5 Effects of different fermentation temperatures with organic acids contents g/L

? 同列不同小寫字母表示不同發(fā)酵溫度的均值差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 酵母接種量對枇杷醋酒精發(fā)酵的影響 由表6可知，隨酵母接種量的增加酒精度呈先增后降趨勢。0.05%和0.10% 處理酒精度和失重相對較高，且0.10%發(fā)酵殘?zhí)潜?.05% 低。有機酸組成分析見表7，與枇杷鮮果有機酸組成(表1)相比，蘋果酸下降，乳酸、檸檬酸、琥珀酸和乙酸均增加較多。試驗各處理總酸含量沒有差異，較低接種量有利于乳酸和蘋果酸積累(P<0.05)。綜合考慮以0.10%為最適酵母接種量。

2.3.3 初始pH對枇杷醋酒精發(fā)酵的影響 由表8可知，隨pH升高酒精度先升后降，pH 3.5時，酒精度最高且殘?zhí)亲畹?。有機酸組成分析見表9，與枇杷鮮果有機酸組成(表1)相比，蘋果酸有所下降，乙酸和乳酸增加較多。隨發(fā)酵pH升高，蘋果酸和乳酸顯著增加(P<0.05)。乳酸是酒精發(fā)酵產(chǎn)物，由丙酮酸還原或蘋果酸轉(zhuǎn)化而成，有報道[20]果汁pH在4.0～6.0時可提高乳酸含量。pH 3.5時檸檬酸最低，這與pH調(diào)節(jié)有關(guān)，其他處理均添加了外源檸檬酸或檸檬酸鉀。pH 3.5處理酸味感更均衡柔和，為最適發(fā)酵pH值。

表6 酵母接種量對發(fā)酵的影響Table 6 Effects of different yeast inoculation with fermentation

表7 酵母接種量對有機酸含量的影響?Table 7 Effects of different yeast inoculation with organic acids contents g/L

? 同列不同小寫字母表示不同發(fā)酵菌種的均值差異顯著(P<0.05)。

表8 初始pH對發(fā)酵的影響Table 8 Effects of different pH with fermentation

表9 發(fā)酵pH對有機酸含量的影響?Table 9 Effects of different pH with organic acids contents g/L

? 同列不同小寫字母表示不同發(fā)酵pH的均值差異顯著(P<0.05)。

2.3.4 初始糖度對枇杷醋酒精發(fā)酵的影響 由表10可知，隨初始糖度升高，酒精度、失重和殘?zhí)橇吭龈摺Ｓ袡C酸分析見表11，與枇杷鮮果有機酸組成(表1)相比，蘋果酸快速下降，檸檬酸增加較多，其他有機酸均不同程度增加。乳酸和乙酸含量隨初始糖度升高顯著增加(P<0.05)。糖度越高，蘋果酸含量越低，乳酸含量越高，推測蘋果酸轉(zhuǎn)化成了乳酸，同時參與了蘋果酸-酒精發(fā)酵，釀酒酵母能分解10%～30%的蘋果酸來生成酒精[21]，從而造成蘋果酸的消耗。隨初始糖度升高，總有機酸含量升高。但糖度是影響酒精度最重要的因素，考慮后續(xù)醋酸發(fā)酵中醋酸耐酒精度在8%Vol左右，因此選擇16%的糖度作為枇杷醋酒精發(fā)酵糖度。

表10 初始糖度對發(fā)酵的影響Table 10 Effects of different initial sugar with fermentation

表11 初始糖度對有機酸含量的影響?Table 11 Effects of different initial sugar with organic acids contents g/L

? 同列不同小寫字母表示不同發(fā)酵初始糖度的均值差異顯著(P<0.05)。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化枇杷醋醋基發(fā)酵工藝

2.4.1 試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計了響應(yīng)面優(yōu)化因素和水平，見表12。以發(fā)酵后枇杷醋醋基酒精度和總有機酸含量為響應(yīng)值，結(jié)果見表13。

表12 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素水平表Table 12 Factors and levels of response surface optimization test

表13 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果Table 13 The design and results of response surface optimization test

2.4.2 以酒精度為響應(yīng)值分析結(jié)果 對表13酒精度進行二次線性回歸擬合，得回歸方程：

Y1=7.96+0.025A-0.12B-0.13C+0.075AB-0.13AC+0.17BC-0.14A2+0.057B2+0.16C2。

(2)

2.4.3 以有機酸含量為響應(yīng)值的分析 對表13有機酸含量進行二次線性回歸擬合，得回歸方程為：

Y2=18.04-0.068A-0.51B+3.11C+6.775E-003AB-0.45AC-2.25BC-2.01A2-0.20B2+0.38C2。

(3)

表14 酒精度回歸模型方差分析?Table 14 Analysis of variance of alcohol regression model

表15 有機酸回歸模型方差分析?Table 15 Analysis of variance of organic acid regression model

2.5 枇杷醋酒精發(fā)酵最佳工藝優(yōu)化及驗證

響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果顯示酒精含量的影響順序是接種量=pH>溫度，有機酸含量的影響順序是pH>接種量>溫度；考慮較高的酒精含量是后續(xù)醋酸發(fā)酵制備枇杷醋的基礎(chǔ)，有機酸含量主要受pH的影響，以及在單因素試驗中已經(jīng)綜合考慮了有機酸組成。因此，最終以酒精含量為依據(jù)，采用Design-expert 8.0.6對枇杷醋酒精發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，得到優(yōu)化條件：發(fā)酵溫度25.06 ℃，酵母接種量0.05%，初始pH 3.5，模型預測的酒精度為8.61%Vol，總有機酸含量為13.319 g/L。根據(jù)實際條件，將發(fā)酵溫度設(shè)為25 ℃，其他條件同優(yōu)化結(jié)果，經(jīng)3次平行驗證實驗，實際測得酒精度平均為8.50%Vol，與預測值相對誤差1.28%，總有機酸含量平均為12.228 g/L，與預測值相對誤差8.19%。說明該數(shù)學回歸模型可靠，能很好地預測試驗結(jié)果。

經(jīng)與酶解后枇杷果汁有機酸組成進行比較分析，結(jié)果見表16，枇杷果汁主要酸味特征成分是蘋果酸，占總味覺強度的73.0%，經(jīng)酒精發(fā)酵后有機酸含量及組成發(fā)生了巨大變化，蘋果酸占總味覺強度比為33.1%，檸檬酸和草酸含量下降，合計味覺強度從枇杷果汁的13.3降至4.6；乳酸、乙酸和琥珀酸均增加，合計味覺強度從枇杷果汁的59.4升至377.0；酒石酸略有下降。這可能與有機酸在發(fā)酵過程中參與TCA循環(huán)、乙醛酸循環(huán)、蘋果酸-乳酸、蘋果酸-乙醇和蘋果酸-琥珀酸等代謝反應(yīng)有關(guān)[22-23]。

表16枇杷醋醋基中有機酸形成及味覺強度?

Table 16 The content of organic acids and its taste intensity index with base wine of loquat vinegar

有機酸枇杷果汁(酶解后)含量/(g·L-1)味覺強度枇杷醋醋基含量/(g·L-1)味覺強度蘋果酸8.181±0.037303.05.460±0.119202.2 乳酸 0.408±0.18422.73.186±0.242177.0 乙酸 0.312±0.04926.01.774±0.075147.9 琥珀酸0.257±0.06410.71.250±0.23452.1 酒石酸0.588±0.00139.20.417±0.01627.8 檸檬酸0.201±0.01010.60.075±0.0114.0 草酸 0.310±0.0092.70.065±0.0040.6 合計 10.257±0.129414.912.228±0.421611.6

? 味覺強度=有機酸濃度/有機酸味覺閾值[24-25]。

枇杷果汁和酒精發(fā)酵后的醋基蘋果酸、乳酸、乙酸和琥珀酸合計占總酸比分別為89.3%和95.4%，味覺強度合計占比分別為87.5%和94.7%，是枇杷醋醋基的重要酸味成分。蘋果酸味爽快稍苦，乳酸稍有澀感而尖利，醋酸帶刺激性，琥珀酸味感既苦又咸并帶一絲鮮味，可使滋味濃厚，加上檸檬酸等共同構(gòu)成了枇杷醋醋基酸味特征，為后續(xù)醋酸發(fā)酵后的枇杷醋成品酸味感提供基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

枇杷醋酒精發(fā)酵優(yōu)化工藝條件為：發(fā)酵溫度25 ℃、酵母接種量0.05%、pH 3.5，在此條件下得到枇杷醋醋基酒精度8.50%Vol，有機酸含量12.228 g/L。經(jīng)對枇杷果汁和枇杷醋醋基有機酸組成及含量變化進行比較顯示，蘋果酸是枇杷果汁主要的有機酸。枇杷醋醋基特征性有機酸為蘋果酸、乳酸、乙酸和琥珀酸，合計占總有機酸的95.4%，構(gòu)成枇杷醋醋基酸味味覺強度的94.7%，它們是后續(xù)醋酸發(fā)酵后構(gòu)成枇杷醋果酸味的重要品質(zhì)成分。

有關(guān)果醋酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化中的有機酸及菌種篩選方面未見相關(guān)報道，因此對于果醋的酒精發(fā)酵工藝有關(guān)菌種篩選條件、醋基風味品質(zhì)與最終果醋風味形成等還需要更多的研究支持。

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