張宇哲 曹秋云 楊海龍 趙 鵬 沈迪文

阿爾茨海默病患者(Alzheimer’s Disease，AD)屬于發(fā)病率較高的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，是導(dǎo)致老年癡呆性疾病發(fā)生的主要因素[1]。據(jù)國際阿爾茨海默病協(xié)會(ADI)發(fā)布的數(shù)據(jù)，目前全球已經(jīng)超過3 500萬人罹患該疾病，截至2050年預(yù)計AD可能增加至1.15億人次[2]。雖然目前針對AD的發(fā)病機制的研究眾多，然而其發(fā)病機制仍未完全明確，加之目前針對該疾病尚未制定出有效的防治措施，故而該疾病成為威脅人類健康的“第三大殺手”，僅次于惡性腫瘤和心腦血管類疾病[3]。目前的研究證實，AD的特征性病理改變是患者大腦皮層和海馬內(nèi)的β淀粉樣蛋白沉積，導(dǎo)致老年斑的形成和tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)，從而導(dǎo)致腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元細胞的減少[4，5]。也有學(xué)者認為，該疾病是由血管系統(tǒng)紊亂引起腦循環(huán)低灌注導(dǎo)致的認知功能受損所導(dǎo)致的[6～8]。核磁共振成像的主要優(yōu)勢在于其多參數(shù)、多方位成像，且組織對比分辨率高，對細小結(jié)構(gòu)的萎縮方面也能清晰顯示，故而在AD的臨床診斷中廣泛應(yīng)用MRI影像學(xué)檢查并取得了較高的診斷效果[9]。臨床研究證實，海馬是AD患者的主要病理學(xué)改變處，要想通過影像學(xué)手段檢測AD大腦特征性的病理改變，即淀粉樣斑塊，需要從淀粉樣斑塊的核心成分Aβ的神經(jīng)化學(xué)特征入手[10]。目前的研究證實，除了Aβ還有其他許多成分沉積，例如鐵，能夠?qū)е掳邏K相關(guān)的神經(jīng)毒性。MicroRNAs(miRNAs)屬于非編碼單鏈小分子RNA，共包含19～24個核苷酸[11]，其在細胞的生長、發(fā)育、分化以及凋亡過程中扮演重要角色[12]。miRNAs在神經(jīng)元發(fā)生、學(xué)習(xí)、記憶及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中扮演著重要的角色，直接或間接參與許多與AD發(fā)病相關(guān)基因的表達調(diào)控[13]。目前有研究證實，miRNAs可通過調(diào)節(jié)β淀粉樣蛋白代謝、Tau磷酸化等AD病理發(fā)生過程中相關(guān)基因的表達[14]。本研究擬以AD患者和健康對照老年人為研究對象，分別對其大腦進行核磁共振成像和血清標(biāo)志物研究，探討兩者的相關(guān)性，以期在AD患者疾病初期進行有效診斷，提高AD早期診斷率及治療效果。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2011年9月～2015年7月間南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院收治的108例年齡大于65歲的AD患者為研究組。選取105位年齡大于65歲的健康老年人為對照組。研究組男55例，女53例；平均年齡(71.74±5.51)歲；平均體質(zhì)量(73.38±6.39)kg。對照組男53例，女52例；平均年齡(72.43±5.25)歲；平均體質(zhì)量(71.54±6.51)kg。兩組患者的性別構(gòu)成比、年齡、體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 磁共振成像(MRI)檢查[15]應(yīng)用磁共振成像掃描儀(SIEMENS公司，型號：3.0T MAGNETOM Trio)對兩組受試者實施的頭顱成像掃描，頭顱8通道相控陣列正交線圈。兩組受試者全部進行橫軸位T1WI、T2WI、FLAIR、DWI。然后以3.5 ml/s的速度予靜脈團注0.2 mmol/kg對比劑釓噴替酸普甲胺(Gd-DTPA)，注射完成后立即以相同流速注等體積生理鹽水沖管。然后先后行DSC灌注成像掃描，T1WI橫軸位、冠狀位和矢狀位增強掃描。掃描參數(shù)主要包括：T1WI：TR 為250 ms，TE 為2.5 ms；T2WI：TR為 6 000 ms，TE為93 ms；掃描層厚度、層間距分別為5 mm、1.25 mm，矩陣為128×128，F(xiàn)OV 為230 mm×230 mm。DWI應(yīng)用平面回波成像序列，TR 為7 000 ms，TE為80 ms，b值分別取 0 s/mm2以及1 000 s/mm2；DSC-PWI應(yīng)用單次激發(fā)梯度回波-平面回波成像序列，TR為1 400 ms、TE為 32 ms，F(xiàn)OV 為230 mm×230 mm，矩陣為128×128，層數(shù)為18層， 層厚、層間隔分別為5 mm、1.25 mm。將采集的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Siemens后處理工作站，通過頭部核磁系統(tǒng)軟件的計算，自動得出每一層的淀粉樣斑塊，然后乘以掃描層厚，得到各層的淀粉樣斑塊體積，進而相加得到淀粉樣斑塊總體積[16]。

1.2.2 血清標(biāo)志物的檢測[17]

1.2.2.1 血清miRNA的提取 (1)血清樣本采集：收集研究組和對照組受試者血液樣本，在室溫下采用離心機10 000 r/min離心5 min，收集血清置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)血清miRNA的提取：將收集的患者血清，按照體積比2∶1加入Trizol溶劑，充分震蕩，于室溫條件下靜置15 min。加入氯仿(體積為20%)，充分震蕩，于室溫條件下靜置15 min。采用離心機10 000 r/min離心15 min(4℃)，收集上清。加入等體積水飽和酚，震蕩后采用離心機10 000 r/min離心15 min(4℃)。收集上清，加入50%體積的水飽和酚，震蕩均勻后采用離心機10 000 r/min離心15 min(4℃)。收集上清，加入等體積異丙醇，震蕩均勻后冰上沉淀1 h，采用離心機10 000 r/min離心30 min(4℃)。棄上清后，采用3 mL 75%乙醇和3 mL Trizol先后逐個清洗沉淀。當(dāng)沉淀干燥后，加入LDEPC水50 u以溶解RNA，對樣本總RNA濃度進行測定。

1.2.2.2 Hiseq測序 采用Illumina HiSeqTM 2000高通量測序技術(shù)對AD患者以及正常對照組受試者血清中全部miRNAs的表達譜進行定量分析。

1.2.2.3 血清miRNA提取(實時定量PCR) 采用Trizol and miRNeasy mini kit試劑盒進行血清中總RNA的提取。RNA的純度采用260 nm和280 nm處吸光度值的比值(A260/A280)表征，1.8～2.1為質(zhì)量合格。

1.2.2.4 實時定量PCR(qRT-PCR) 根據(jù)文獻，miRNA不具有PolyA結(jié)構(gòu)，因此加尾反應(yīng)應(yīng)于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前進行，采用Universal Adaptor Primer進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，隨后進行定量反應(yīng)。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究中應(yīng)用McDonald法對qRT-PCR結(jié)果進行標(biāo)準(zhǔn)化，內(nèi)參為miR-cel-39，相對表達量采用2-ΔΔCt進行表征。應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)和百分率(%)表示，采用趨勢χ2檢驗推斷AD患者淀粉樣斑塊的對比增強磁共振成像與淀粉樣變的血清標(biāo)志物的相關(guān)性和相關(guān)系數(shù)，采用Pearson相關(guān)系數(shù)對變量之間的相關(guān)性進行評估，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 磁共振成像測定結(jié)果 對兩組患者的腦組織中淀粉樣斑塊體積進行測定，對照組腦組織中未見淀粉樣斑塊，而AD患者組的顱腦總淀粉樣斑塊體積為1 363.76 mm3。

2.2 Hiseq測序結(jié)果

2.2.1 初篩結(jié)果 根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，AD患者血清miRNAs拷貝數(shù)大于10且變化2倍以上認為有意義。得到14種miRNA進行復(fù)篩。見表1。

表1 初篩的14種miRNA

2.2.2 復(fù)篩結(jié)果 應(yīng)用qRT-PCR法復(fù)篩已經(jīng)初篩出的14種miRNA。miR-485-5p及miR-151b在未超過75%的樣本中均未檢測到。另外，novel-mir-36、miR-3158-3p、miR-30e-5p、miR-27a-3p、miR-26b-3p和let-7g-5p六個miRNAs在研究組和對照組血清中表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p六個miRNAs在研究組和對照組血清中表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。并且上述六個miRNA在研究組血清中的表達量低于對照組血清(P<0.05)。見表3。

表2 復(fù)篩結(jié)果(1)

表3 復(fù)篩結(jié)果(2)

2.3 磁共振成像結(jié)果與血清中miRNAs表達量的相關(guān)性分析 將兩組的顱腦總淀粉樣斑塊體積和血清中miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p表達量進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，顱腦總淀粉樣斑塊體積與血清中miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p表達量呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 磁共振成像結(jié)果與血清中miRNAs表達量的相關(guān)性分析(r)

注：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

AD的特征性病理改變是患者大腦皮層和海馬內(nèi)的β淀粉樣蛋白沉積，導(dǎo)致老年斑的形成和tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)，從而導(dǎo)致腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元細胞的減少[18]。核磁共振成像的主要優(yōu)勢在于其多參數(shù)、多方位成像，且組織對比分辨率高，對細小結(jié)構(gòu)的萎縮方面也能清晰顯示，故而在AD的臨床診斷中廣泛應(yīng)用MRI影像學(xué)檢查并取得了較高的診斷效果[19]。臨床研究證實，海馬是AD患者的主要病理學(xué)改變處，可通過影像學(xué)手段檢測AD大腦特征性的病理改變，即淀粉樣斑塊。對比增強磁共振成像測定結(jié)果顯示對照組腦組織中未見淀粉樣斑塊，而研究組的顱腦總淀粉樣斑塊體積為1 363.76 mm3。AD的臨床研究是比較復(fù)雜的，本研究采用MRI的腦功能成像和對比劑增強很好地測定了患者顱腦內(nèi)淀粉樣斑塊體積，對于明確診斷AD具有重要的意義，為腦類疾病的研究提供更多可靠的信息。

目前有研究證實，AD患者的腦組織中異常表達的miRNAs可調(diào)節(jié)β淀粉樣蛋白代謝、Tau磷酸化等AD病理發(fā)生過程中相關(guān)基因的表達，在AD疾病的進展過程中發(fā)揮了重要作用[20]。目前已經(jīng)找到了腦脊液中特異性的miRNA作為潛在的疾病診斷的生物標(biāo)志物。但是腦脊液的獲得具有一定的風(fēng)險，因此從血液中找到有效的標(biāo)志物便具有更重大的意義。本研究以AD患者和健康對照老年人為研究對象，分別對其血清標(biāo)志物研究，首先在小批量樣本即初篩組中得到14種miRNA，然后運用qRT-PCR對初篩出的14種miRNA進行復(fù)篩。本研究發(fā)現(xiàn)，novel-mir-36、miR-3158-3p、miR-30e-5p、miR-27a-3p、miR-26b-3p和let-7g-5p六個miRNAs在研究組和對照組血清中表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但是，miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p六個miRNAs在AD患者血清中的表達量低于對照組血清(P<0.05)，推測此六種miRNAs或許可以作為AD診斷的生物標(biāo)志物。有學(xué)者研究了AD患者血清外吐小體中miRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)了14個miRNA表達水平上調(diào)[21]。其結(jié)果與本研究不完全相符，這可能是因為一方面兩項研究樣本量不夠多，樣本間差異導(dǎo)致的，另一方面則可能是因為部分miRNA不穩(wěn)定導(dǎo)致的。

為進一步探究上述六個miRNAs作為AD診斷的生物標(biāo)志物的可能性，本研究還探究了AD患者淀粉樣斑塊的對比增強磁共振成像與血清標(biāo)志物的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)：AD患者淀粉樣斑塊的對比增強磁共振成像與血清標(biāo)志物miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p表達量呈正相關(guān)。說明上述六個miRNA表達量在AD患者體內(nèi)異常表達可能與AD患者顱腦內(nèi)的淀粉樣斑塊的形成相關(guān)?？蛇M一步探究該miRNA調(diào)控AD患者發(fā)病過程的機制，為其作為AD生物標(biāo)志物的可能性提供依據(jù)。

綜上所述，血清中miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p能夠作為潛在的AD生物標(biāo)志物[22]。本研究中血清miRNA與AD患者淀粉樣斑塊的對比增強磁共振成像相關(guān)性分析具有重大的臨床意義，為AD患者的早期預(yù)警、診斷和治療提供幫助。