多種細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)劑對(duì)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3II及p62表達(dá)的影響

魏硯明，任晉宏，欒智華，王永輝

(山西中醫(yī)藥大學(xué) 1制藥與食品工程學(xué)院；2實(shí)驗(yàn)中心，晉中 030619)

細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解途徑，參與多種生理功能，已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞自噬活性失調(diào)與多種人類疾病密切相關(guān)[1-2]。判斷細(xì)胞自噬活性的最常用方法是利用Western雜交檢測(cè)內(nèi)源性微管結(jié)合蛋白1輕鏈3I(LC3I)向微管結(jié)合蛋白1輕鏈3II(LC3II)的轉(zhuǎn)化[3-4]。LC3是最早發(fā)現(xiàn)的自噬標(biāo)記物，其前體經(jīng)加工后將羧基末端切除產(chǎn)生LC3I，隨后LC3I通過(guò)類泛素樣修飾的方式與自噬小體膜上的磷脂共價(jià)結(jié)合，形成LC3II[5]。LC3II的量與自噬小體數(shù)量緊密相關(guān)，是反映細(xì)胞自噬活性的關(guān)鍵指標(biāo)。細(xì)胞自噬受體蛋白p62作為泛素化底物和定位于自噬小體膜上LC3之間的連接因子可以被包裹進(jìn)自噬小體降解。p62蛋白表達(dá)水平的高低與自噬活性成反比，是檢測(cè)自噬活性的一個(gè)輔助指標(biāo)[6]。

細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)劑可以上調(diào)或下調(diào)自噬活性，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞自噬過(guò)程的解析[7-8]。由于不同的細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)劑的作用靶點(diǎn)不同，其可能對(duì)LC3II和p62表達(dá)的影響存在差異；同時(shí)鑒于LC3II自身可以被自噬降解[9]，而在某些條件下，p62蛋白水平的變化與細(xì)胞自噬并無(wú)關(guān)聯(lián)[10]，這就使在解釋兩者的Western雜交結(jié)果時(shí)存在不確定性，可能導(dǎo)致對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解析產(chǎn)生矛盾的、甚至錯(cuò)誤的結(jié)論，曲解細(xì)胞自噬活性的變化及生物學(xué)意義。因此，有必要比較不同的自噬調(diào)節(jié)劑對(duì)LC3II和p62表達(dá)的影響?？紤]到細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)劑種類繁多，作用靶點(diǎn)各不相同，本研究通過(guò)多種常用的自噬調(diào)節(jié)劑調(diào)控細(xì)胞自噬過(guò)程不同階段，例如利用雷帕霉素或海藻糖分別以mTOR依賴或非依賴方式誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生[11-12]；利用3-甲基腺嘌呤阻斷自噬小體的形成[13]；利用巴弗洛霉素A1干擾自噬小體與溶酶體的融合[14]；利用E64d和pepstatin A抑制溶酶體中組織蛋白酶活性[9]，以自噬標(biāo)記物L(fēng)C3II和p62作為細(xì)胞自噬活性指標(biāo)，觀察不同濃度或不同作用時(shí)間的細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)劑對(duì)其表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果有望為這些細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用及細(xì)胞自噬檢測(cè)結(jié)果的正確解析提供參考。

1 材 料

1.1 藥物與試劑

DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胰蛋白酶、胎牛血清、雷帕霉素(rapamycin)、海藻糖(trehalose)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)、巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1)、E64d、pepstatin A及鼠抗p62抗體(索萊寶科技有限公司);RIPA細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、兔抗LC3抗體、羊抗actin抗體、蛋白酶抑制劑及化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；CCK8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)。

1.2 儀 器

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)伯騰公司)；冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.3 細(xì)胞株

HEK293細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293細(xì)胞置于含10%胎牛血清，100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中,于含5%CO2,95%空氣的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 藥物處理

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基后，分別換成含有不同濃度的雷帕霉素、海藻糖、3-甲基腺嘌呤、巴弗洛霉素A1或E64d和pepstatin A的新鮮培養(yǎng)基，對(duì)照組添加對(duì)應(yīng)的溶劑。孵育指定時(shí)間后，收集、裂解細(xì)胞。雷帕霉素、巴弗洛霉素A1、E64d和pepstatin A溶于DMSO中，海藻糖溶于水中，3-甲基腺嘌呤于使用前直接溶于培養(yǎng)基中。

2.3 細(xì)胞裂解

細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗后，加入含蛋白酶抑制劑及1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液(1% NP-40，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，0.25%脫氧膽酸，1 mmol/L EDTA)，冰上裂解15 min。用移液器將細(xì)胞吹打起來(lái)后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，23號(hào)針頭反復(fù)吹打破碎細(xì)胞，4 ℃條件下，3 302 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測(cè)定上清蛋白濃度。

2.4 Western雜交檢測(cè)LC3II和p62表達(dá)水平

細(xì)胞裂解液與5×SDS上樣緩沖液混勻后，95 ℃加熱5 min使蛋白質(zhì)變性，用于SDS-PAGE。隨后，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。室溫下，經(jīng)含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h后，4℃條件下孵育一抗過(guò)夜后，室溫條件下分別與相應(yīng)的連接有辣根過(guò)氧化物酶的二抗孵育1 h，用TBST洗去未發(fā)生結(jié)合的二抗。利用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶。膠片經(jīng)掃描后，利用Image J定量對(duì)應(yīng)條帶的強(qiáng)度。

2.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將HEK293細(xì)胞接種于96孔板中，24 h后加入自噬調(diào)節(jié)劑處理，繼續(xù)培養(yǎng)指定時(shí)間，按照CCK8試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)自噬調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 自噬活化劑對(duì)自噬標(biāo)記物的影響

3.1.1 雷帕霉素對(duì)自噬標(biāo)記物的影響 雷帕霉素作為一種應(yīng)用廣泛的自噬活化劑，其可以使mTOR激酶失活，下調(diào)p70 S6激酶活性，降低核糖體蛋白S6的磷酸化程度，從而上調(diào)自噬活性[11]。HEK293細(xì)胞經(jīng)不同濃度的雷帕霉素處理24 h后，Western雜交檢測(cè)LC3II和p62的表達(dá)，結(jié)果顯示雷帕霉素可以上調(diào)LC3II的表達(dá)，并且具有劑量依賴性；類似地，雷帕霉素可劑量依賴性地降低HEK293細(xì)胞中p62的表達(dá)(圖1-A，B)。為了比較雷帕霉素不同處理時(shí)間對(duì)LC3II和p62表達(dá)的影響，HEK293細(xì)胞經(jīng)100 nmol/L雷帕霉素處理12、24或48 h后，檢測(cè)LC3II和p62的表達(dá)，結(jié)果表明不同處理時(shí)間均引起LC3II表達(dá)顯著增多(P<0.05)，并隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，LC3II表達(dá)增加；而在經(jīng)雷帕霉素處理12 h 的HEK293細(xì)胞中未觀察到p62的表達(dá)有明顯變化，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，p62的表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖1-C，D)。

A，B：Incubated with rapamycin at different concentration for 24 h;C,D:Incubated with rapamycin (100 nmol/L) after different duration

*P<0.05vscontrol group

3.1.2 海藻糖對(duì)自噬標(biāo)記物的影響 海藻糖是一種非還原性雙糖，其以一種mTOR非依賴性的方式增強(qiáng)自噬活性[12]。HEK293細(xì)胞經(jīng)不同濃度海藻糖處理24 h后，Western雜交檢測(cè)LC3II和p62的表達(dá)，結(jié)果顯示海藻糖可以上調(diào)LC3II的表達(dá)，而p62的表達(dá)未觀察到明顯變化(圖2-A，B)。此外，利用20 mmol/L海藻糖處理HEK293細(xì)胞不同時(shí)間，觀察到海藻糖可以時(shí)間依賴性地增強(qiáng)LC3II的表達(dá)；類似地，其對(duì)p62的表達(dá)沒(méi)有明顯影響(圖2-C，D)。

A，B：Incubated with trehalose at different concentration for 24 h;C,D:Incubated with trehalose (20 mmol/L) after different duration

*P<0.05vscontrol group

3.2 自噬抑制劑對(duì)自噬標(biāo)記物的影響

3.2.1 3-甲基腺嘌呤對(duì)自噬標(biāo)記物的影響 3-甲基腺嘌呤通過(guò)特異抑制PI3KIII的激酶活性，阻斷自噬小體的形成[13]。HEK293細(xì)胞經(jīng)不同濃度的3-甲基腺嘌呤處理24 h后，Western雜交檢測(cè)LC3II和p62的表達(dá)，結(jié)果表明隨著3-甲基腺嘌呤濃度的增加，LC3II和p62的表達(dá)均明顯增加(圖3-A，B)。同樣地，利用5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤處理HEK293細(xì)胞不同時(shí)間，LC3II和p62的表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間依賴性地增加(圖3-C，D)。

A，B：Incubated with 3-MA at different concentration for 24 h;C,D:Incubated with 3-MA (5 mmol/L) after different duration

*P<0.05vscontrol group

3.2.2 巴弗洛霉素A1對(duì)自噬標(biāo)記物的影響 巴弗洛霉素A1可特異地抑制液泡膜上的氫離子ATP酶，使溶酶體腔內(nèi)不能酸性化，從而干擾自噬小體與溶酶體的融合[14]。利用不同濃度的巴弗洛霉素A1處理HEK293細(xì)胞24 h后，檢測(cè)LC3II和p62的表達(dá)，結(jié)果顯示巴弗洛霉素A1可顯著增加LC3II和p62的表達(dá)(P<0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性(圖4-A，B)。利用40 nmol/L巴弗洛霉素A1處理HEK293細(xì)胞不同時(shí)間后，檢測(cè)LC3II和p62的表達(dá)，結(jié)果顯示巴弗洛霉素A1可時(shí)間依賴性地增加LC3II和p62的表達(dá)(圖4-C，D)。

A，B：Incubated with bafilomycin A1 at different concentration for 24 h;C,D:Incubated with bafilomycin A1 (5 mmol/L) after different duration

*P<0.05vscontrol group

3.2.3 E64d和pepstatin A對(duì)自噬標(biāo)記物的影響 E64d是一種膜通透性的組織蛋白酶B、H和L抑制劑；pepstatin A是組織蛋白酶D和E抑制劑[9]。不同濃度的E64d和pepstatin A共同處理HEK293細(xì)胞24 h后，檢測(cè)LC3II和p62的表達(dá)，結(jié)果顯示E64d和pepstatin A可顯著增強(qiáng)兩者的表達(dá)(P<0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性(圖5-A，B)。利用E64d和pepstatin A各20 μg/mL同時(shí)處理HEK293細(xì)胞不同時(shí)間，觀察不同作用時(shí)間對(duì)LC3II和p62表達(dá)的影響，結(jié)果顯示E64d和pepstatin A可時(shí)間依賴性地上調(diào)LC3II和p62的表達(dá)(圖5-C，D)。

3.3 細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)劑的細(xì)胞毒性

為明確上述細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)劑是否影響細(xì)胞活性，HEK293細(xì)胞經(jīng)不同濃度或不同時(shí)間雷帕霉素處理后，檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果表明不同濃度或處理時(shí)間的雷帕霉素對(duì)細(xì)胞活性均無(wú)明顯影響(圖6)。同樣地，HEK293細(xì)胞經(jīng)不同濃度或不同時(shí)間的海藻糖、3-甲基腺嘌呤、巴弗洛霉素A1以及E64d和pepstatin A處理后，均未觀察到對(duì)HEK293細(xì)胞有明顯的毒性作用(結(jié)果未顯示)。

A，B：Incubated with E64d and pepstatin A at different concentration for 24 h;C,D:Incubated with E64d (20 μg/mL)+pepstatin A (20 μg/mL) after different duration

*P<0.05vscontrol group

The value in rapamycin treated cells was shown as a percentage of the corresponding one in control cell,which was set as 100%

A，B：Incubated with rapamycin at different concentration for 24 h;C,D:Incubated with rapamycin (100 nmol/L) after different duration

4 討 論

由于細(xì)胞自噬活性檢測(cè)中分析方法或標(biāo)準(zhǔn)的差異，可能引起對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤讀[9,15-16]。本實(shí)驗(yàn)中利用雷帕霉素或海藻糖誘導(dǎo)自噬小體形成；或者利用3-甲基腺嘌呤抑制自噬起始階段、巴弗洛霉素A1抑制自噬小體與溶酶體的融合以及E64d和pepstatin A阻斷自噬溶酶體的降解過(guò)程，均引起LC3II表達(dá)水平明顯升高。因此，LC3II的增多既可反映自噬活性增強(qiáng)引起的自噬小體數(shù)量增加，也可能是由于自噬小體與溶酶體融合受阻或者自噬溶酶體的降解受阻引起的。一般情況下，LC3I的表達(dá)量比較穩(wěn)定，但在5和10 mmol/L 3-甲基腺嘌呤處理組中其表達(dá)量與其他組有較大差別(圖3-A)，這可能與不同處理?xiàng)l件下自噬活性狀態(tài)不同相關(guān)，但具體原因仍待進(jìn)一步深入研究。

為了明確自噬活性的變化，通常結(jié)合觀察自噬特異降解底物p62的表達(dá)。抑制細(xì)胞自噬的各個(gè)階段時(shí)，LC3II的堆積伴隨著p62表達(dá)的明顯升高，并且呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性；而利用雷帕霉素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬活性，促進(jìn)p62降解，并且與LC3II的增多相比，p62的減少具有滯后性，例如在誘導(dǎo)自噬的早期，LC3II升高的同時(shí)未能檢測(cè)到p62下調(diào)，提示清除作為自噬底物的p62需要較長(zhǎng)時(shí)間，這可能與雷帕霉素誘導(dǎo)自噬的能力相對(duì)較慢有關(guān)[3]，也可能和p62與自噬小體膜結(jié)合不夠緊密相關(guān)[6]。

通過(guò)同時(shí)檢測(cè)LC3II和p62來(lái)判斷自噬活性的方法具有一定的局限性。由于自噬過(guò)程中LC3II被溶酶體中的水解酶降解[9]，如果LC3II的溶酶體降解速度遠(yuǎn)小于自噬小體形成速度，LC3II水平的升高代表自噬的活化，而LC3II的表達(dá)在不同細(xì)胞中具有差異性，如果在某些細(xì)胞中自噬的本底水平較高，自噬活化時(shí)形成的LC3II被迅速降解，LC3II水平保持不變甚至降低，則其不能真實(shí)準(zhǔn)確反映自噬的活化。另外，p62作為自噬標(biāo)記物，尤其是作為自噬活化時(shí)的標(biāo)記物時(shí)，由于表達(dá)變化的滯后性，同時(shí)其他自噬非依賴途徑參與了p62代謝[10]，其可能不能準(zhǔn)確反映真實(shí)的自噬狀態(tài)。盡管同樣作為自噬誘導(dǎo)劑，但雷帕霉素和海藻糖對(duì)LC3II和p62表達(dá)的影響存在差異。海藻糖可以上調(diào)LC3II的表達(dá)，但對(duì)p62的表達(dá)未見(jiàn)明顯影響，這可能是由于與雷帕霉素相比，海藻糖增強(qiáng)自噬活性的能力較弱，也可能與細(xì)胞系相關(guān)[17]。

最后，由于LC3II和p62的堆積可以是阻斷細(xì)胞自噬的不同階段引起的，目前還難以區(qū)分具體是哪一步驟受到抑制。因此，要客觀評(píng)價(jià)細(xì)胞自噬狀態(tài)也可選擇其他多種方法綜合評(píng)定，包括觀察自噬小體的超微結(jié)構(gòu)或長(zhǎng)壽命蛋白的自噬性降解等[3-4,18]。

總之，本研究比較了多種調(diào)控細(xì)胞自噬不同階段的調(diào)節(jié)劑對(duì)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3II和p62表達(dá)的影響，結(jié)果驗(yàn)證了LC3II和p62的表達(dá)在細(xì)胞自噬的不同階段均受到嚴(yán)格調(diào)控，不同的自噬調(diào)節(jié)劑對(duì)其表達(dá)的調(diào)控存在明顯差異，為利用兩者表達(dá)的變化解析細(xì)胞自噬活性檢測(cè)結(jié)果及篩選新型自噬調(diào)節(jié)劑提供了參考。

參 考 文 獻(xiàn)

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