許天琪，張 佳，薛曉艷

北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院 重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100049

膿毒癥(sepsis)是因感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的致命性器官功能障礙[1]。細(xì)菌、真菌、病毒等致病微生物感染是導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生發(fā)展的主要原因。有大量的實驗及臨床研究對細(xì)菌特別是革蘭陰性菌導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)病機(jī)制、臨床特點和治療手段進(jìn)行闡述。病毒作為環(huán)境中存在的重要感染因子，對免疫狀態(tài)膿毒癥患者的影響尚未引起足夠重視。膿毒癥患者的免疫狀態(tài)早期以促炎反應(yīng)為主，以清除病原體，減輕組織損傷[2]，此階段會釋放大量的炎性因子和趨化蛋白，補(bǔ)體系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)等強(qiáng)烈激活，持續(xù)的抗炎反應(yīng)引發(fā)免疫耗竭，導(dǎo)致機(jī)體長期而廣泛的免疫抑制[3-5]，增加了繼發(fā)性及機(jī)會性感染，使得機(jī)會性細(xì)菌以及病毒成為院內(nèi)獲得性感染常見的病原微生物。有研究顯示，盡管使用抗菌藥物治療，76.7%的患者仍存在持續(xù)的感染源[6]。Otto等[7]針對膿毒癥患者的回顧性研究表明，有36.7%的膿毒癥患者死于早期過度亢進(jìn)的炎癥反應(yīng)階段，63.3%的患者死于膿毒癥后期免疫抑制合并多重感染階段，且膿毒癥后期病死率顯著高于早期(22.0% vs 11.3%，P＜0.01)。免疫功能的受損以及機(jī)體清除入侵病原體能力下降都可導(dǎo)致隱匿病毒復(fù)活[8]。潛伏性病毒激活對膿毒癥患者預(yù)后的影響、損傷機(jī)制、與免疫狀態(tài)的相關(guān)性等諸多問題尚未得到闡述，膿毒癥患者感染/攜帶的機(jī)會性病毒種類分布及其對病情嚴(yán)重程度、病情轉(zhuǎn)歸等的影響亟待研究。在此背景下，本研究對我院重癥醫(yī)學(xué)科膿毒癥患者血標(biāo)本常見潛伏性病毒種類進(jìn)行篩查，通過與非膿毒癥患者比較，結(jié)合臨床資料分析膿毒癥患者攜帶病毒的種類分布及對病情的影響，為膿毒癥患者早期病毒診斷與治療提供參考。

對象和方法

1 研究對象 選取2017年1月- 2018年1月于我院重癥醫(yī)學(xué)科(ICU)住院患者，其中ICU住院患者根據(jù)2016年第45屆美國重癥醫(yī)學(xué)年會發(fā)布的“膿毒癥3.0”的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]分為ICU膿毒癥組、ICU非膿毒癥組。膿毒癥患者納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)Sepsis3.0的診斷標(biāo)準(zhǔn)，對感染或可疑感染的患者進(jìn)行qSOFA評分，即收縮壓(systolic blood pressure，SBP)≤100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，呼吸頻率(respiratory rate，RR)≥22次/min，格拉斯哥昏迷評分(Glasgow coma score，GCS)≤13分，出現(xiàn)兩項或兩項以上陽性時可診斷為膿毒癥。診斷由兩名主治醫(yī)師進(jìn)行審核。排除標(biāo)準(zhǔn)：HIV-1、器官移植、長期大劑量應(yīng)用激素(≥300 mg/d hydrocortisone)或其他免疫抑制劑、病毒性肝炎以及自身免疫性疾病。本研究通過北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，入組的患者及家屬知情同意并簽字。

2 篩查病毒范圍 根據(jù)2006年中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的《人間傳染的病原微生物名錄》中制訂的實驗室活動所需要的生物安全實驗室級別，對臨床病毒的血核酸檢測及分析等操作均在生物安全二級實驗室進(jìn)行。篩選能夠在BSL-2級實驗室進(jìn)行“未經(jīng)培養(yǎng)的感染材料操作”的病毒種類，結(jié)合查閱文獻(xiàn)信息，將潛伏病毒的重點篩查范圍確定在皰疹病毒科、腺病毒科、多瘤病毒科、副黏病毒科及披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬成員。

3 標(biāo)本采集與檢測 患者入院當(dāng)日及其后每隔2 d采集靜脈血標(biāo)本，健康對照組于體檢當(dāng)日采集靜脈血標(biāo)本。采集的血標(biāo)本24 h豎放于-80℃冰箱保存，送實驗室后取200μl用于核酸提取，其余-80℃保存。采用美國Magen公司磁珠法病毒核酸提取試劑盒按照說明書提取病毒核酸，采用PCR技術(shù)對血標(biāo)本中病毒核酸進(jìn)行檢測。從NCBI基因庫查詢并下載各科病毒的不同毒株序列，分析序列同源性，找到病毒基因組的保守區(qū)域并進(jìn)行比對，針對保守區(qū)設(shè)計簡并引物，并對引物信息進(jìn)行“BLAST”驗證。設(shè)計好的引物由上海生工公司合成(病毒種類及引物信息見表1)。反應(yīng)體系配置及加樣使用Biomek實驗室全自動工作站，按照說明書完成設(shè)計及程序編寫。

4 分析指標(biāo) 1)患者臨床資料，包括性別、年齡、病因、住院時間、病死率；2)兩組檢出病毒種類及數(shù)量；3)膿毒癥組的病毒檢出種類與混合機(jī)會性感染發(fā)生率、平均住院時間、病死率的關(guān)系。

5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以-x±s表示，非正態(tài)分布的計數(shù)資料用中位數(shù)(最大值，最小值)表示；組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier生存分析法計算各組死亡率并繪制生存曲線，采用Log-rank進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 檢測病毒種類及引物信息Tab. 1 Virus detected and nucleotide sequence of the primers

結(jié) 果

1 分組情況及基本信息 ICU膿毒癥組共納入61例，非膿毒癥組納入61例，兩組患者的年齡、性別比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ICU膿毒癥組SOFA評分、APACHEⅡ評分、死亡率均高于ICU非膿毒癥組，ICU膿毒癥組患者的感染灶多集中于肺部，各組患者基本信息見表2。

表2 各組患者基本信息情況Tab. 2 Patients' characteristics in each group

2 病毒檢出結(jié)果 所有納入成員中共檢出6類病毒，包括巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)(19例，15.6%)，EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)(39例，31.9%)，單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)(10例，8.1%)，人皰疹病毒6型(human herpes virus 6，HHV-6)(9例，7.3%)，風(fēng)疹病毒(rubella virus，RubV)(7 例，5.7%)，腺病毒 (adenovirus，AdV)(2 例，1.6%)，其中膿毒癥組CMV、EBV和RuBV檢出陽性率高于非膿毒癥組，各組病毒檢出結(jié)果見表3。

3 膿毒癥組病毒檢出種類與機(jī)會性感染 膿毒癥組共檢出包括肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、糞腸球菌、白假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、弓形蟲等在內(nèi)的共46株細(xì)菌，15株真菌，其中14例(22.9%)混合有兩種及以上的機(jī)會性感染致病菌。在所有檢出的病毒種類中，血液標(biāo)本CMV、EBV陽性患者機(jī)會性感染致病菌檢出率高于陰性患者(P＜0.05)。膿毒癥組病毒檢出與機(jī)會性感染發(fā)生率關(guān)系見圖1。

4 膿毒癥組病毒檢出種類與住院時間及轉(zhuǎn)歸的關(guān)系 CMV、EBV和HSV檢出陽性的膿毒癥患者平均住院時間更長(圖2)，EBV檢出陽性患者死亡率高于陰性患者(圖3)。

表3 分組病毒檢出結(jié)果Tab. 3 Frequency of viral DNA in septic and control patients (n, %)

圖 1 膿毒癥組EBV(A)和CMV(B)陽性患者合并機(jī)會性感染發(fā)生率高于陰性患者Fig. 1 Incidence of opportunistic infection in EBV(A) and CMV(B)positive sepsis patients is higher than that of negative patients

圖 2 膿毒癥組病毒檢出種類與平均住院時間的關(guān)系Fig. 2 Effects of virus specieson ICU average length of stay in sepsis patients (aP＜0.05, vs negative)

圖 3 膿毒癥組EBV陽性患者死亡率高于陰性患者Fig. 3 Mortality rate of EBV positive sepsis patients is higher than that of negative patients

討 論

1 各組病毒檢出種類對比 本研究顯示膿毒癥患者潛伏病毒檢出種類及數(shù)量高于非膿毒癥組，膿毒癥患者CMV(21.3%)、EBV(47.5%)和HSV(9.8%)的高檢出率說明，相對于非膿毒癥患者，膿毒癥患者中潛伏性病毒再活化現(xiàn)象更常見，從側(cè)面印證了膿毒癥患者的免疫抑制甚至免疫麻痹狀態(tài)。

導(dǎo)致膿毒癥患者免疫抑制的原因：1)膿毒癥并非獨立的疾病，本質(zhì)是感染引起的復(fù)雜的臨床綜合征。ICU收治的膿毒癥患者往往不是因為單一系統(tǒng)的疾病收入院，多是在復(fù)雜嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病上出現(xiàn)新的問題，患者本身免疫功能差，合并感染進(jìn)一步導(dǎo)致免疫功能缺陷，增加病毒易感性，潛伏病毒再激活。2)膿毒癥早期促炎反應(yīng)階段為清除病原體，此階段會釋放大量促炎因子，如TNA-α、IL-1、IL-6、γ干擾素、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1(MIP-1)等[2,9-10]，大量炎性因子的釋放會導(dǎo)致機(jī)體血流動力學(xué)不穩(wěn)定、凝血功能障礙和器官功能衰竭，繼續(xù)導(dǎo)致膿毒癥休克的發(fā)生，還會引起炎性因子及免疫系統(tǒng)的耗竭，機(jī)體由免疫亢進(jìn)狀態(tài)轉(zhuǎn)為免疫抑制甚至免疫麻痹狀態(tài)，其中T淋巴細(xì)胞耗竭，CD4和CD8+T細(xì)胞及髓源性抑制細(xì)胞耗竭及凋亡、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加等[11]，均利于病毒的感染及潛伏病毒活化。在本研究實驗室檢查結(jié)果中，膿毒癥患者淋巴細(xì)胞比例降低等可從側(cè)面反映這個問題。針對造血干細(xì)胞移植患者病毒感染問題有研究表明[12-14]，血液中EBV檢出率56.3%，HHV-6檢出率13.7%，本研究中ICU膿毒癥患者血液標(biāo)本中EBV(47.5%)和HHV-6(6.6%)的檢出率與造血干細(xì)胞及器官移植患者報道的EBV感染率相近，提示我們膿毒癥患者的免疫抑制狀態(tài)接近于移植患者的免疫缺陷程度，臨床工作中對于膿毒癥患者免疫抑制狀態(tài)及病毒復(fù)活需要引起足夠的重視。

2 膿毒癥患者病毒檢出與病情轉(zhuǎn)歸情況 在本研究中，CMV和EBV陽性膿毒癥患者合并機(jī)會性細(xì)菌及真菌感染率更高，CMV、EBV和HSV檢出陽性患者平均住院時間更長，EBV陽性患者死亡率更高，說明機(jī)會性潛伏病的激活可能導(dǎo)致膿毒癥患者預(yù)后變差。

膿毒癥患者營養(yǎng)狀態(tài)差、屏障功能減弱，對病毒的監(jiān)視、識別、清除能力下降以及感染應(yīng)激因素等都會導(dǎo)致潛伏病毒的再激活，潛伏病毒的再激活也進(jìn)一步破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)。病毒寄生在細(xì)胞內(nèi)，干擾細(xì)胞能量代謝、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，有學(xué)者針對感染流感病毒死亡的患者進(jìn)行研究[15]發(fā)現(xiàn)，病毒對肺部造成的損傷主要是通過破壞肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells，AEC)，引起肺泡上皮細(xì)胞表面活性物質(zhì)的合成和分泌障礙，從而破壞肺泡的完整性，增加肺泡毛細(xì)血管的通透性，并通過炎性因子調(diào)節(jié)作用影響免疫反應(yīng)并抑制中性粒細(xì)胞的趨化和吞噬作用，降低機(jī)體對于呼吸道病原體的防御能力，使得病毒、細(xì)菌、真菌等機(jī)會性病原體感染率明顯升高。病毒一旦打破了免疫系統(tǒng)的大門、削弱了屏障功能，定植的細(xì)菌、真菌感染乘機(jī)洶涌而來，持續(xù)的氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎性因子刺激、機(jī)體耗氧增加，使得病情迅速惡化，最終導(dǎo)致多器官功能障礙、膿毒癥休克及死亡。本研究中病毒檢出陽性的膿毒癥患者更容易合并其他機(jī)會性感染、病情更嚴(yán)重、死亡率更高等結(jié)果同樣反映了膿毒癥患者潛伏病毒活化后，破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，為機(jī)會菌定植、入侵提供便利，病毒與此類機(jī)會病原體相互作用，導(dǎo)致病情遷延、住院時間增加、預(yù)后變差。

病毒引發(fā)的炎癥反應(yīng)是一把雙刃劍，它可以清除感染，但持續(xù)和過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致不良的后果。潛伏病毒激活導(dǎo)致膿毒癥患者高病死率也不僅是由于病毒本身的毒力破壞作用，還與機(jī)體免疫系統(tǒng)對病毒感染引起的異常反應(yīng)相關(guān)[16]。

3 膿毒癥患者皰疹病毒科檢出率更高 相對于腺病毒科、副黏病毒科成員，皰疹病毒科成員在膿毒癥患者中檢出率更高，本研究中膿毒癥組CMV(人皰疹病毒5型，21.3%)、EBV(人皰疹病毒4型，47.5%)、HSV(單純皰疹病毒，9.8%)、HHV(人皰疹病毒6型6.6%)檢出率均高于非膿毒癥組。原因可能是皰疹病毒科有潛伏持久、周期性復(fù)活的特點，有研究表示幾乎所有成年人都曾經(jīng)感染過人皰疹病毒6型[17]，90%的成年人感染過EB病毒，成年人中人皰疹病毒2型抗體陽性率58%[18]，CMV、EBV、HHV、HSV等病毒在急性感染后，可以在宿主體內(nèi)長期隱蔽地存活下來，發(fā)展成為持續(xù)性感染或慢感染，如CMV持續(xù)性感染的位點在唾液腺、巨噬細(xì)胞，EBV持續(xù)性感染的位點在鼻咽上皮細(xì)胞、B細(xì)胞，HSV-2持續(xù)性感染的位點在視神經(jīng)元，HSV-6持續(xù)性感染的位點在淋巴細(xì)胞。目前潛伏病毒再激活的機(jī)制尚未得到詳細(xì)闡述，在膿毒癥患者中普遍存在的促炎因子釋放、缺氧、細(xì)胞損傷等相關(guān)因素都可能引起病毒再激活，因此除了免疫監(jiān)視受損之外，膿毒癥早期高炎癥反應(yīng)狀態(tài)也可能為潛伏病毒再激活提供了條件。

潛伏性病毒復(fù)活對病死率的顯著影響引發(fā)了人們對其在膿毒癥發(fā)生及發(fā)展過程中所扮演角色的思考，此類病毒是導(dǎo)致膿毒癥發(fā)展的直接病原體還是旁觀者目前尚無定論，有學(xué)者認(rèn)為潛伏病的再激活僅是患者免疫抑制的一個標(biāo)志[19]，是伴隨患者病情惡化自然而然發(fā)生的[20]，這些學(xué)者認(rèn)為潛伏病毒在體內(nèi)并不是始終處于靜息狀態(tài)，需要持續(xù)的免疫監(jiān)視才能維持其潛伏狀態(tài)，因此當(dāng)膿毒癥患者免疫功能受損時，自然會導(dǎo)致其再活化[21]。

病毒檢出陽性不等于病毒感染，判斷體內(nèi)潛伏病毒處于定植或是感染狀態(tài)需要進(jìn)行病毒的載量檢測加以鑒別。本研究的局限性在于未進(jìn)行病毒的載量檢測，且該研究是單中心、小樣本量、單因素分析，無法明確檢測出陽性的病毒種類是否與感染直接相關(guān)。

總而言之，膿毒癥患者病毒易感率高，潛伏性病毒活化現(xiàn)象常見，容易合并機(jī)會性致病菌多重感染，與膿毒癥患者免疫抑制狀態(tài)一致，且與病情嚴(yán)重程度及疾病轉(zhuǎn)歸相關(guān)，膿毒癥患者是否需要早期抗病毒治療需要進(jìn)一步臨床研究論證。

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