安 曉，李志銳，王俊良，孟昊業(yè)，汪愛(ài)媛，陶 笙解放軍總醫(yī)院海南分院 骨科，海南三亞 5703；解放軍總醫(yī)院 骨科研究所，北京 00853

膝骨關(guān)節(jié)炎是一種最為常見(jiàn)的疾病，該病癥主要癥狀有關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)活動(dòng)受到限制以及關(guān)節(jié)畸形等，這對(duì)于膝關(guān)節(jié)炎患者的生活質(zhì)量有著較大的負(fù)面影響，并且此疾病發(fā)病機(jī)制尚未明確[1]。有相關(guān)研究證實(shí)健康的關(guān)節(jié)軟骨下骨中均有血管，不過(guò)軟骨層中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。伴有骨關(guān)節(jié)炎的軟骨下骨血管會(huì)完全進(jìn)入到軟骨層中，這就會(huì)加快軟骨退變的進(jìn)程[2-3]。在骨軟骨復(fù)合單位中，血管因?yàn)樵錾鷷?huì)出現(xiàn)一種特殊的通道，神經(jīng)生長(zhǎng)因子和炎性因子均能夠通過(guò)該通道直接進(jìn)入到關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境中，骨關(guān)節(jié)炎中微血管的變化可能是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要機(jī)制之一，對(duì)不同病變時(shí)期微血管的檢測(cè)與觀察能進(jìn)一步闡明骨關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)展的原因，從而為治療骨關(guān)節(jié)炎提供新的方法[4]。目前微血管的檢驗(yàn)方法主要是間接檢驗(yàn)法，仍缺少一種良好的定量和直觀的檢驗(yàn)方法。這項(xiàng)研究當(dāng)中利用顯微CT(MicroCT)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎各種階段完成三維成像，利用閾值制訂的方法對(duì)微血管密度實(shí)行進(jìn)一步的定量檢驗(yàn)，便于認(rèn)定血管增生在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 在本研究中選取而二十只體質(zhì)量大致為300 g的雌性SD大鼠，本實(shí)驗(yàn)中所選取的大鼠均來(lái)自于解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，并全部都在解放軍總醫(yī)院骨科研究所內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)。

2 相關(guān)材料和儀器 這項(xiàng)研究利用的醫(yī)用碘酊消毒液對(duì)來(lái)源于衛(wèi)輝市康寶生化科技有限公司；可吸收縫線(多股抗菌微喬八根針)來(lái)源于美國(guó)強(qiáng)生公司；不可吸收縫線(10號(hào)慕斯線)來(lái)源于美國(guó)強(qiáng)生公司；亞納米級(jí)硫酸鋇來(lái)源于上海安億納米科技公司；固態(tài)明膠粉末是來(lái)源北京百靈克生物科技有限公司；Micro-CT Scanner RS-9 system(GE Healthcare公司，美國(guó))；MicroView圖像處理軟件(GE公司，美國(guó))。

3 大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型的創(chuàng)建 在通過(guò)解放軍醫(yī)學(xué)院實(shí)行動(dòng)物倫理委員會(huì)的允許之后，將這項(xiàng)研究所運(yùn)用的20只體質(zhì)量300 g的雌性SD大鼠分別分成了實(shí)驗(yàn)組(共4組，每組各4只)以及假手術(shù)組。全部大鼠都要實(shí)行水合氯醛肌內(nèi)注射麻醉，在麻醉完成之后，全部大鼠都進(jìn)行手術(shù)的消毒，利用脫毛劑均勻的涂抹在大鼠雙膝關(guān)節(jié)表層，并且利用碘酊棉球?qū)嵭邢?，乙醇棉球?qū)嵭忻摰狻?yīng)用無(wú)菌手術(shù)單和洞巾。大鼠膝關(guān)節(jié)皮膚手術(shù)的切口范圍在1 cm左右，在實(shí)行切口中顯出關(guān)節(jié)囊，應(yīng)該確?？梢越佑|到到髕骨。在髕旁中對(duì)大鼠關(guān)節(jié)囊進(jìn)行側(cè)切，在進(jìn)入關(guān)節(jié)腔之后，對(duì)其髕骨向外推開(kāi)，使髕骨外側(cè)處在半脫位的狀態(tài)，這時(shí)候大鼠脛骨平臺(tái)髁間棘前方的前交叉韌帶就會(huì)顯露出來(lái)，對(duì)韌帶實(shí)行切斷，并確保該關(guān)節(jié)屈曲90°。將大鼠膝關(guān)節(jié)極度屈曲在內(nèi)外旋后，可以得出脛骨平臺(tái)以及股骨髁之間的內(nèi)外側(cè)半月板十分明顯，對(duì)其實(shí)行切除。為了盡可能防止出現(xiàn)異物反應(yīng)和感染炎癥等情況，應(yīng)該利用抗菌可吸收線對(duì)其實(shí)行縫合，在對(duì)關(guān)節(jié)囊進(jìn)行縫合后，使用10號(hào)線對(duì)大鼠切口皮膚進(jìn)行縫合。假手術(shù)組大鼠在實(shí)行常規(guī)消毒鋪單之后，僅切開(kāi)了其的關(guān)節(jié)囊。在等到大鼠麻醉蘇醒之后，把大鼠放回到籠中進(jìn)行飼養(yǎng)，讓其進(jìn)行自由活動(dòng)。

4 大鼠微血管灌注模型的建立 1)造影劑的配制：將明膠粉末放置在蒸餾水中實(shí)行攪拌，進(jìn)而制作成濃度4%的明膠溶液，并且在50℃恒溫水浴箱的狀態(tài)下將硫酸鋇試劑均勻的混合在明膠溶液中，制成濃度30%的硫酸鋇混溶液。2)造影方法：大鼠在稱重和麻醉之后，將大鼠胸腹部逐一解剖，上側(cè)剖開(kāi)至大鼠膈肌底層，下側(cè)到膀胱，把大鼠胃腸、肝以及膽囊等氣管推移到一側(cè)，使用濃度為0.9%氯化鈉注射液紗布對(duì)其進(jìn)行覆蓋，一直等到大鼠腹膜完全顯露出來(lái)之后、大鼠脊椎骨前側(cè)的腹主動(dòng)脈和下腔靜脈同樣也彰顯出來(lái)，實(shí)行鈍性分離血管膜，血液逐漸彰顯出鮮紅色并且血管管壁伴有搏動(dòng)性就是腹主動(dòng)脈，血液逐漸呈現(xiàn)暗紅色即下腔靜脈。大鼠腹主動(dòng)脈在靠近心臟的位置上實(shí)行結(jié)扎，并且在遠(yuǎn)心端動(dòng)脈置管。下腔靜脈在流出端實(shí)行置管，將注射利用肝素鈉和濃度在0.9%氯化鈉注射液混合，制作而成的抗凝劑，并持續(xù)灌注到大鼠的動(dòng)脈近心段中，在流出段逐漸展現(xiàn)出清亮無(wú)色的時(shí)候則為注射終點(diǎn)，對(duì)其0.9%氯化鈉注射液的用量進(jìn)行記載，并且注射和0.9%氯化鈉注射液相同用量濃度4%甲醛溶液對(duì)其的實(shí)施標(biāo)本固定。將水浴箱中的造影劑快速的加壓注射在大鼠體內(nèi)，一直到流出端有造影劑流出當(dāng)做注射的終點(diǎn)。把灌注后的標(biāo)本放在-20℃的冰箱中冷凍12 h。

5 取材觀察時(shí)間點(diǎn) 將實(shí)驗(yàn)組大鼠(16只)任意分為A、B、C、D這四個(gè)小組，每組大鼠依次在骨關(guān)節(jié)炎造模術(shù)之后的3周、6周、9周、12周實(shí)行血管灌注造影。這當(dāng)中假手術(shù)組在12周實(shí)行血管灌注造影。取材部位位于內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)。

6 大體觀察 對(duì)大鼠手術(shù)切口實(shí)行進(jìn)一步的審查，是否具有發(fā)炎癥狀，觀察大鼠關(guān)節(jié)囊是否與周邊組織出現(xiàn)粘連現(xiàn)象，在進(jìn)入關(guān)節(jié)腔之后滑膜組織是否出現(xiàn)糜爛、變性乃至增加等主要情況，關(guān)節(jié)液容量和顏色，脛骨平臺(tái)以及股骨髁周邊是否有骨贅增生和軟骨耗損等。根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠關(guān)節(jié)標(biāo)本實(shí)行整體的評(píng)分以及分級(jí)：4級(jí)代表大鼠軟骨厚度缺乏全層，軟骨下骨基本暴露；3級(jí)代表大鼠部分軟骨發(fā)生耗損等現(xiàn)象，耗損面積超出軟骨總面積的一半甚至更多；2級(jí)代表具有十分彰顯的軟骨裂隙，部分軟骨的耗損面積仍要比軟骨總面積低一半；1級(jí)代表大鼠軟骨表層具有輕微的耗損，有少許裂紋；0級(jí)表示健康關(guān)節(jié)軟骨，無(wú)損傷。

7 顯微CT評(píng)價(jià) 所有的標(biāo)本在實(shí)行顯微CT掃描前均在4%多聚甲醛溶液當(dāng)中實(shí)行固定。在掃描前將長(zhǎng)方體標(biāo)準(zhǔn)模塊(5 cm×1 cm×1 cm)放置在掃描床當(dāng)中實(shí)行校準(zhǔn)，盡可能防止初始參數(shù)的不一樣而出現(xiàn)誤差。1)大體掃描：將標(biāo)本穩(wěn)固在白色塑料泡沫上進(jìn)而降低掃描偽影，將掃描精度設(shè)為44μm，單次掃描時(shí)間設(shè)成15 min，在大鼠脛骨平臺(tái)和大鼠股骨髁的表面選擇興趣區(qū)域。三維興趣區(qū)實(shí)際上就是大鼠骨軟骨復(fù)合立方體(5 mm×5 mm×5 mm)，對(duì)其精準(zhǔn)的坐標(biāo)進(jìn)行記錄記錄。2)精確掃描：將掃描精度設(shè)為25μm，并且對(duì)其進(jìn)行加載，對(duì)所選用的區(qū)域?qū)嵭羞M(jìn)一步的掃描，單次掃描時(shí)間為45 min。3)重建與分析：在標(biāo)本掃描完成之后，其精度在25μm的標(biāo)準(zhǔn)下實(shí)行三維圖像的組建，將該圖像輸入在MicroView當(dāng)中實(shí)行進(jìn)一步的研究。在大鼠標(biāo)本當(dāng)中，骨組織CT值一般都分散在1 000 ～ 2 000 HU，所有大鼠標(biāo)本均是根據(jù)1 500 HU當(dāng)做固定閾值來(lái)對(duì)骨組織和軟組織實(shí)行分辨的，并采集興趣區(qū)中的圖像。軟骨下骨的組織學(xué)參數(shù)一般包括下列幾點(diǎn)：骨小梁厚度(trabecula thickness，Tb.Th)、骨礦化密度(bone mineral density，BMD)、 骨 體 積 分 數(shù) (bone volume fraction，BVF)。因?yàn)檠苤械牧蛩徜^造影劑的CT值會(huì)比較高，所以所有標(biāo)本當(dāng)中均以＞6 000 HU當(dāng)作閾值對(duì)血管實(shí)行判定，進(jìn)一步計(jì)算ROI當(dāng)中的血管體積分?jǐn)?shù)(vessel volume fraction，VVF)，并且在矢狀面上對(duì)血管實(shí)行投影，計(jì)算二維界面的最大血管密度(maximum intensity projection，MIP)。對(duì)照組采用同樣方法計(jì)算BMD、BVF、Tb.Th、VVF、MIP。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以-x±s表示，符合正態(tài)性及方差齊性者，組間比較采用t進(jìn)行檢驗(yàn)或方差分析，事后檢驗(yàn)為L(zhǎng)SD法。非正態(tài)性數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大體觀察 假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)軟骨所有均是健康軟骨，展現(xiàn)出淺藍(lán)色，而且具有光澤，表層沒(méi)有任何的耗損，且關(guān)節(jié)液清亮。實(shí)驗(yàn)組每一組的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨所有均是不同程度的變化，距離取材時(shí)間越久，大鼠關(guān)節(jié)軟骨耗損就越嚴(yán)重。3周組大鼠：大鼠軟骨表層失去光澤，色澤展現(xiàn)微黃色，在放大鏡下能夠看到大鼠軟骨微小裂紋的形成，軟骨耗損為1級(jí)，大鼠關(guān)節(jié)液清亮，滑膜組織則基本正常。6周組大鼠：大鼠軟骨伴有糜爛、表層損害嚴(yán)重和凹凸不平等情況發(fā)生，利用肉眼就能夠得出裂隙的存在，軟骨耗損沒(méi)有達(dá)到2級(jí)。9周組大鼠：大鼠軟骨的耗損面積超出軟骨面積的一半還多，而且大鼠軟骨厚度相對(duì)較小，有斑片狀軟骨退化灶情況的發(fā)生，軟骨耗損為3級(jí)，關(guān)節(jié)液呈現(xiàn)出混濁樣，滑膜組織出現(xiàn)增生并且滑膜組織和周圍組織粘連情況較為嚴(yán)重。12周組：大鼠軟骨全層均發(fā)生了耗損的現(xiàn)象，該軟骨下骨突出比較顯著，而且周邊骨贅明顯增生，軟骨耗損為4級(jí)，關(guān)節(jié)液含量將對(duì)較低，滑膜組織逐漸減輕。

2 顯微CT評(píng)價(jià) 1)在骨質(zhì)量方面，實(shí)驗(yàn)組大鼠的Tb.Th、BMD和BVF值均比假手術(shù)組低很多；在微血管增生上，實(shí)驗(yàn)組大鼠VVF明顯要超出假手術(shù)組，差異存在一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表1)。2)在骨質(zhì)量方面，實(shí)驗(yàn)每一組大鼠在Tb.Th、BMD、BVF等方面均存在差異，隨機(jī)兩個(gè)不同組實(shí)行比較，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。C組最低，D組最高。在術(shù)后3周、6周、9周，骨質(zhì)量隨著時(shí)間一直變小、骨小梁數(shù)量以及骨礦化程度都在降低。在術(shù)后12周，大鼠軟骨下骨骨板發(fā)生硬化，大鼠骨質(zhì)逐漸增多，骨密度較大，骨小梁結(jié)構(gòu)也因此由疏松變得緊密。在微血管增生上，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)2組微血管增生實(shí)行比較，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，C組大鼠(術(shù)后9周)的微血管增生最高(圖1為最大密度血管投影，圖2為微血管的三維成像)。在手術(shù)之后的3周、6周、9周，微血管增生逐漸變快，手術(shù)之后的12周，血管增生數(shù)量逐漸變少(表2)。

表1 實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組骨量與血管增生顯微CT分析Tab. 1 Micro CT evaluation of bone and angiogenesis between experimental group and sham group

討 論

血管增生實(shí)際上就是骨性關(guān)節(jié)炎致病機(jī)制中的主要組成部分，它與關(guān)節(jié)疼痛和腫脹等臨床癥狀有很大的關(guān)系，血管增生的精準(zhǔn)檢測(cè)是非常重要的，這不僅可以更進(jìn)一步探究骨性關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生以及發(fā)展的原理，也可以提供新的治療的思路[5-8]。目前，對(duì)微血管增生實(shí)行檢測(cè)的方法有很多，運(yùn)用最為普遍的就是墨汁明膠灌注檢方法。該方法可以經(jīng)過(guò)墨汁的滲透對(duì)血管形態(tài)實(shí)行觀察，不過(guò)墨汁極易溶于水，而且利用該方法很難實(shí)行切片[9]。伊凡斯蘭(EB)顯影方法同樣也是一種利用最普遍的檢測(cè)方法之一，EB實(shí)際上就是小分子物質(zhì)，可以進(jìn)一步進(jìn)入到微小血管當(dāng)中，在波長(zhǎng)為594 nm下，能夠出現(xiàn)紅色熒光，所以可以當(dāng)作標(biāo)記物，而且還可以進(jìn)行三維成像，同時(shí)其圖像分辨率很高。不過(guò)此類物質(zhì)極易溶于水中，無(wú)法進(jìn)行保存，并且必須要冷凍切片[10]。氧化鉛還可以當(dāng)做微血管造影的造影劑，該物質(zhì)在血管當(dāng)中分散到比較均

勻，而且不會(huì)任意對(duì)其他組織間隙實(shí)行分散，不過(guò)氧化鉛當(dāng)作造影劑的一種成像分辨率相對(duì)較低，對(duì)環(huán)境有一定污染性，易對(duì)實(shí)驗(yàn)者造成損傷[11]。Microfil實(shí)際上就是一種混合硅膠，可以對(duì)微血管實(shí)行愈加全面上灌注，該材料的成像比較清晰，不過(guò)該方法的使用濃度9%的甲酸實(shí)行脫鈣72 h，這會(huì)引起造影劑在微血管中分布不均勻，并且會(huì)對(duì)微血管有所損害，從而其對(duì)增生微血管密度評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性會(huì)受到影響[12]。

表2 實(shí)驗(yàn)組骨量與血管增生的顯微CT分析Tab. 2 Micro CT evaluation of bone and angiogenesis in experimental groups

圖 1 各組血管增生最大密度投影1：假手術(shù)組微血管增生密度； 2：A組微血管增生密度； 3：B組微血管增生密度； 4：C組微血管增生密度； 5：D組微血管增生密度Fig.1 MIP of different groups1: MIP of sham-operated group; 2: MIP of group A; 3: MIP of group B; 4: MIP of group C; 5: MIP of group D

圖 2 各組血管增生的三維重建圖像1：假手術(shù)組微血管三維圖像；2：A組微血管三維圖像；3：B組微血管三維圖像；4：C組微血管三維圖像；5：D組微血管三維圖像Fig.2 3D micrangium reconstruction of different groups 1: 3D image of sham-operated group; 2: 3D image of group A;3: 3D image of group B; 4: 3D image of group C; 5: 3D image of group D

經(jīng)過(guò)以上諸多檢驗(yàn)方法的描述能夠得出，這些方法均能夠觀察到微血管的形態(tài)，不能對(duì)微血管實(shí)行定量計(jì)算。本試驗(yàn)當(dāng)中所運(yùn)用的明膠硫酸鋇造影劑灌注檢驗(yàn)方法，能夠依照高分辨率的顯微CT對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎當(dāng)中的各種階段微血管增生現(xiàn)象實(shí)行三維立體成像和定量計(jì)算，最后對(duì)血管增生和骨性關(guān)節(jié)炎病展的關(guān)系實(shí)行合理的斷定。

骨軟骨復(fù)合體其實(shí)就是經(jīng)過(guò)軟骨鈣化層和軟骨下層所組成的，主要的作用就是吸取關(guān)節(jié)的負(fù)重，并且給軟骨提供適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)，依照Sanchez等[13]的相關(guān)研究能夠得出，骨軟骨復(fù)合體內(nèi)細(xì)胞肥大表型必須具有血清成分的參與，骨關(guān)節(jié)炎軟骨內(nèi)血管生成很可能是開(kāi)啟了軟骨內(nèi)的成骨階段，進(jìn)而致使軟骨礦化。但是其研究只是通過(guò)病理染色間接推論，并未直接對(duì)血管增生進(jìn)行監(jiān)測(cè)。這項(xiàng)研究經(jīng)過(guò)對(duì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎不同階段骨軟骨復(fù)合體的顯微CT定量研究中能夠得出，在骨關(guān)節(jié)炎初期階段，骨軟骨復(fù)合體骨質(zhì)量一直屬于降低的階段，在術(shù)后9周左右達(dá)到最低，在術(shù)后12周骨關(guān)節(jié)炎晚期，Tb.Th、BMD、BVF則上升至最高。由于炎性因子的刺激和微血管的侵入所致使軟骨下骨板骨小梁遭到損壞和礦物質(zhì)流失，這實(shí)際上就是起初骨質(zhì)量降低的主要因素，但是在關(guān)節(jié)炎的晚期階段，因?yàn)殛P(guān)節(jié)當(dāng)中環(huán)境的紊亂、長(zhǎng)時(shí)間病理性所受到的刺激，成骨細(xì)胞比較活躍，主要交界的少數(shù)軟骨鈣逐漸變得緊密，提高軟骨下骨板的骨密度和骨礦化程度[14-15]。血管增生的變化則與骨質(zhì)量的變化相反，在骨關(guān)節(jié)炎早期呈上升趨勢(shì)，在術(shù)后9周達(dá)到最高峰，術(shù)后12周微血管增生則降至最低，袁雪凌等[4]在兔膝骨關(guān)節(jié)炎血管增生研究中通過(guò)免疫組化染色也得到相似的結(jié)論。這就證明了在骨關(guān)節(jié)炎起初階段，由于軟骨下骨發(fā)生病變，導(dǎo)致會(huì)新生血管增大速度加快，提高破骨細(xì)胞的整體活動(dòng)，骨軟骨復(fù)合體當(dāng)中形成一種極為特殊微管道，微血管經(jīng)過(guò)特殊微管道主見(jiàn)進(jìn)入到軟骨層當(dāng)中，導(dǎo)致潮線出現(xiàn)重疊情況[16-17]。軟骨內(nèi)血管的增生會(huì)提高軟骨的損害，進(jìn)而其還會(huì)釋放出一些細(xì)胞因子，提高新生血管的產(chǎn)生，在晚期病變中，由于骨贅增生會(huì)控制血管生成因子的釋放，致使血管增生逐漸降低。微血管侵入和軟骨損壞的互相作用證明血管增生的水平可反映關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度[18]。

綜上所述，本研究通過(guò)顯微CT對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)骨軟骨復(fù)合體的骨質(zhì)量與血管增生進(jìn)行定量測(cè)定，提示在骨關(guān)節(jié)炎不同時(shí)期，骨質(zhì)量與血管增生呈時(shí)間依從性變化，具有相關(guān)性，為骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中血管增生理論提供了進(jìn)一步的佐證，同樣還為臨床早期干擾骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展提供了全新的思路。

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