王國旗，唐佩福

解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853

感染是導(dǎo)致創(chuàng)面難以愈合的重要因素之一[1-4]。由于感染等因素導(dǎo)致的創(chuàng)面難以愈合困擾著相當(dāng)比例的人群。近年來眾多研究相繼報道負壓創(chuàng)面療法(negative pressure wound therapy，NPWT)在感染性創(chuàng)面中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其可以有效減輕創(chuàng)面感染程度，加速創(chuàng)面愈合[5-9]。課題組前期對負壓創(chuàng)面療法治療金黃色葡萄球菌感染創(chuàng)面進行了研究，發(fā)現(xiàn)其可以減少創(chuàng)面細菌數(shù)量、促進創(chuàng)面愈合[10-12]。本研究對負壓創(chuàng)面療法治療的銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面的愈合程度進行定量分析，并與傳統(tǒng)無菌紗布治療進行對比，以探索負壓創(chuàng)面療法治療感染創(chuàng)面的優(yōu)勢。

材料和方法

1 實驗動物 選取巴馬香豬18只，購自解放軍醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)動物中心，體質(zhì)量15 kg左右，雌性，術(shù)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院動物倫理委員會審批。

2 銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面的模型建立 常規(guī)麻醉、瑪貝拉脫毛膏脫毛、消毒，然后在巴馬香豬背部建立一個直徑50 mm深達肌肉層的軟組織創(chuàng)面，去除肌肉腱膜，充分止血后接種0.5 ml(總菌量約為5×107CFU)銅綠假單胞菌菌液，涂抹均勻，半透明膜敷料覆蓋24 h，以確保細菌的穩(wěn)定黏附和定植。

3 分組及處理 半透明膜敷料覆蓋24 h后(建模成功，0 d)將巴馬香豬隨機分為負壓創(chuàng)面療法組和無菌紗布治療組并分別進行治療。每天密切觀察敷料變化情況，每2 d更換敷料1次。負壓創(chuàng)面療法組敷料購自武漢維斯第公司，對照組紗布為臨床常用無菌紗布。整個治療過程中兩組未采用抗生素等其他治療措施。分別于0 d、4 d、8 d、12 d、16 d定量檢測創(chuàng)面大小，充分麻醉后切取創(chuàng)面肌肉組織2塊(每4天取材1次)，大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，重量不低于200 mg，取材時注意標(biāo)記創(chuàng)面?zhèn)取Ｓ糜谏L因子表達水平檢測的標(biāo)本保存于-80℃冰箱中，用于組織病理學(xué)檢測的標(biāo)本保存于10%中性甲醛溶液中。

4 熒光定量PCR檢測VEGF和TGF-β1表達首先提取總RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后按照熒光定量PCR說明書分別加入相應(yīng)試劑、引物、提取的總RNA樣品等進行PCR反應(yīng)。熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理方法：變化的倍數(shù)(fold change)=2-ΔΔCT；ΔΔCT=(CT靶基因-CT內(nèi)參)實驗組-(CT靶基因-CT內(nèi)參)對照組。

圖 1 軟組織創(chuàng)面外相 (0 d代表建模成功， 4 d代表治療的第4天， 后面的以此類推)Fig. 1 Appearance of wounds (0 d represents the successful establishment of model and 4 d means the 4th day of treatment, so on and so forth)

5 免疫組化染色 觀察新生毛細血管抗CD31抗體購自英國Abcam公司。首先將標(biāo)本制作成蠟塊，進行組織切片。然后依據(jù)說明書經(jīng)過脫蠟、檸檬酸-檸檬酸鈉修復(fù)、加胎牛血清、加一抗、過夜、加入二抗、沖洗、終止顯色、封片等步驟進行染色。采用Image Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件對免疫組化切片進行分析，巴馬香豬標(biāo)本檢測參數(shù)包括毛細血管面積。其中毛細血管面積檢測：在同一標(biāo)本中隨機選取5個視野，應(yīng)用軟件測算每個視野中毛細血管的面積(Area)，取平均值。

6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用兩因素重復(fù)測量方差分析對各定量指標(biāo)進行比較，事后檢驗采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 創(chuàng)面外觀及覆蓋情況 在治療第4天時對照組創(chuàng)面較為污穢并且存在大量膿樣物，實驗組盡管存在少量污物，但已經(jīng)可見肉芽組織生長。治療第8天，對照組創(chuàng)面可見黑色痂，創(chuàng)面中心可見新生肉芽組織，此時實驗組依然可見膿性物質(zhì)，而且主要集中在創(chuàng)面的邊緣，但創(chuàng)面中心明顯富含新鮮肉芽組織。治療第12天，對照組創(chuàng)面黑痂中心發(fā)紅，而實驗組創(chuàng)面新生肉芽組織豐富，肉眼已經(jīng)看不到膿性物質(zhì)，創(chuàng)面明顯小于對照組。治療第16天，實驗組創(chuàng)面已與周圍組織平齊，缺損組織已由肉芽組織填充，已經(jīng)不再需要負壓吸引，創(chuàng)面依然小于對照組(P＜0.01)。負壓創(chuàng)面療法組和對照組創(chuàng)面完全愈合時間分別為(18.8±2.0) d和(23.5±2.7) d (P＜0.01)。創(chuàng)面愈合情況及直徑大小結(jié)果見圖1和圖2。

2 肉芽組織厚度分析 在治療的第4天顯微鏡下兩組均已出現(xiàn)肉芽組織，而負壓創(chuàng)面療法肉芽組織厚度明顯大于對照組(P＜0.01)。隨著治療時間的延長，兩組創(chuàng)面肉芽組織厚度均逐漸升高，但實驗組肉芽組織厚度明顯高于對照組(P均＜0.01)。肉芽組織厚度示意圖及隨治療時間變化見圖3。圖 2 軟組織創(chuàng)面直徑大小隨治療時間延長的變化情況(aP＜0.01)Fig. 2 Diameter of wounds changes over time (aP＜0.01)

圖 3 兩組新生肉芽組織厚度比較(aP＜0.01, vs對照組)Fig. 3 Comparison of epithelial tissue thickness between two groups(aP＜0.01, vs control group)

圖 4 兩組VEGF表達對比(aP＜0.05，bP＜0.01, vs對照組)Fig. 4 Comparison of expression level of VEGF between two groups(aP＜0.05, bP＜0.01, vs control group)

3 生長因子表達比較 治療第4天、第8天、第12天和第16天負壓創(chuàng)面療法組VEGF表達水平均高于對照組(P＜0.05)，見圖4。治療的第8天、第12天和第16天負壓創(chuàng)面療法組TGF-β1表達水平明顯高于對照組(P＜0.01)。見圖5。

4 新生毛細血管定量分析 以建模前軟組織內(nèi)毛細血管面積為參考(此時血管面默認為“1”)，從治療的第4天開始兩組新生毛細血管面積均逐漸增加，在治療的第4、8、12、16天負壓創(chuàng)面療法血管面積明顯大于對照組(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。見圖6。

圖 5 兩組TGF-β1表達水平對比(aP＜0.01, vs對照組)Fig. 5 Comparison of expression level of TGF-β1 between two groups (aP＜0.01, vs control group)

圖 6 兩組新生毛細血管面積對比(aP＜0.05，bP＜0.01, vs對照組)Fig. 6 Comparison of area of newborn capillaries (Fold change,aP＜0.05，bP＜0.01, vs control group)

討 論

感染創(chuàng)面的修復(fù)過程主要分為3個階段，即損傷后炎癥反應(yīng)階段、肉芽組織形成階段、瘢痕形成階段。如果某一階段時間延長，那么整個愈合時間也會延長，如感染持續(xù)存在就會導(dǎo)致局部持續(xù)性的炎癥反應(yīng)，進而延長這一階段的時間。要治愈軟組織感染，一方面要去除破壞軟組織的不利因素，這些因素包括細菌、生物膜、毒素、過度表達的細胞因子等，另一方面要促進創(chuàng)面局部血液供應(yīng)、形成新鮮肉芽組織給植皮或封閉創(chuàng)面等提供有利條件。臨床上實現(xiàn)上述目的通常采用外科清創(chuàng)、局部應(yīng)用抗菌劑、無菌紗布覆蓋等措施[13-15]。但通常情況下外科清創(chuàng)會清除較多的正常軟組織以減少創(chuàng)面細菌及生物膜的殘留，這種情況可能不利于愈合。因此，這種方法更傾向于首先消滅細菌，之后處理愈合問題。負壓創(chuàng)面療法是處理開放合并軟組織感染創(chuàng)面的重要方法之一，目前臨床上應(yīng)用廣泛[16-18]。

本研究發(fā)現(xiàn)負壓創(chuàng)面療法治療下銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面與對照組相比更清潔，但創(chuàng)面仍有膿性分泌物，直到治療的第8天仍可見。盡管有感染的存在，負壓創(chuàng)面療法組創(chuàng)面隨著治療時間延長明顯縮小，其在治療的第8天開始明顯小于對照組。肉芽組織厚度分析顯示，從治療的第4天開始負壓創(chuàng)面療法組創(chuàng)面新生肉芽組織厚度明顯厚于對照組。而兩組在治療的第4天時創(chuàng)面均有膿性物質(zhì)，對照組相對明顯。這說明負壓創(chuàng)面療法治療時，盡管創(chuàng)面依然存在感染，但已經(jīng)開始形成新鮮的肉芽組織。這可能得益于負壓創(chuàng)面療法在負壓吸引下海綿孔對創(chuàng)面進行的物理牽拉作用。因此，負壓創(chuàng)面療法治療時肉芽組織形成較多可能是其促進愈合的重要機制之一。

與常規(guī)無菌紗布治療相比，負壓創(chuàng)面療法治療時創(chuàng)面VEGF表達水平明顯增高，說明負壓創(chuàng)面療法可以去除銅綠假單胞菌生物膜對創(chuàng)面VEGF的抑制，為VEGF促進局部新生組織內(nèi)血管的形成提供條件，間接地加強了創(chuàng)面細菌的清理；而新生毛細血管定量分析結(jié)果進一步證實了負壓創(chuàng)面療法的作用。TGF-β1表達水平增加，促進創(chuàng)面的表皮修復(fù)，加速創(chuàng)面的覆蓋，而負壓創(chuàng)面療法由于負壓作用自身帶有組織牽拉的作用，也可以刺激肉芽的生長及表皮爬行。

本研究的不足：未對創(chuàng)面細菌變化進行定量分析；未對負壓創(chuàng)面療法治療下創(chuàng)面免疫表達變化進行分析。

綜上，負壓創(chuàng)面療法是處理軟組織感染創(chuàng)面的有效方法之一，與常規(guī)無菌紗布覆蓋治療相比，負壓創(chuàng)面療法可有效促進開放傷軟組織感染創(chuàng)面新生肉芽組織的形成，加快創(chuàng)面愈合。

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