李 峰，張新勝，徐 慶，張 永，于曉明，劉 鹿，楊雪艷，劉英華，薛長勇空軍總醫(yī)院 營養(yǎng)科，北京 004；解放軍總醫(yī)院 營養(yǎng)科，北京 00853

中鏈脂肪酸聯(lián)合α-亞麻酸對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶行為及大腦Aβ42、Tau蛋白表達的影響

李 峰1，張新勝2，徐 慶2，張 永2，于曉明2，劉 鹿2，楊雪艷2，劉英華2，薛長勇21空軍總醫(yī)院 營養(yǎng)科，北京 100142；2解放軍總醫(yī)院 營養(yǎng)科，北京 100853

目的 探討中鏈脂肪酸(medium-chain fatty acid，MCFA)和α-亞麻酸(α-linolenic acid，ALA)對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能及大腦Aβ42、Tau蛋白表達的影響。方法 將25只4周齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為ALA+MCFA組(8只)、MCFA組(9只)和長鏈脂肪酸(long chain fatty acid，LCFA)組(8只，對照組)，同窩野生型小鼠為WT組(10只，正常對照組)。各組小鼠用不同脂肪酸配制飼料連續(xù)喂養(yǎng)至36周齡，用Morris水迷宮進行定位航行實驗和空間探索實驗，并記錄平均逃避潛伏期、平臺穿越次數(shù)和平臺象限滯留時間百分比。免疫組化法檢測海馬Aβ沉積，Western blot方法檢測APP、Aβ42蛋白及Tau蛋白表達。結(jié)果 與LCFA組小鼠相比，ALA+MCFA組和MCFA組小鼠水迷宮定位航行試驗平均逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，空間探索試驗平臺穿越次數(shù)則明顯較高(P＜0.05)，海馬組織Aβ斑塊數(shù)目相對較少，且皮質(zhì)和海馬Aβ42蛋白及Tau蛋白表達均較低(P＜0.05)。結(jié)論 與LCFA相比，ALA和MCFA能通過減少Aβ42蛋白生成及Tau蛋白磷酸化水平，改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能，具有潛在的延緩阿爾茨海默病發(fā)生和進展的作用。

中鏈脂肪酸；α-亞麻酸；阿爾茨海默??；APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠；Morris水迷宮

材料和方法

1 實驗動物與分組 SPF級12周齡健康雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠25只(APPSWe.PSEN1d9)，實驗動物許可證編號SCXK(滬)2017-0010，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，隨機分為ALA+MCFA組8只、MCFA組9只、長鏈脂肪酸(long chain fatty acid，LCFA)組8只，經(jīng)鑒定后同窩陰性野生型小鼠(不含APP及PS1基因型)10只作為WT組。

2 實驗用脂肪酸來源及飼料配方 ALA、MCFA和LCFA均由日清奧利友(中國)投資有限公司提供。在普通大小鼠維持期飼料(AIN-96G)基礎(chǔ)上，ALA+MCFA組分別添加5%的ALA和MCFA，MCFA組和LCFA組分別添加10%的MCFA和LCFA(飼料配方見表1)。

3 主要試劑及儀器 Morris水迷宮系統(tǒng)(北京智鼠多寶生物科技有限責任公司)、梅特勒ME104E分析天平，解剖器械，酶標儀(航新ZS-2SWK)，臺式高速冷凍離心機TGL-16(湘儀公司)等。

4 檢測指標 1)Morris水迷宮試驗：干預(yù)至36周齡時行Morris水迷宮實驗[7](Morris water maze，MWM)，先行定位航行實驗訓(xùn)練，連續(xù)4 d，每日以小鼠四個象限的逃避潛伏期均值作為小鼠當日的學(xué)習(xí)成績。第5天行空間探索試驗，記錄小鼠60 s內(nèi)在平臺象限的滯留時間百分比以及穿越目標象限平臺的次數(shù)。2)小鼠大腦海馬和皮質(zhì)病理：第37周齡時麻醉處死各組小鼠，每組隨機取2只小鼠左半腦置于2%多聚甲醛固定24 h后作包埋、切片等處理，采用SP方法進行免疫組化染色。以兔抗APP抗體(ab15272)、Aβ1-42抗體(ab201060)、Tau抗體(ab32057)(1∶200)抗體為一抗，二抗孵育37℃20 min(山羊抗兔超敏二步法PV9001)，冷衫膠封片顯微鏡觀察。3)Western blot免疫印跡檢測：每組隨機各取3只小鼠大腦，小心分離完整的皮質(zhì)和海馬組織(冰上操作)，按質(zhì)量與體積比1∶9加入1×細胞裂解液，常規(guī)操作處理后，加入APP抗體(ab15272)、Aβ1-42抗體(ab201060)、Tau抗體(ab32057)4℃過夜，TBST漂洗次3次，10 min/次；加入1∶10 000辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h；ECL發(fā)光液顯影。

表1 各組小鼠飼料脂肪酸配方Tab. 1 Compositions of diet formulas with different fatty acid for experimental mice

5 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，平臺穿越次數(shù)數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，以中位數(shù)(最大值，最小值)表示，四組比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Bonferroni法；其余實驗數(shù)據(jù)均以-x±s表示，其中定位航行實驗數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析方法，兩兩比較采用LSD法；其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett t法(以LCFA組為控制組)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般情況 ALA+MCFA及MCFA組小鼠均無異常，LCFA組2只小鼠出現(xiàn)咬傷、皮膚破潰，單籠喂養(yǎng)后1只死亡，另1只小鼠進行性體質(zhì)量下降；WT組1只小鼠在做水迷宮過程中死亡，相關(guān)數(shù)據(jù)均剔除。

2 ALA、MCFA、LCFA對攝食的影響 在9個月的干預(yù)期內(nèi)，ALA+MCFA、MCFA和LCFA組日均飼料消耗量和能量攝入量均無統(tǒng)計學(xué)差異，ALA+MCFA組日均飼料消耗量和能量攝入量則顯著高于MCFA組。見表2。

3 ALA、MCFA、LCFA對定位航行試驗的影響重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析顯示，連續(xù)4 d定位航行試驗過程中，4組小鼠的逃避潛伏期均值均不同程度地下降，WT組成績明顯好于其他三組(P＜0.05)；除了WT組，ALA+MCFA組第2、3、4天的潛伏期均值與另外兩組比較都是最低的，且顯著小于LCFA組(P＜0.05)，而在第4天時又明顯小于MCFA組，說明其學(xué)習(xí)能力最好；MCFA組潛伏期均值降低速度較穩(wěn)定，與LCFA組相比第1、4天時有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；各組與第1、2天的成績進行組內(nèi)比較顯示，僅ALA+MCFA組逃避潛伏期均值在第3、4天出現(xiàn)明顯下降(P＜0.05)，也說明該組小鼠學(xué)習(xí)能力改善最為顯著。見表3。

4 ALA、MCFA、LCFA對空間探索試驗的影響空間探索試驗中，4組小鼠在平臺所在象限(第3象限)穿越平臺次數(shù)的中位數(shù)：ALA+MCFA組2.5次，MCFA組2.0次，LCFA組0次，WT組3.0次。ALA+MCFA、MCFA組均高于LCFA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。4組小鼠在平臺象限滯留時間占總時間(60 s)的百分比：ALA+MCFA組27.54%，MCFA組27.54%，LCFA組17.63%，WT組38.28%；4組中WT組成績最好，ALA+MCFA組和MCFA組基本相同，LCFA組成績最差；與LCFA組相比，WT組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，ALA+MCFA和MCFA組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(見圖1，表4)。從歷時5 d的Morris水迷宮試驗結(jié)果來看，ALA+MCFA組和MCFA組學(xué)習(xí)記憶功能均優(yōu)于LCFA組，且小鼠逃避潛伏期均值、在平臺所在象限內(nèi)穿越平臺平均次數(shù)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明ALA和MCFA都能明顯提高APP/PSl轉(zhuǎn)基因模型小鼠Morris水迷宮成績，而添加ALA后效果更佳。定位航行試驗和空間探索實驗小鼠游泳軌跡見圖1。

表2 各組小鼠的平均攝入量Tab. 2 Average diet intakes of each group (-x±s)

表3 各組小鼠定位航行試驗4個象限中逃避潛伏期均值Tab. 3 Four quadrant average escape latencies of mice in place navigation test (s, -x±s)

表4 空間探索試驗結(jié)果Tab. 4 Results of spatial probe test in each group

表5 各組小鼠海馬、皮質(zhì)組織蛋白表達水平Tab. 5 Protein expression levels of cerebral hippocampus and cortex in each group (-x±s)

圖 1 各組小鼠定位航行和空間探索實驗游泳軌跡 A：ALA+MCFA； B：MCFA； C：LCFA； D：WTFig. 1 Representative pictures of swimming trails in place navigation test (day 4) and spatial probe test (day 5, no plate)A：ALA+MCFA； B：MCFA； C：LCFA； D：WT

5 Western blot檢測結(jié)果 Western印跡灰度應(yīng)用Scion image軟件分析后，各項指標與GADPH內(nèi)參值的面積灰度比值如表5、圖2所示，與WT組相比，APP/PS1三組小鼠海馬、皮質(zhì)的Aβ42、APP和Tau蛋白水平均不同程度增加(P＜0.05)。與LCFA組相比，ALA+MCFA組和MCFA組海馬和皮質(zhì)Aβ42和Tau蛋白表達量則明顯減少(P＜0.05)，APP水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。ALA+MCFA組與MCFA組皮質(zhì)Aβ42、APP和Tau蛋白水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，海馬APP、Tau水平也無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，但MCFA組Aβ42蛋白表達水平明顯較高(P＜0.05)。

圖 2 Western blot檢測小鼠大腦皮質(zhì)和海馬Aβ42、APP和Tau蛋白的表達A：皮質(zhì)； B：海馬； 1： MCFA； 2： ALA+MCFA； 3： LCFA； 4： WTFig. 2 Expression of Aβ42, APP and Tau protein in mice scerebral cortex and hippocampus detected by Western blotA: Cortex; B: hippocampus; 1: MCFA； 2: ALA+ MCFA； 3: LCFA； 4: WT

6 ALA、MCFA等對APP/PS1小鼠腦海馬組織Aβ沉積的影響 如圖3所示，Aβ沉積呈類圓形棕黃色斑塊。與野生對照組相比，AD模型組小鼠腦海馬Aβ斑塊數(shù)量明顯增多。與LCFA組相比，ALA+MCFA和MCFA組小鼠腦海馬組織CA1、DG區(qū)Aβ斑塊相對較少。

討 論

目前，Morris水迷宮實驗是研究小鼠學(xué)習(xí)記憶能力較為成熟可靠的方法[8]。筆者用不同脂肪酸配比飼料干預(yù)AD模型小鼠至9月齡時，發(fā)現(xiàn)與WT組相比，模型組小鼠反應(yīng)較遲鈍，Morris水迷宮試驗成績普遍較差，Western blot和病理免疫組化結(jié)果也顯示模型組小鼠出現(xiàn)不同程度AD表現(xiàn)。

圖 3 各組小鼠腦海馬DG、CA1區(qū)組織Aβ斑塊免疫組織化學(xué)染色， 放大倍數(shù)為10×10； 1：MCFA； 2：ALA+ MCFA； 3：LCFA； 4：WT)Fig. 3 Immunohistochemical staining results of Aβ plaque in cerebral hippocampus DG and CA1 (magnif i cation, 10×10; 1: MCFA; 2:ALA+MCFA; 3: LCFA; 4: WT)

MCFA具有快速被氧化、促進酮體生成等特點。研究指出生酮飲食可以減少AD模型小鼠Aβ42的含量[9]，其可能機制是AD患者神經(jīng)元獲取、轉(zhuǎn)運葡萄糖的能力下降，特別是在疾病早期，而酮體被證明是一種優(yōu)秀的替代性能源[10]。Rebello等[11]通過觀察輕度認知功能障礙(mild cognitive impairment，MCI)AD患者也進一步證實，連續(xù)24周每天攝入56 g中鏈三酰甘油(medium chain triglyceride，MCT)，可顯著提高患者酮體水平并改善記憶力。我們的研究也觀察到MCFA具有改善APPswe/PS1DE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠認知功能的作用。ALA則是所有n-3 PUFAs的前體物質(zhì)，可在人體內(nèi)合成二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)，再經(jīng)過β氧化作用轉(zhuǎn)換成二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)，從而發(fā)揮與DHA和EPA相似的生理功能[12]。國外有學(xué)者比較了AD患者、無癥狀A(yù)D患者和健康成人發(fā)現(xiàn)，AD患者大腦中ALA水平明顯下降，且AD患者＜無癥狀A(yù)D患者＜對照組[13]。更有研究證實紅細胞膜上的ALA與韓國老人患有輕度老年癡呆的風險有關(guān)，補充ALA可以降低癡呆發(fā)生的風險[14]。國內(nèi)學(xué)者研究指出，長期ALA治療可以降低大鼠腦內(nèi)Aβ的沉積，改善衰老相關(guān)性神經(jīng)病理改變[15]。也有研究證實，ALA可以調(diào)節(jié)APP加工和Aβ降解過程，從而抑制毒性蛋白Aβ的形成，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16]。Lee等[17]研究指出，ALA確實具有抑制膽固醇攝取和Aβ42細胞毒性的作用，因此具有潛在治療AD的能力。我們的研究結(jié)果也印證了此觀點，ALA和MCFA都能明顯改善APP/PSl轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶功能和病理情況，從本研究的結(jié)果可以看出兩者聯(lián)合作用時效果更佳。

綜上，可以認為ALA、MCFA均有改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用，其作用機制可能是減少AD模型小鼠Aβ42毒性蛋白的生成與沉積并降低了Tau蛋白的磷酸化水平。鑒于AD發(fā)生和進展等病理變化的復(fù)雜性，ALA和MCFA對大腦神經(jīng)元的保護作用以及其改善學(xué)習(xí)記憶功能的機制還需我們進一步深入研究。

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Effects of medium-chain fatty acid and α-linolenic acid on learning, memory behavior and expressions of Aβ42, Tau protein in brain in APP/PS1 transgenic mice

Objective To investigate the effects of medium-chain fatty acid (MCFA) and α-linolenic acid (ALA) on learning and memory behavior of APP/PS1 transgenic mice and expression levels of Aβ42 , Tau protein in their brains. Methods Twentyif ve APP/PS1 transgenic mice, aged 4 weeks, were randomly divided into ALA+MCFA group (combined intervention group, n=8),MCFA group (intervention group, n=9) and long chain fatty acid (LCFA) group (control group, n=8) according to their fasting body weight, and another 10 wild type mice (WT) served as normal control group. The mice were fed diets with different fatty acid formulas for 36 weeks. Then Morris water maze was used to perform place navigation test and spatial probe test, meanwhile the average escape latency, time across the platform and time percent during platform quadrant were recorded. Immunohistochemical assay was used to detect Aβ deposition in hippocampus, and the APP, Aβ42 and Tau protein levels were detected by western blot.Results Compared with LCFA group, the average escape latency of Morris water maze place navigation test in ALA+MCFA and MCFA group reduced signi fi cantly (P＜0.05), and the time across the platform on probe day was signi fi cantly greater (P＜0.05), Aβ plaques in hippocampus were relatively less, and the level of Aβ 42 and Tau protein in cortex and hippocampus were relatively lower (P＜0.05). Conclusion ALA and MCFA can improve the learning and memory function of the APP/PS1 transgenic mice by reducing the production of Aβ42 protein and the phosphorylation of Tau protein, therefore they may have the potential to delay the development and progress of Alzheimer's disease.

medium-chain fatty acid;α-linolenic acid; Alzheimer's disease; APP/PS1 transgenic mice; Morris water maze?種以記憶和認知損害為特點的神經(jīng)退行性疾病[1]，其病理表現(xiàn)主要包括β淀粉樣蛋白斑塊(amyloid plaques，AP)和神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)等[2]。進行性的認知功能損傷給AD患者日常生活造成極大的負面影響，隨著我國逐漸進入老齡化社會，AD也成為整個社會沉重的負擔，目前AD的治療僅限于對癥治療，因此前期的預(yù)防和干預(yù)是緩解AD發(fā)生和進展的關(guān)鍵措施[3]。大腦是人體中脂肪含量最多的器官，與各種脂肪酸的關(guān)系十分密切，脂類是組成大腦組織干重的主要物質(zhì)，不同脂肪酸對于腦神經(jīng)組織和認知功能的影響歷來是研究的熱點[4]。從美國Jackson實驗室引進的APPswe/PS1DE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠，可表達突變的人類早老素(DeltaE9)和人鼠淀粉樣前蛋白(APPswe)融合體[5]，是研究AD發(fā)病機制、病理學(xué)及行為學(xué)改變的理想動物模型。9月齡時該模型小鼠老年斑數(shù)量體積明顯增加，出現(xiàn)與阿爾茨海默病患者相似的老年斑改變[6]。本研究運用Morris水迷宮檢測9月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠經(jīng)不同脂肪酸干預(yù)后空間學(xué)習(xí)記憶功能變化情況，并使用Western blot和免疫組化法測定腦內(nèi)海馬和皮質(zhì)組織β淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)、β淀粉樣蛋白(amyloid-beta protein 42，Aβ42)、Tau蛋白水平，以闡明中鏈脂肪酸(medium chain fatty acid，MCFA)聯(lián)合 α-亞麻酸 (α-linolenic acid，ALA)改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦功能的作用機制，為將來MCFA和ALA應(yīng)用于AD患者或臨床前人群，延緩AD的發(fā)生和進展奠定理論基礎(chǔ)。

LI Feng1, ZHANG Xinsheng2, XU Qing2, ZHANG Yong2, YU Xiaoming2, LIU Lu2, YANG Xueyan2, LIU Yinghua2, XUE Changyong21Department of Nutrition, Chinese PLA Air Force General Hospital, Beijing 100142, China;2Department of Nutrition, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Corresponding author: XUE Changyong. Email: cnxcy@163.com; LIU Yinghua. Email: liuyinghua77@163.com

中圖分類號：R 749.16

A

2095-5227(2018)06-0523-06

10.3969/j.issn.2095-5227.2018.06.017網(wǎng)絡(luò)出版時間：2018-04-24 15:07 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/10.1117.R.20180424.1507.002.html

2018-01-31

國家自然科學(xué)基金項目(81541067)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (81541067)作者簡介：李峰，男，在讀碩士，主治醫(yī)師。Email: lifengineer@

163.com

薛長勇，男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。Email: cn xcy@163.com；劉英華，女，博士，副主任醫(yī)師，主任，碩士生導(dǎo)師。

Email: liuyinghua77@ 163.com