李清芳 梁艷 張峰 孫軼梅

摘要 目的：探討高效液相色譜法測(cè)定消銀膠囊中苦參堿和牛蒡苷的含量，闡釋中藥合理配伍的科學(xué)內(nèi)涵。方法：精密量取10 μL的樣品進(jìn)樣量或?qū)φ掌啡芤?，采?50 mm×4.6 mm，5 μm的色譜柱，選擇流動(dòng)相的條件是在乙腈和0.1%磷酸（12∶88）的中以1 mL/min的流速開展實(shí)驗(yàn)，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，根據(jù)高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜的梯度洗脫程序進(jìn)行試驗(yàn)，并在LCsolution色譜工作站上進(jìn)行指紋圖譜分析消銀膠囊中苦參堿和牛蒡苷的含量。結(jié)果：通過HPLC指紋圖譜分析，牛蒡苷和苦參堿對(duì)照品分別于供試品溶液的色譜峰保留時(shí)間一致，且陰性對(duì)照溶液未對(duì)其造成干擾影響。牛蒡苷此在0.14～3.5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；苦參堿在0.1～2.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。牛蒡苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果中平均回收率為99.80%，RSD為2.01%；苦參堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果中平均回收率為108.24%，RSD為1.97%。不同批次消銀膠囊中牛蒡苷和苦參堿的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），平均每粒消銀膠囊中牛蒡苷含量為0.817 mg，苦參堿為0.437 mg。結(jié)論：高效液相色譜法可用于消銀膠囊中苦參堿和牛蒡苷含量測(cè)定，進(jìn)而對(duì)該藥物進(jìn)行質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；消銀膠囊；苦參堿；牛蒡苷

Abstract Objective：To establish a HPLC method for determination of the content of matrine and Arctium lappa in Xiaoyin capsuler， and to explain the scientific connotation of the rational compatibility of Chinese medicine.Methods：The precise amount of 10 μL sample or standard solution was obtained， using 250 mm×4.6 mm， 5 μm chromatographic column.Mobile phase condition was in acetonitrile and 0.1% phosphoric acid （12：88） in a 1 mL/min flow to carry out the experiment， and the column temperature was 30 ℃.The detection wavelength was 230 nm， according to the high performance liquid phase （HPLC） test fingerprint gradient elution program， and the content of matrine and elimination of arctiin in Xiaoyin capsule fingerprint was analyzed in LCsolution chromatography workstation.Results：1） By HPLC fingerprint analysis， the retention time of the chromatographic peaks in the sample solution was consistent， and the negative control solution did not interfere with it.2） It had good internal relations in the range of 0.14～3.5 g， and the internal relations of matrine were good in the range of 0.1-2 g.3） The average recovery was 99.80%， and RSD was 2.01% in arctiin sample recovery test.The average recovery was 108.24% and RSD was 1.97% in matrine sample recovery test.4） There was no significant difference between the content of arctiin and matrine in different batches of Xiaoyin capsule （P>0.05）.The average content of arctiin in each capsule was 0.817 mg， and matrine was 0.437 mg.Conclusion：HPLC can be used to determine the content of matrine and arctiin in Xiaoyin capsule， and then to control the quality of the drug.

Key Words High performance liquid chromatography； Xiaoyin capsule； Matrine； Arctiin

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.047

消銀膠囊主要由苦參、牛蒡子、牡丹皮、赤芍等13味中藥材提取研制而成，目前是獨(dú)家生產(chǎn)品種。其中牛蒡子疏散風(fēng)熱、透疹消腫，苦參清熱燥濕、殺蟲止癢和余下藥物共奏清熱涼血，養(yǎng)血潤(rùn)燥，祛風(fēng)止癢之效。臨床上多運(yùn)用消銀膠囊治療白疵中歸屬于血熱風(fēng)燥和血虛風(fēng)燥的證型，其臨床表現(xiàn)多為皮疹為基底鮮紅色的點(diǎn)滴狀，表面覆有較干燥的銀白色鱗屑，或薄或厚，若基底淡紅色瘙癢較甚等[1-4]。按照我國(guó)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)工作提高的要求，本研究制定了HPLC分別測(cè)定芍藥苷和苦參堿含量的方法，使其與《中國(guó)藥典》2010版中中藥制藥標(biāo)準(zhǔn)得到統(tǒng)一和提升，更加有效地控制消銀膠囊的質(zhì)量[5-7]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜（HPLC）（島津2010-CHT高效液相色譜儀）；小型超聲波清洗器（型號(hào)：FR10系列，杭州法蘭特超聲波科技有限公司）。

1.2 試劑

購于中國(guó)食品藥品檢定研究院牛蒡苷對(duì)照品（批號(hào)：110819-200505）和苦參堿對(duì)照品（批號(hào)：770805-200508）。

1.3 分析樣品

取3個(gè)不同生產(chǎn)批次分別編號(hào)為001、002、003的消銀膠囊（陜西摩美得制藥有限公司；國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000110）；規(guī)格：0.3 g。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

精密量取10 μL的樣品進(jìn)樣量或?qū)φ掌啡芤?，采?50 mm×4.6 mm，5 μm的色譜柱（AgilentEclipse C18柱），選擇流動(dòng)相的條件是在乙腈和0.1%磷酸（12∶88）的中以1 mL/min的流速開展實(shí)驗(yàn)，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，根據(jù)HPLC指紋圖譜的梯度洗脫程序進(jìn)行試驗(yàn)，并在LCsolution色譜工作站上進(jìn)行指紋圖譜分析。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取購于中國(guó)食品藥品檢定研究院牛蒡苷對(duì)照品和苦參堿對(duì)照品置于容量瓶中，甲醇溶解，制成80 μg的對(duì)照品溶液。陰性對(duì)照溶液的制備：按照消銀膠囊的處方比例制備缺少牛蒡子和苦參的濃縮藥液，即為陰性對(duì)照溶液。

2.3 供試品溶液制備

取3個(gè)不同生產(chǎn)批次分別編號(hào)為001、002、003的消銀膠囊的內(nèi)容物，用研磨器研細(xì)，精密取1.5 g，置于精準(zhǔn)的50 mL容量瓶中以甲醇定容后加塞密封，采用精密電子天平稱定重量，放入500 W的小型超聲波清洗器處理30 min，放冷，稱重并以甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn)

根據(jù)2.3制備的供試品溶液，采用薄層層析的方法對(duì)消銀膠囊中的苦參堿和牛蒡苷進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，結(jié)果顯示苦參堿和牛蒡苷各自的專屬性均良好。

2.5 線性范圍試驗(yàn) 根據(jù)1.1制備的牛蒡苷和苦參堿對(duì)照品溶液，分別精密取0 μL、2 μL、6 μL、8 μL、10 μL、16 μL、20 μL，分別編號(hào)1～7并連續(xù)進(jìn)樣，以峰面積為Y軸，5 μL進(jìn)樣濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)對(duì)照品的回歸方程計(jì)算各有效成分在各自濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。以對(duì)照品為橫坐標(biāo)，峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得牛蒡苷回歸方程lnY=480.77X-67.535（R =0.9993），因此在0.14～3.5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖1；得苦參堿回歸方程lnY=1679X-60.808（R =0.9998），因此在0.1～2.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好[8-9]。見圖2。

2.6 中間精密度試驗(yàn)

精密吸取10 μL同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示相對(duì)標(biāo)注偏差RSD是0.88%，精度度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取10 μL同一供試品溶液，配置后分別放置0、2、4、8、16、24、48 h后進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示48 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定，RSD 0.97%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取10 μL同一供試品溶液，在相同色譜條件，相同液相分析儀上檢測(cè)5次，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.90%，重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 取6份同一批次供試品溶液，根據(jù)1.1制備的供試品溶液，編號(hào)A-F并分別加入2 mL牛蒡苷和苦參對(duì)照品溶液，計(jì)算供試品在HPLC中的加樣回收率。牛蒡苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果中平均回收率為99.80%，RSD為2.01%。見表1；苦參堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果中平均回收率為108.24%，RSD為1.97%。見表2；顯示牛蒡苷和苦參堿加樣回收率試驗(yàn)良好，HPLC嚴(yán)謹(jǐn)性高[10-11]。

2.10 樣品測(cè)定結(jié)果

2.10.1 消銀膠囊HPLC指紋圖譜

由圖3、4得，通過HPLC指紋圖譜分析，牛蒡苷和苦參堿對(duì)照品分別于供試品溶液的色譜峰保留時(shí)間一致，且陰性對(duì)照溶液未對(duì)其造成干擾影響。

2.10.2 牛蒡苷和苦參堿含量測(cè)定

不同批次消銀膠囊中牛蒡苷和苦參堿的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），每粒消銀膠囊中牛蒡苷平均含量為0.817 mg，苦參堿為0.437 mg。見表3。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本研究結(jié)合前期工作，根據(jù)本團(tuán)隊(duì)所查閱的資料[12-16]，分別用甲醇-水（47∶53）系統(tǒng)、乙腈-0.1%磷酸（12∶88）系統(tǒng)，研究結(jié)果顯示甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)均可以有效分離苦參堿和牛蒡苷，但是甲醇系統(tǒng)中容易產(chǎn)生特異倒峰干擾操作等導(dǎo)致基線噪聲較高，故最終選擇乙腈-0.1%磷酸，并采用三乙胺調(diào)節(jié)PH至8.0作為流動(dòng)相。為了進(jìn)一步降低基線噪聲，獲得最好的共有峰形，本研究對(duì)磷酸水的濃度進(jìn)行了考察，分別用0.1%、0.2%、0.3%的磷酸水溶液進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相的分離效果最好，能夠分離出最低基線噪聲且峰形最好。

3.2 HPLC嚴(yán)謹(jǐn)性考察意義

線性考查在某一個(gè)濃度或峰高（面積）情況下進(jìn)行樣品分析是否是準(zhǔn)確的，而準(zhǔn)確的概念就是要成線性，換句話說，在這個(gè)范圍內(nèi)，待測(cè)樣品面積要與濃度成正比，即符合紫外檢測(cè)器的朗伯比爾定律，因?yàn)橹挥羞@樣，在這個(gè)范圍內(nèi)濃度與面積成正比，分析結(jié)果才是準(zhǔn)確的。而加樣回收率包括絕對(duì)回收率和相對(duì)回收率，本研究涉及的是相對(duì)回收率；相對(duì)回收率嚴(yán)格來說有2種，一種是回收試驗(yàn)法，一種是加樣回收試驗(yàn)法[17-18]。而本研究的目的主要是為了考察HPLC的嚴(yán)謹(jǐn)性，因此選用加樣回收試驗(yàn)法，也就是是在已知濃度樣品中加入藥物，來和標(biāo)準(zhǔn)曲線比，標(biāo)準(zhǔn)曲線也是在基質(zhì)中加藥物[10]。

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