馬桂芝， 滕 亮， 蓋敏濤， 萬琪臻， 代己果

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部； 3第一附屬醫(yī)院心臟中心， 烏魯木齊 830054)

冠心病亦稱缺血性心臟病，目前已成為對人類健康和生命威脅最大的疾病之一，我國的缺血性心臟病發(fā)病率和死亡率也呈逐年上升趨勢，缺血性心臟病的預(yù)防和治療也得到了國內(nèi)外學(xué)者很大關(guān)注[1-3]。意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz．)為紫草科(Boraginaceae)多年生草木植物[4]，具有生濕生熱、潤燥消炎、止咳平喘等功效，主要用于高血壓、肺炎及結(jié)核疾病、寒性咳嗽、感冒、氣喘等疾病的治療[5]。本課題組前期研究結(jié)果表明意大利牛舌草乙醇提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護作用[6]，為進一步確定意大利牛舌草抗心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)，本實驗采用心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，通過測定心肌細(xì)胞存活率、氧化應(yīng)激指標(biāo)乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量，探究意大利牛舌草不同極性溶劑萃取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護作用，為闡明意大利牛舌草抗心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷物質(zhì)基礎(chǔ)及后續(xù)開發(fā)研究奠定試驗基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1藥材意大利牛舌草2014年6月購自新疆伊鼎輝煌生物科技有限公司，產(chǎn)地為巴基斯坦，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)教授鑒定為紫草科(Boraginaceae)多年生草木植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz)的干燥地上部分。

1.2實驗動物出生1～3 d的SD大鼠，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(新) 2011-0004。

1.3儀器SLI-400型孵育箱(日本東京理化器械制造廠)，SHZ-B型恒溫水浴搖床(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，DK-8D型恒溫水浴鍋(上海-恒科技有限公司)，SX-500型高壓滅菌鍋(日本Tomy Digital Biology公司)，Multiskan GO型酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher SCIENTIFIC公司)，HeraeusMultifuge X3R型離心機(中國香港Heal Force公司)，HF90型培養(yǎng)箱(中國香港Heal Force公司)，ZHJH-C1214B型雙人雙面超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.4試劑高糖、低糖DMEM培養(yǎng)液(美國HyClone公司，批號AAJ207748)，胎牛血清(美國HyClone公司，批號GYK0119)，青鏈霉素(美國HyClone公司，批號J160007)，谷氨酰胺(美國Sigma公司，批號RNBC5692)，膠原酶(美國Gibco公司，批號1133838)，0.1%胰酶(美國Worthington公司，批號45D15719)，0.25%胰酶(美國HyClone公司，批號J140051)，D-Hanhs液、非必需氨基酸(美國Sigma公司，批號RNBD6137)，總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20160511)，丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20160429)，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20160509)。

1.5方法

1.5.1 意大利牛舌草不同極性萃取物的制備 取意大利牛舌草100.0 g，加入800 mL 60%乙醇進行回流提取，提取3次，每次2 h，將提取液合并，減壓濃縮為浸膏，經(jīng)冷凍干燥得意大利牛舌草乙醇提取物。取意大利牛舌草乙醇提取物，以水懸浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，減壓濃縮，冷凍干燥，分別得到意大利牛舌草石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水萃取物。

1.5.2 心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng) 新生SD乳鼠心臟置于D-Hanks液中，排出殘留血液，剪取心尖1/3處，將心室剪為4～8瓣。放入提前配好并預(yù)冷的0.1%胰酶溶液中，置于4℃ 50次/min水浴搖床上，消化過夜。第2天用等體積的完全培養(yǎng)液中和胰酶，置于37℃水浴搖床以80次/min速度震蕩7～10 min后吸棄上清液，加入Ⅱ型膠原酶，置于37℃水浴搖床以80次/min速度震蕩7～10 min，加入等體積的完全培養(yǎng)液至消化完的上清液中終止消化，將終止消化的上清液置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，重復(fù)4～5次，直至組織完全消化，所得消化液 1 500 r/min離心5 min，以37℃完全培養(yǎng)液重懸得到細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)基中，并置于二氧化碳培養(yǎng)箱中差速貼壁2次(50、40 min)。收集并計錄細(xì)胞數(shù)，用預(yù)熱的完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞，置于常規(guī)培養(yǎng)箱(5%CO2，21%O2)培養(yǎng)，靜置培養(yǎng)48 h后換液。

1.5.3 細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型(H/R)的建立 取待處理細(xì)胞接種于無血清低糖培養(yǎng)基，放入缺氧密閉(5%CO2，95%N2；37℃)環(huán)境內(nèi)孵育6 h，再更換為正常培養(yǎng)基，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。

1.5.4 試驗分組 試驗分為12組，正常對照組，缺氧/復(fù)氧模型組，陽性對照(葛根素)組，處理組包括：低劑量乙酸乙酯萃取物處理組(缺氧/復(fù)氧+0.005 μg/mL意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物)、中劑量乙酸乙酯萃取物處理組(缺氧/復(fù)氧+0.01 μg/mL意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物)、高劑量乙酸乙酯萃取物處理組(缺氧/復(fù)氧+0.1 μg/mL意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物)、低劑量正丁醇萃取物處理組(缺氧/復(fù)氧+0.005 μg/mL意大利牛舌草正丁醇萃取物)、中劑量正丁醇萃取物處理組(缺氧/復(fù)氧+0.01 μg/mL意大利牛舌草正丁醇萃取物)、高劑量正丁醇萃取物處理組(缺氧/復(fù)氧+0.1 μg/mL意大利牛舌草正丁醇萃取物)、低劑量水萃取物處理組(缺氧/復(fù)氧+0.005 μg/mL意大利牛舌草水萃取物)、中劑量水萃取物處理組(缺氧/復(fù)氧+0.01 μg/mL意大利牛舌草水萃取物)、高劑量水萃取物處理組(缺氧/復(fù)氧+0.1 μg/mL意大利牛舌草水萃取物)。

1.5.5 MTT 比色法測定心肌細(xì)胞存活率 將心肌細(xì)胞接種于96孔板中，不同濃度梯度(0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1 000.00 μg/mL)意大利牛舌草極性不同溶劑萃取物(石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水萃取物)干預(yù)H/R心肌細(xì)胞，作用不同作用時間(1、6、12、24、48 h)，按“1.5.3”項下方法進行缺氧/復(fù)氧處理后，每孔加入 MTT 溶液20 μL(5 mg/mL) ，37℃孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，搖床緩慢振蕩 10 min，使結(jié)晶物完全溶解，用酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度，計算細(xì)胞存活率，確定不同濃度意大利牛舌草不同極性溶劑萃取物適宜的作用濃度與作用時間。

1.5.6 LDH、MDA、SOD表達(dá)水平的測定 心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后，進行相應(yīng)處理后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒操作方法測定 LDH。心肌細(xì)胞進行相應(yīng)處理后分別測定 SOD、MDA，實驗步驟按試劑盒說明操作。

2 結(jié)果

2.1不同濃度意大利牛舌草不同極性溶劑萃取物對心肌細(xì)胞存活率的影響

2.1.1 不同濃度意大利牛舌草石油醚萃取物對心肌細(xì)胞存活率的影響 將濃度為0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL的意大利牛舌草石油醚萃取物分別給予心肌細(xì)胞，預(yù)處理24 h后進行缺氧/復(fù)氧，用酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度，計算其存活率，濃度為0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL時，其細(xì)胞存活率分別為：(34.84±11.72)%、(34.11±6.87)%、(30.74±9.90)%、(28.57±6.76)%、(39.95±7.53)%、(83.79±7.18)%，與模型組比較，意大利牛舌草石油醚萃取物1 000μg/mL劑量組心肌細(xì)胞存活率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 不同濃度意大利牛舌草石油醚萃取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響(n=10)

2.1.2 不同濃度意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響 將濃度為0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL的意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物分別給予心肌細(xì)胞，預(yù)處理24 h后進行缺氧/復(fù)氧，酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度，計算其存活率，濃度為0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL時，其細(xì)胞存活率分別為：(84.92±5.58)%、(84.57±5.38)%、(74.37±4.05)%、(74.93±3.23)%、74.87±4.25)%、(64.57±8.42)%。與模型組比較，意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物0.01～100.00 μg/mL劑量組心肌細(xì)胞存活率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 不同濃度意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響(n=10)

2.1.3 不同濃度意大利牛舌草正丁醇萃取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響 將濃度為0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL的意大利牛舌草正丁醇萃取物分別給予心肌細(xì)胞，預(yù)處理24 h后進行缺氧/復(fù)氧，用酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度，計算其存活率，濃度為0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL時，其細(xì)胞存活率分別為：(82.31±6.10)%、(78.55±8.37)%、(81.94±7.68)%、(86.82±10.24)%、(85.06±6.00)%、(93.11±23.05)%。與模型組比較，意大利牛舌草正丁醇萃取物0.01～100.00 μg/mL劑量組心肌細(xì)胞存活率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～0.01)，見圖3。

圖3 不同濃度意大利牛舌草正丁醇萃取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響(n=10)

2.1.4 不同濃度意大利牛舌草水萃取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率 將濃度為0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL的意大利牛舌草水萃取物分別給予心肌細(xì)胞，預(yù)處理24 h后進行缺氧/復(fù)氧，酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度，計算其存活率，濃度為0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL時，其細(xì)胞存活率分別為：(79.37±12.18)%、(76.11±9.80)%、(81.90±9.00)%、(80.09±7.35)%、(85.24±7.38)%、(93.92±5.71)%，與模型組比較，意大利牛舌草水萃取物0.01～1 000.00 μg/mL劑量組心肌細(xì)胞存活率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～0.01)，見圖4。

圖4 不同濃度意大利牛舌草水萃取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響(n=10)

2.2意大利牛舌草不同極性溶劑萃取物不同預(yù)處理時間對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響

2.2.1 意大利牛舌草石油醚萃取物不同預(yù)處理時間對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響 給予細(xì)胞意大利牛舌草石油醚萃取物濃度為1 000 μg/mL，不同時間預(yù)處理(1、6、12、24、48 h)后，進行缺氧/復(fù)氧處理，用酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度，計算其存活率，細(xì)胞存活率分別為：(22.48±7.74)%、(31.03±9.18)%、(47.62±9.69)%、(54.99±15.16)%、(61.77±9.87)%。與模型組比較，意大利牛舌草石油醚萃取物48 h組心肌細(xì)胞存活率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

圖5 意大利牛舌草石油醚萃取物不同作用時間對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響(n=10)

2.2.2 意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物不同預(yù)處理時間對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響 給予細(xì)胞0.01 μg/mL的意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物，不同時間預(yù)處理(1、6、12、24、48 h)后，進行缺氧/復(fù)氧處理，用酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度，計算其存活率，細(xì)胞存活率分別為：(80.77±16.91)%、83.73±7.02)%、(89.51±4.06)%、(81.11±11.08)%、(98.12±1.42)%。與模型組比較，意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物1、6、12、24、48 h組心肌細(xì)胞存活率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖6。

圖6 意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物不同作用時間對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響(n=10)

2.2.3 意大利牛舌草正丁醇萃取物不同預(yù)處理時間對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響 給予細(xì)胞濃度為0.01 μg/mL的意大利牛舌草正丁醇萃取物，不同時間預(yù)處理(1、6、12、24、48 h)后，進行缺氧/復(fù)氧處理，用酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度，計算其存活率，細(xì)胞存活率分別為：(72.19±12.46)%、(71.64±10.23)%、(73.11±10.96)%、(75.87±10.20)%、(63.72±11.06)%。與模型組比較，意大利牛舌草正丁醇萃取物1、6、12、24 h組心肌細(xì)胞存活率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖7。

2.2.4 意大利牛舌草水萃取物不同預(yù)處理時間對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響 給予細(xì)胞濃度為0.01 μg/mL的意大利牛舌草水萃取物，不同時間預(yù)處理(1、6、12、24、48 h)后，進行缺氧/復(fù)氧處理，用酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度，計算其存活率，細(xì)胞存活率分別為：(70.90±20.20)%、(72.03±15.13)%、(68.65±8.75)、(84.27±10.53)%、(82.34±9.51)%。與模型組比較，意大利牛舌草正丁醇萃取物24、48 h組心肌細(xì)胞存活率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖8。

圖7 意大利牛舌草正丁醇萃取物不同作用時間對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響(n=10)

圖8 意大利牛舌草水萃取物不同作用時間對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響(n=10)

2.3意大利牛舌草不同極性溶劑萃取物對LDH釋放量、SOD活力及MDA生成量的影響與對照組比較，模型組心肌細(xì)胞內(nèi)LDH、MDA含量增高、SOD含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，高劑量的意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物組LDH、MDA含量降低，SOD含量增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 意大利牛舌草不同極性萃取物對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

注：與對照組比較，*P<0.05； 與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與葛根素組比較，&P<0.05。

3 討論

體外抗心急缺血研究方法目前主要為應(yīng)用心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型評價受試物對模型細(xì)胞的存活率的影響，其中物理性缺氧模型在氧濃度5%～8%條件下即可形成缺氧環(huán)境，造模難度小，得到的模型穩(wěn)定，同時可以排除神經(jīng)、體液等復(fù)雜因素的影響，是常用的氧化應(yīng)激的模型方法[7-8]。心肌細(xì)胞缺氧及缺糖，能量耗竭，培養(yǎng)基中乳酸鹽積聚，引起心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能損害，細(xì)胞膜通透性增高，導(dǎo)致胞漿酶(LDH、MDA)釋放[9]，SOD作為一種抗氧化酶，可以抵抗機體受氧化損傷，其活性高低也可反映機體抗體抗氧化能力，在機體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用[10]。本實驗研究表明，高劑量的意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物組可明顯降低由缺氧/復(fù)氧損傷引起的心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH、MDA含量升高，并提高了抗氧化應(yīng)激SOD水平，其中乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物因較小的有效劑量與較短的干預(yù)時間顯示了對損傷心肌細(xì)胞較強的保護作用，其機制可能與清除氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA，增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD活性有關(guān)，具體的作用機制還需進一步研究。