食源性腹瀉副溶血弧菌分離株調(diào)查分析

強鑫華 周麗華 王萍 柳秋霞

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是我國沿海地區(qū)食源性暴發(fā)疾病中最常見的一種病原菌，近幾年隨著海鮮類食品在市場的廣泛流通，VP所引發(fā)的食物中毒的發(fā)生率也逐漸增多。從我國食源性疾病監(jiān)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)顯示，由VP引起的食物中毒呈顯著上升趨勢，成為我國首要食源性致病菌［1-2］。本文對125株VP季節(jié)分布及感染患者年齡特征、血清分型、毒力基因進行分析，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2014年1月至2016年12月本院腸道門診急性腹瀉患者糞便分離的VP，共125株。

1.2 菌株分離鑒定 采集腹瀉患者新鮮糞便或肛拭子按照浙江省CDC《2015年食源性疾病主動監(jiān)測工作手冊》的要求接種培養(yǎng)，對可疑分離菌株經(jīng)全自動細菌鑒定儀Vitek-compact2鑒定到種。

1.3 菌株血清分型 使用副溶血性弧菌血清分型試劑盒進行菌體抗原（O）與莢膜抗原（K）凝集試驗。K抗原分型：直接取新鮮的 3%NaCl營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物進行玻片凝集。O抗原分群：以0.85%生理鹽水懸浮培養(yǎng)物制成約7個麥?zhǔn)蠁挝坏木鶆驊乙海?21℃高壓1h后取裂解液進行玻片凝集。所用凝集血清均購自日本生研株式會社Denka Seiken公司，效期內(nèi)使用。

1.4 毒力基因檢測 采用熱裂解法提取VP模板DNA，具體操作如下：將分離的副溶血菌株接種至5ml營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)過夜，10000r/min離心5min，棄上清液；加入1ml生理鹽水，震蕩分散細菌，10000r/min離心5min，棄上清液；向沉淀中加100μl無菌蒸餾水，重新振蕩懸浮后置100℃水浴10min；13000r/min離心10min，上清液即為PCR擴增所用的模板DNA，最后應(yīng)用單重PCR檢測trh、tdh兩種毒力基因。

1.5 主要儀器 Vitek-compact2鑒定儀，生物梅里埃公司生產(chǎn)；DNA Engine PCR擴增儀，美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。

2 結(jié)果

2.1 感染季節(jié)分布特點 125株VP感染患者的發(fā)病呈明顯季節(jié)分布，每年6～10月份為發(fā)病高峰期，冬春季發(fā)病較少，檢出最高峰在8～9月份。見圖1。

圖1 125株副溶血弧菌年度季節(jié)分布特點

2.2 感染患者年齡分布特點 VP感染的腹瀉患者年齡21～30歲占37.6%，31～40歲占24.8%，總體以青壯年為居多，見表1。

2.3 血清學(xué)分型 125株VP，共分離出17個血清型，其中部分菌株在所購買的血清試劑盒范圍內(nèi)不凝集，血清可分型菌株占93.6%，其中O3：K6占59.2%，O4：K8占10.4%，其他血清型散在分布。本地區(qū)感染的VP以O(shè)3：K6、O4：K8為優(yōu)勢血清型。

2.4 毒力基因 125株副溶血弧菌分離株中88.0%攜帶 tdh+/trh-毒力基因，6.40%攜帶 tdh-/trh-毒力基因，2株攜帶tdh+/trh+基因。見表2。

表1 125例腹瀉感染患者年齡段分布［n（%）］

表2 125株副溶血弧菌血清型分布及毒力基因攜帶情況

3 討論

VP主要分布于沿海、海河交界處及海產(chǎn)品中，然而隨著經(jīng)貿(mào)交通迅速發(fā)展，海產(chǎn)品在內(nèi)地城市大量銷售，但由于不能保證低溫貯運或保管不當(dāng)，發(fā)生由VP引起的食物中毒事件越來越多，有沿海地區(qū)逐漸向內(nèi)地發(fā)展趨勢［3］。不同地區(qū)流行的VP菌株存在較大差異。文獻報道，湖州地區(qū)雖不是沿海城市，但VP感染患者時有發(fā)生，且呈逐年遞增的趨勢。本資料顯示，VP感染在夏季盛行，這與夏季氣溫高，病原菌繁殖迅速，食品易發(fā)生變質(zhì)。從感染人群分析，21～30歲的人感染率最高，處于這個年齡段的人，大多還處于學(xué)生階段亦或是剛步入社會，食用飯店、食堂、快餐店制作及小販兜售的食品、各類外賣居多，而這些地方食品制作不衛(wèi)生的可能性較大，增加食源性病原體污染食品的幾率。

目前研究認為約75種VP的血清型與人類腹瀉有關(guān)［4］。本資料顯示，17種血清型中主要流行菌型為O3：K6占59.2%；其次是O4：K8占10.4%，與目前國內(nèi)外流行的血清型基本一致［5-7］。VP主要的致病因子包括耐熱的直接溶血素（TDH）和直接溶血相關(guān)毒素（TRH）。TDH不僅具有溶血活性，還具有細胞毒性、心臟毒性和腸毒性，是VP的主要毒力因子，TRH具有溶血作用和腸毒素作用，是VP的另一個重要的毒力因子。本資料用單重PCR擴增檢測，引起腹瀉的VP 88.0%攜帶tdh+/trh-，2株攜帶 tdh+/trh+。本資料顯示，8株不攜帶毒力基因 tdh-/trh-的菌株也具有致病性，推測這與III型分泌系統(tǒng)（T3SS）有關(guān)。目前研究表明，副溶血弧菌除TRH和TDH兩種毒力基因外，還存在T3SS，更有研究報道T3SS1與細胞毒素有關(guān)，T3SS2與腸毒素有關(guān)［8］。

隨著抗生素的濫用、環(huán)境因素及食品加工的不規(guī)范，使副溶血弧菌引發(fā)的食源性疾病治療難度有所升高，而副溶血弧菌的感染率還出現(xiàn)逐年遞增的趨勢。因此，應(yīng)加強對食源性腹瀉的預(yù)防和監(jiān)測。