吳世玉，孟祥敏，劉俊梅，王丹洋，周琪，鄭常領(lǐng)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

中國林蛙（Rana temporaries chensinensis Da-vid）俗稱田雞、哈士蟆，屬兩棲綱、無尾目、蛙科、林蛙屬，主產(chǎn)于我國東北地區(qū)。中國林蛙體內(nèi)富含蛋白質(zhì)、糖類以及多種維生素和激素等營養(yǎng)成分[1]，具有重要的保健功能[2]。長白山地區(qū)林蛙溝系就達(dá)到2 100多條，占全省總量的四分之一作用，養(yǎng)殖面積超過148萬公頃，年產(chǎn)林蛙油超過30 t，其副產(chǎn)物林蛙卵超過35 t。林蛙卵是林蛙油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物之一，林蛙卵的年產(chǎn)量大且未能得到充分利用逐漸得到關(guān)注[1]。目前，關(guān)于林蛙卵油、林蛙多糖和林蛙卵蛋白的報(bào)道較多，林蛙卵油具有抗驚厥[3]、抗焦慮[4]和調(diào)節(jié)血脂[5]等作用；林蛙卵多糖具有抗腫瘤[6]、抗氧化[7]、降血糖[8]、降血脂[9]等作用；林蛙卵蛋白具有抗疲勞[10]、抗癌[11]等作用。而關(guān)于林蛙卵黑色素的報(bào)道較少。

近些年的研究發(fā)現(xiàn)，黑色素具有一系列功能活性，Tu等[12]研究表明從烏骨雞肌肉中提取的黑色素具有很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力；Manning等[13]報(bào)道黑色素可以抑制艾滋病病毒的增殖；Sava等[14]研究發(fā)現(xiàn)從紅茶葉中提取的黑色素具有免疫調(diào)節(jié)功能。本研究以林蛙卵為原料，采用酶水解結(jié)合堿液除蛋白的方法提取林蛙卵黑色素，通過對林蛙卵黑色素溶解性試驗(yàn)、紫外光譜掃描、紅外光譜掃描、元素含量測定和體外抗氧化試驗(yàn)，為林蛙卵黑色素進(jìn)一步的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

鮮林蛙卵：國藥（延邊）林蛙生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

丙酮、己腈、石油醚、乙醚、無水乙醇、乙醇、乙酸、甲酸、甲醇、己烷、氯仿、氫氧化鈉等均為分析純試劑：南京化學(xué)試劑有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力1 000 U/mg）：北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2，6-2 tertiary butyl-4-methyl phenol，BHT）、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）均為分析純：美國Sigma公司；甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑、核黃素均為分析純：上?；菖d化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器

SY11-Ni水浴鍋：北京市長風(fēng)儀器儀表公司；3K15高速冷凍離心機(jī)：美國Sigma公司；CHA-S恒溫振蕩器（國華企業(yè)）、UV-2802紫外分光光度計(jì)：Agilent Technologies Co.Ltd.；FT-IR200傅立葉變換紅外光譜儀：天津金貝兒科技有限公司；Elementar Vario EL III元素分析儀：德國Elementar公司；LECO CS-400碳硫測定儀：美國力可公司。

1.2 方法

1.2.1 林蛙卵黑色素的提取

參照朱方等[15]的方法，略作修改。具體步驟為：取鮮林蛙卵，去筋膜，清洗干凈，凍干，用萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，取林蛙卵粉100 g，加入300 mL蒸餾水，0.3%的木瓜蛋白酶，（58±1）℃酶解 2 h，離心 30 min（轉(zhuǎn)速為9 500 r/min），沉淀用蒸餾水洗滌3次，加入丙酮進(jìn)行脫脂，脫脂后的樣品用蒸餾水洗滌3次，脫脂工藝重復(fù)一次，離心30 min（轉(zhuǎn)速為9 500 r/min），得到粗品林蛙卵黑色素。

1.2.2 林蛙卵黑色素的分離

林蛙卵中蛋白的含量為16.8%[16]，而且林蛙卵黑色素與林蛙卵中的部分蛋白質(zhì)結(jié)合緊密，因此脫除蛋白質(zhì)是純化林蛙卵黑色素的關(guān)鍵。稱取20 g粗品林蛙卵黑色素，加入0.1 mol/L NaOH溶液，400 mL，40℃條件下水浴加熱1.5 h，離心30 min（轉(zhuǎn)速為9 500r/min）。沉淀透析24 h去除鹽離子，分別用石油醚、乙醇和蒸餾水洗滌3次，冷凍干燥，即得到林蛙卵黑色素。

1.3 林蛙卵黑色素的理化性質(zhì)

1.3.1 林蛙卵黑色素溶解性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取10 mg林蛙卵黑色素，分別加入10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液、蒸餾水、丙酮、己腈、石油醚、乙醚、無水乙醇、乙醇、乙酸、甲酸、甲醇、己烷、氯仿等溶液中，利用漩渦振蕩器充分混合均勻，觀察林蛙卵黑色的溶解情況，再將試管置于100℃水浴中加熱20 min，觀察其溶解情況。

1.3.2 紫外可見光譜掃描

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的林蛙卵黑色素，用0.1 mol/L NaOH溶解，配制成濃度為0.1、0.2、0.4 mg/mL的林蛙卵黑色素溶液。在100℃水浴的條件下加熱至完全溶解。于200 nm～800 nm波長下掃描。

1.3.3 林蛙卵黑色素元素組成

根據(jù)Tu等[12]的方法，根據(jù)GB/T 19143-2017《巖石有機(jī)質(zhì)中碳、氫、氧元素分析方法》，采用元素分析儀（elementar vario，EL）測定林蛙卵黑色素中的 C、H、O、N含量；根據(jù)GB/T 19145-2003《沉積巖中總有機(jī)碳的測定》，采用碳硫測定儀（LECO CS-400）測定林蛙卵黑色素中的S含量。

1.3.4 林蛙卵黑色素傅里葉紅外光譜掃描

采用溴化鉀壓片法，按質(zhì)量比1∶200加入林蛙卵黑色素和溴化鉀，研成細(xì)粉進(jìn)行壓片。在500 cm-1～4 000 cm-1范圍內(nèi)測定其FT-IR吸收光譜。

1.4 林蛙卵黑色素的抗氧化活性

1.4.1 DPPH自由基清除能力

參照Chen等[17]的方法，略作修改，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的林蛙卵黑色素，配制成濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL 和 4.0 mg/mL 的樣品溶液，分別取1 mL 樣品溶液、2mL 2×10-4mol/L 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）溶液和2 mL 95%乙醇溶液加入到試管中，搖勻，在25℃下反應(yīng)30 min，在517 nm處測定其吸光度（Ai），將1 mL樣品溶液和4 mL 95%乙醇溶液混合均勻并測定其吸光度（Aj），將2 mL DPPH溶液和3 mL 95%乙醇溶液混合均勻，測定其吸光度并記錄（Ac），BHT做陽性對照。按照下面公式計(jì)算DPPH清除率。

1.4.2 超氧陰離子清除能力

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的林蛙卵黑色素，分別配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL 和 4.0 mg/mL 的樣品溶液。按照Martinez等[18]的方法，分別取0.5 mL樣品溶液、7.5 mL 磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.8，50 mmol/L）、1 mL 390 mmol/L 甲硫氨酸、1 mL 30 μmol/L 核黃素、1 mL 1.5 μmol/L EDTA和 0.5 mL 2.25 mmol/L氮藍(lán)四唑加入到試管中并混合均勻，將混合溶液在室溫下光照10 min后，立刻避光于560 nm處測定其吸光度（A1），以不光照做為對照組（A2），BHT為陽性對照組，按照下面公式計(jì)算超氧陰離子清除率。

1.4.3 羥自由基清除能力

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的林蛙卵黑色素，分別配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL 和 4.0 mg/mL 的樣品溶液。羥自由基清除能力采用北京鼎國生物技術(shù)有限公司的試劑盒，進(jìn)行測定。BHT為陽性對照組，按照下面公式計(jì)算羥自由基清除率，其中A1為空白對照組吸光值，A2為樣品吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 林蛙卵黑色素溶解性試驗(yàn)結(jié)果

林蛙卵黑色素在不同溶劑中的溶解性見表1。

表1 林蛙卵黑色素在不同溶劑中的溶解性Table1 Solubility of melanin from ovum of Rana chensinensis

由表1可知，林蛙卵黑色素在乙醇、乙酸、甲酸、甲醇、己烷、氯仿等有機(jī)溶劑和無機(jī)溶劑中是不溶的。林蛙卵黑色素在25℃，0.1 mol/L NaOH溶液中不溶，100℃水浴加熱20 min后，開始溶解，這與報(bào)道的紅茶葉黑色素[12]和烏骨雞黑色素[14]的溶解性一致。

2.2 林蛙卵黑色素的紫外可見光譜掃描結(jié)果

不同濃度的林蛙卵黑色素的紫外可見光譜（200 nm～800 nm）見圖1。

圖1 林蛙卵黑色素紫外光譜圖Fig.1 UV-VIS spectra of the melanin from ovum of Rana chensinensis

3種濃度的林蛙卵黑色素在掃描范圍內(nèi)（200 nm～800 nm）出現(xiàn)了一致的吸收變化規(guī)律，林蛙卵黑色素在紫外區(qū)域都有強(qiáng)烈的吸收，并且伴隨波長的逐漸增加，吸光度呈現(xiàn)下降的趨勢，這是黑色素最明顯的特征之一，這種現(xiàn)象是由于黑色素的高度共軛所致。林蛙卵黑色素在280 nm處有一肩峰。這個特征與Cheng等[19]、Wang等[20]和Selvakumar等[21]的結(jié)果十分相似。而在280 nm處一般是蛋白質(zhì)的特征吸收峰。因此，推測這個肩峰可能是與林蛙卵黑色素緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)的特征吸收峰。

2.3 林蛙卵黑色素元素組成結(jié)果

Ito S等[22]提出的合成真黑色素和棕黑色素的S∶N分別為0.01和0.46，林蛙卵黑色素各組分的元素組成見表2。

表2 林蛙卵黑色素各組分的元素組成Table2 Elemental composition analytical data of melanin from ovum of Rana chensinensis

由表2可知，林蛙卵黑色素的S∶N為0.05，這表明林蛙卵黑色素主要含有真黑色素。林蛙卵黑色素的C∶N為10.04，明顯高于合成真黑色素和棕黑色素的C∶N，這說明林蛙卵黑色素含有脂肪族，同時(shí)林蛙卵黑色素的O∶N為3.70，也略高于合成真黑色素和棕黑色素，這說明林蛙卵黑色素含有更多的羧基集團(tuán)。

2.4 林蛙卵黑色素的傅里葉紅外光譜掃描結(jié)果

林蛙卵黑色素的紅外色譜見圖2。

圖2 林蛙卵黑色素的傅里葉紅外光譜圖Fig.2 UV-VIS spectra of melanin from ovum of Rana chensinensis

由圖2可知，在3 361.9 cm-1處有一個寬峰，這是由OH和NH2基團(tuán)伸縮振動引起的；1 643.4 cm-1處吸收峰為芳香族C=C或C=N的彎曲振動及C=O的不對稱伸縮振動形成的，說明可能存在-COOH；1 446.6 cm-1處吸收峰為氨基酸中脂肪族C=C彎曲振動形成；1 373.3 cm-1處吸收峰為氨基酸中的C-N伸縮振動。603.7 cm-1處吸收峰是由苯環(huán)形成的。根據(jù)以上所分析的特征峰，可初步將林蛙卵黑色素歸為真黑色素，另外，林蛙卵黑色素中仍然含有一定的氨基酸。

2.5 DPPH自由基清除能力結(jié)果

研究采用林蛙卵黑色素對DPPH自由基清除50%，即IC50進(jìn)行對樣品抗氧化活性評價(jià)見圖3。

圖3 林蛙卵黑色素和BHT清除DPPH自由基能力Fig.3 DPPH radical-scavenging of melanin from ovum of Rana chensinensis and BHT

由圖3可知，林蛙卵黑色素和BHT對DPPH自由基的清除率隨著濃度的升高而逐漸增大，其中，林蛙卵黑色素的IC50為0.404 mg/mL，陽性對照組BHT的IC50為0.445 mg/mL，這表明林蛙卵黑色素對DPPH自由基的清除能力略高于陽性對照組BHT的清除能力，林蛙卵黑色素具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

2.6 超氧陰離子清除能力結(jié)果

林蛙卵黑色素和BHT清除超氧陰離子能力見圖4。

圖4 林蛙卵黑色素和BHT清除超氧陰離子能力Fig.4 Superoxide-radical scavenging of melanin from ovum of Rana chensinensis and BHT

由圖4可知，在測試濃度范圍內(nèi)（0.1 mg/mL～4.0 mg/mL），林蛙卵黑色素和BHT對超氧陰離子的清除率隨著濃度的提高而逐漸增大，其中，林蛙卵黑色素對超氧陰離子的半數(shù)清除率，即林蛙卵的IC50為1.250 mg/mL，陽性對照組BHT的IC50為0.646 mg/mL，這表明林蛙卵黑色素具有一定的超氧陰離子清除能力，但低于陽性對照BHT的超氧陰離子清除能力。

2.7 羥自由基清除能力結(jié)果

林蛙卵黑色素和BHT清除羥自由基能力見圖5。

圖5 林蛙卵黑色素和BHT清除羥自由基能力Fig.5 Hydroxyl radical of melanin from ovum of Rana chensinensis and BHT

由圖5可知，林蛙卵黑色素和BHT在測試測試濃度范圍內(nèi)（0.1 mg/mL～4.0 mg/mL）對羥自由基的清除率隨著濃度的增大而增大，其中林蛙卵黑色素的IC50為0.662 mg/mL，陽性對照組BHT的IC50為1.574 mg/mL，這表明林蛙卵黑色素對羥自由基的清除能力高于陽性對照組BHT的清除能力，林蛙卵黑色素具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。

3 結(jié)論

對林蛙卵黑色素進(jìn)行紫外-可見光譜掃描、傅里葉紅外光譜掃描、元素分析、溶解性試驗(yàn)以及體外抗氧化測定，結(jié)果顯示，林蛙卵黑色素在可見光區(qū)無特征吸收峰而且較為平坦，在280 nm處有一肩峰，推測這個肩峰可能是與林蛙卵黑色素緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)的特征吸收峰；林蛙卵黑色素含有羥基、氨基、C=O、C=C、CH 及芳香基團(tuán)，這與 Cheng 等[19]、Wang 等[20]和Selvakumar等[21]的結(jié)果十分相似；元素分析表明林蛙卵黑色素主要含有真黑色素；林蛙卵黑色素對DPPH自由基的IC50為0.404 mol/mL，對超氧陰離子的IC50為1.250 mg/mL，對羥自由基的IC50為0.662mg/mL。