徐夢(mèng)嬌 高姍姍 肖堯

【摘 要】對(duì)于病原微生物的檢測(cè)技術(shù)主要有常規(guī)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)以及基因檢測(cè)等，但由于各種檢測(cè)方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)、檢測(cè)范圍以及使用領(lǐng)域，因此，為適應(yīng)現(xiàn)代社會(huì)對(duì)檢測(cè)病原微生物的要求，必須加強(qiáng)對(duì)病原微生物檢測(cè)技術(shù)的研究、創(chuàng)新，在實(shí)際工作中，依據(jù)檢測(cè)設(shè)備技術(shù)條件，綜合考量各自檢測(cè)方法，以選取檢測(cè)效果較好的方法。文章主要對(duì)各種病原微生物檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行分析。

【關(guān)鍵詞】病原微生物；檢測(cè)技術(shù)；研究進(jìn)展

病原微生物主要指對(duì)人和動(dòng)物存在致病性的各類微生物，包括細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、螺旋體、朊粒、立克次體、支原體、衣原體等。病原微生物會(huì)影響食品以及水源的安全，人和動(dòng)物感染病原微生物以后，會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)或者癡呆、腫瘤等多種疾病。隨著現(xiàn)代檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，病原微生物檢測(cè)技術(shù)也得到了發(fā)展，從常規(guī)檢測(cè)發(fā)展到免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、基因檢測(cè)技術(shù)等，并廣泛用于醫(yī)療、疾控、食品安全檢驗(yàn)等方面。

一、病原微生物常規(guī)檢測(cè)方法

（一）涂片鏡檢法

在染色和形態(tài)上具有明顯特征的病原微生物適合使用涂片鏡檢法進(jìn)行檢測(cè)。例如，白喉棒狀桿菌、葡萄球菌或結(jié)核分枝桿菌等引起感染性疾病的病原微生物，經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理，將標(biāo)本置于顯微鏡下檢測(cè)，分別呈現(xiàn)有異染顆粒的棒狀桿菌、革蘭陽(yáng)性葡萄串狀球菌以及抗酸性細(xì)長(zhǎng)桿菌等；對(duì)于糞便中的霍亂弧菌和志賀菌等，也可通過(guò)涂片鏡檢法，在熒光顯微鏡下進(jìn)行快速檢測(cè)。應(yīng)用涂片鏡檢法進(jìn)行病原微生物檢測(cè)時(shí)，只需要革蘭染色液和普通光學(xué)顯微鏡，是各類微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的常用檢測(cè)方法。

（二）組織細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)法及生物化學(xué)試驗(yàn)

組織細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)法適用于組織細(xì)胞內(nèi)生存的病原體，例如病毒、立克次體以及衣原體等。由于不同的病原體其組織敏感細(xì)胞也有差異，因此，可以從病原體敏感的動(dòng)物組織中，提取活細(xì)胞于體外實(shí)施原代培養(yǎng)，或者實(shí)施傳代培養(yǎng)，并將病原體接種到相應(yīng)的組織細(xì)胞內(nèi)，使病原體在細(xì)胞中進(jìn)行繁殖增長(zhǎng)，從而使特異性的細(xì)胞產(chǎn)生病變反應(yīng)；還可以通過(guò)直接在敏感動(dòng)物體內(nèi)接種病原體，使相應(yīng)的組織器官出現(xiàn)特異性的病理變化，從而根據(jù)出現(xiàn)的特異性病變鑒定病原體。一般情況下，多數(shù)病原體在培養(yǎng)16～20小時(shí)后均可以得到理想的菌落，但也有少量病原菌需要經(jīng)過(guò)數(shù)月的培養(yǎng)，才能形成一定數(shù)量的菌落，但在實(shí)際工作時(shí)，檢測(cè)人員往往需要快速、準(zhǔn)確的知曉病原微生物種類，隨著各種全自動(dòng)微生物及藥敏系統(tǒng)的研發(fā)以及廣泛應(yīng)用，能夠有效緩解這一情況。

二、免疫學(xué)檢測(cè)方法

（一）免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence techⅡique），也就是通常所說(shuō)的熒光抗體技術(shù)，主要內(nèi)容是在該抗原或抗體上加入含有熒光的物質(zhì)，需要保證該熒光物質(zhì)不會(huì)影響機(jī)體的特性，通過(guò)顯微鏡進(jìn)行觀察，找到有熒光標(biāo)記的抗原或抗體，從而實(shí)現(xiàn)監(jiān)督和鑒別的功能。具體方法是：第一，抗體或者抗原從待檢樣本中分離出來(lái)，使抗體或抗原與固相載體發(fā)生反應(yīng)；第二，將抗原或者抗體以洗滌的方式從固相載體中分離出來(lái)，讓固相載體以一定的比例跟待檢樣本混合，并添加一些酶與其發(fā)生反應(yīng)，從而產(chǎn)生易于辨別的有色物質(zhì)，根據(jù)有色物質(zhì)的深淺，就能夠分析和判定待測(cè)樣本中的微生物種類及狀況等。該檢測(cè)方式的優(yōu)點(diǎn)是耗費(fèi)時(shí)間較短、靈敏度較高。

（二）酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法應(yīng)用范圍較廣，是一種固相免疫測(cè)定技術(shù)。該檢測(cè)方法的內(nèi)容是：在固原載體的表面吸附已知抗原或者抗體，保證其原本的免疫活性；在檢測(cè)過(guò)程中，使待檢測(cè)樣本與表面吸附抗體或抗原的固相載體發(fā)生反應(yīng)，然后加入酶標(biāo)抗體，進(jìn)行免疫復(fù)合物結(jié)合操作，采用洗滌方法，將抗原或者抗體復(fù)合物與游離的未結(jié)合成分進(jìn)行分離；最后再加入酶反應(yīng)底物，通過(guò)觀察被酶催化后的底物所產(chǎn)生的顏色以及吸光度值大小，從而測(cè)定病原微生物種類。該檢測(cè)方法具有方便快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于標(biāo)準(zhǔn)化管理的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于多細(xì)菌檢測(cè)工作中。

三、基因檢測(cè)方法

（一）聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是新型的基因檢測(cè)方法。該技術(shù)主要是根據(jù)目的基因，設(shè)計(jì)一對(duì)特異寡核苷酸引物，在反應(yīng)體系中加入4種dNTP和DNA聚合酶，以目的基因作為模板，進(jìn)行DNA體外擴(kuò)增的技術(shù)，由于反應(yīng)可以進(jìn)行多次循環(huán)，因此可以在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增，以獲得大量目的基因。PCR及其衍生的多種方法已廣泛用于病原微生物的檢測(cè)。例如病原性大腸桿菌O157：H7的檢測(cè)，可使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR或者隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）DNA標(biāo)記等方法。張洪軍等利用PCR-DGGE與熒光原位雜交技術(shù)（FISH）技術(shù)，分析了生活污水中的硝化菌群；Yolanda等采用PCR和FISH，快速檢測(cè)出彎曲桿菌。

PCR檢測(cè)方法應(yīng)范圍很廣，但由于DNA檢測(cè)無(wú)法區(qū)分死、活細(xì)胞，從而無(wú)法準(zhǔn)確判斷微生物是否具有感染力。另外，PCR檢測(cè)法反應(yīng)靈敏，任何污染都會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果，任何抑制劑都會(huì)抑制PCR反應(yīng)，因此，其穩(wěn)定性較差，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。

（二）DNA芯片檢測(cè)技術(shù)

DNA芯片，也稱為DNA微陣列，DNA芯片檢測(cè)技術(shù)可在同一時(shí)間對(duì)大量樣品進(jìn)行高通量分析，芯片的類型可分為固定寡核苷酸探針和PCR擴(kuò)展子兩類。其主要內(nèi)容是利用機(jī)械系統(tǒng)，將DNA探針陣列分布于硅基片或玻璃上，從而形成100～200μm的多個(gè)點(diǎn)，保證點(diǎn)間間距為200～500μm，每個(gè)點(diǎn)含單鏈的寡核苷酸片段，與待測(cè)組分進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)熒光或其他標(biāo)記物，進(jìn)而檢測(cè)病原微生物。檢測(cè)流程如圖1所示。

DNA芯片檢測(cè)法使用特異DNA，檢測(cè)速度快，可同時(shí)檢測(cè)多種不同的病原微生物，可避免傳統(tǒng)方法漫長(zhǎng)等待影響檢測(cè)結(jié)果，但DNA芯片法不適用于DNA濃度低時(shí)，PCR將會(huì)增加樣本中DNA濃度，通過(guò)DNA芯片檢測(cè)與PCR擴(kuò)增結(jié)合，可以提高檢測(cè)的靈敏度，更易于檢測(cè)。相對(duì)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，此方法更加快捷，可以對(duì)多種微生物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，極大的加快檢測(cè)速度，盡快得到檢測(cè)結(jié)果。

四、結(jié)束語(yǔ)

隨著我國(guó)社會(huì)的不斷發(fā)展，各種病原微生物造成的問(wèn)題層出不窮，這就對(duì)病原微生物檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求。當(dāng)前的病原微生物檢測(cè)技術(shù)主要有常規(guī)檢測(cè)技術(shù)，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)以及基因檢測(cè)技術(shù)等，在操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)不需要較多樣本，節(jié)省時(shí)間，且不會(huì)出現(xiàn)污染，能夠保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，但不論哪種檢測(cè)方法都有其局限性，因此，在實(shí)際工作中，要根據(jù)病原微生物的特點(diǎn)，結(jié)合使用不同的檢測(cè)方法，從而在病原微生物的檢測(cè)方面發(fā)揮更加重要的作用。

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