14 種側(cè)耳屬食用菌干品揮發(fā)性香味成分分析

殷朝敏，范秀芝，樊 喆，史德芳，高 虹*

側(cè)耳屬（Pleurotus）食用菌在分類學(xué)上隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、傘菌目（Agaricales）、側(cè)耳科（Pleurotaceae），是世界第二大人工栽培的食用菌[1-2]。側(cè)耳屬食用菌不僅富含多糖、三萜、凝集素、甾醇等生物活性成分，而且還擁有特殊的風(fēng)味，深受消費(fèi)者的青睞[3-4]。

研究表明，食用菌的風(fēng)味主要由非揮發(fā)性的滋味物質(zhì)和揮發(fā)性的香味物質(zhì)組成，其中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是食用菌香味的主要組分[5]。食用菌揮發(fā)性組分包括八碳化合物及其衍生物、萜烯類、含硫化合物以及醛類、酮類、酯類和酸類化合物等，其中八碳化合物和含硫化合物是核心成分，而醛、酮、酯酸類等與它們互補(bǔ)調(diào)和，因而呈現(xiàn)出食用菌的特殊香味[6-7]。目前研究者已通過水蒸氣蒸餾、超臨界CO2萃取、固相微萃取等方法對(duì)香菇（Lentinus edodes）[8-10]、金針菇（Flammulina velutipes）[5,11]、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）[12-13]、羊肚菌（Morchella elata）[14]等食用菌的揮發(fā)性香味成分進(jìn)行了研究，但是不同食用菌香味成分各不相同，有關(guān)側(cè)耳屬食用菌的揮發(fā)性香味成分研究相對(duì)較少。

本實(shí)驗(yàn)采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）方法對(duì)榆黃蘑（Pleurotus citrinopileatus）、紅平菇（P. djamor）、秀珍菇（P. geesteranus）、糙皮側(cè)耳（P. ostreatus）等14 種側(cè)耳屬食用菌的揮發(fā)性香味成分進(jìn)行了分析，并通過相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）和共有成分分析研究不同組分對(duì)整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)，以期為側(cè)耳屬食用菌的加工及品質(zhì)調(diào)控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株培養(yǎng)與樣品收集

側(cè)耳屬菌種包括榆黃蘑PY1、紅平菇PH1、秀珍菇PX1、佛羅里達(dá)側(cè)耳PF6（P. florida）、糙皮側(cè)耳P739、糙皮側(cè)耳P49、糙皮側(cè)耳P03、美味側(cè)耳P380（P. cornucopiae）、糙皮側(cè)耳P51、糙皮側(cè)耳P803、糙皮側(cè)耳P650、糙皮側(cè)耳P615、糙皮側(cè)耳PH2、糙皮側(cè)耳P712均購自于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種中心。將活化的側(cè)耳屬菌種接種到滅好菌的棉籽殼袋料中（棉籽殼96%，麩皮3%，石膏0.5%，石灰0.5%），25 ℃靜置培養(yǎng)30 d，待白色菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)菌袋后，移至出菇房進(jìn)行出菇管理[15-16]。收集子實(shí)體樣品（直徑約10 cm），置于50 ℃烘箱中低溫干燥24 h至含水率為8%～10%，粉碎后過80 目篩，室溫保存。

1.2 儀器與設(shè)備

手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）萃取頭 美國(guó)Supeclo公司；7890A-5975C型GC-MS儀 美國(guó)Agilent公司；DF101S集熱恒溫磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取

分別稱取3.0 g干粉樣品于40 mL采樣瓶中，加入20.0 mL蒸餾水和3.0 g NaCl，混勻后用聚四氟乙烯隔墊密封后置于60 ℃磁力攪拌器中平衡10 min后，再用萃取頭頂空吸附40 min，完成后將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口，解吸5 min后進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS分析條件

GC條件[14,17]：色譜柱為Agilent HP-5ms非極性毛細(xì)管柱（60 m×250 μm，0.25 μm）；程序升溫，初始溫度40 ℃，保持2 min；以3 ℃/min的速率升至180 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升至260 ℃，保持1 min；載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV，電壓350 V，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～450；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃。

1.3.3 化合物的鑒定

利用NIST11譜庫的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對(duì)得到的譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行串聯(lián)檢索和人工解析，選擇匹配度大于80%作為物質(zhì)鑒定依據(jù)。比對(duì)有關(guān)質(zhì)譜資料，對(duì)基峰、m/z和相對(duì)豐度等方面進(jìn)行分析，結(jié)合保留時(shí)間和MS對(duì)樣品中各揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析。釆用峰面積歸一化法定量，得到各組分的相對(duì)含量（組分峰面積占總峰面積的百分比）。

1.3.4 主體揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的評(píng)定

采用ROAV評(píng)價(jià)各揮發(fā)性成分對(duì)樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)[18-19]。定義對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分ROAV為100，則其他揮發(fā)性成分的ROAV小于100，按下式計(jì)算各揮發(fā)性成分的ROAV：

式中：Cri、Ti分別為揮發(fā)性成分的相對(duì)含量/%和氣味閾值/（μg/kg）；Crstan、Tstan分別為對(duì)樣品整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的相對(duì)含量/%和氣味閾值/（μg/kg）。ROAV≥1，說明該物質(zhì)為樣品的主體風(fēng)味成分，且在一定范圍內(nèi)，ROAV越大說明該物質(zhì)對(duì)總體風(fēng)味貢獻(xiàn)越大；0.1≤ROAV＜1，說明該物質(zhì)對(duì)整體風(fēng)味有修飾作用[20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同側(cè)耳屬食用菌揮發(fā)性香味成分分析結(jié)果

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，對(duì)14 種側(cè)耳屬食用菌中的揮發(fā)性香味物質(zhì)進(jìn)行富集，經(jīng)GC-MS鑒定分析后，得到樣品揮發(fā)性成分的總離子流圖，如圖1所示。經(jīng)化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理及面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)含量，按各峰的質(zhì)譜圖經(jīng)NIST.11譜庫進(jìn)行檢索，在得到的揮發(fā)性物質(zhì)中，存在一些硅氧烷類雜峰[21]，它們并不是側(cè)耳屬食用菌中所存在的揮發(fā)性物質(zhì)。剔除這些物質(zhì)后，14 種側(cè)耳屬食用菌干品中揮發(fā)性化合物匹配度大于80%的共41 種，其組成及相對(duì)含量如表1所示。

圖1 榆黃蘑PY1干品揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of volatiles extracted from P. citrinopileatus PY1 by GC-MS

由表1可知，鑒定出的41 種揮發(fā)性化合物占頂空揮發(fā)物總量的61.81%～96.44%，包括11 種醛類、11 種醇類、5 種酮類、2 種酯類、2 種羧酸類、2 種呋喃類、3 種烯烴類、2 種含氮化合物、1 種含硫化合物和2 種苯類化合物，其中相對(duì)含量較高的成分有1-辛烯-3-醇（32.98%～90.58%）、三辛酸甘油酯（1.25%～20.56%）、正己醛（0.03%～13.51%）、3-辛酮（0.34%～6.51%）和苯甲醛（0.26%～6.45%）等。在41 種揮發(fā)性化合物中有8 種化合物僅在個(gè)別樣品中被檢測(cè)到，占總峰面積的2.54%；此外，正己醛、2-丁基-2-辛烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、正辛醇、2-辛烯-1-醇、3-辛酮和1-辛烯-3-酮8 種揮發(fā)性香味成分是14 種側(cè)耳屬食用菌所共有的揮發(fā)性成分，但在不同菌中的相對(duì)含量有所差異，這些物質(zhì)可能是側(cè)耳屬食用菌干品的關(guān)鍵性香味物質(zhì)。

表1 14 種側(cè)耳屬食用菌干品揮發(fā)性香味組分及相對(duì)含量Table 1 Volatile compounds and their relative contents identified in 14 Pleurotus species

2.2 不同側(cè)耳屬食用菌干品揮發(fā)性香味成分種類分析

不同食用菌干品揮發(fā)性化合物的種類和相對(duì)含量也有較大差異，其中醇類化合物在14 種側(cè)耳屬食用菌中相對(duì)含量遠(yuǎn)高于其他類化合物，如圖2所示。結(jié)合表1和圖2可知，在樣品PY1中共檢出20 種揮發(fā)性香味成分，1-辛烯-3-酮在PY1中相對(duì)含量較高（2.84%），且其閾值極低（0.005 μg/kg）[22]，對(duì)PY1干品香味成分影響極大。另外，PY1中檢出2 種特有揮發(fā)性組分2-乙基己醇（0.14%）和4-羥基丁酸（0.45%），而前者閾值極高（270 000 μg/kg）[22]，因此它對(duì)PY1干品香味成分影響并不大。PH1樣品中共檢出16 種揮發(fā)性成分，其中醇類物質(zhì)含量較高（83.76%）。此外，2-辛烯醛在PH1中含量（2.15%）是所有樣品中最高的，2-辛烯醛具有尖刺的脂肪、肉香、青香、黃瓜味道，且其閾值也較低（3 μg/kg）[22]，可能對(duì)PH1干品香味影響較大。PX1和PF6中分別檢出18 種和20 種化合物，但二者醛類物質(zhì)含量均較高，分別為13.14%和22.58%，鑒于醛類物質(zhì)閾值較低，賦予香味能力強(qiáng)，可能對(duì)PX1和PF6干品香味有較大影響。此外，PF6中酯類物質(zhì)和呋喃類物質(zhì)含量也很豐富，分別達(dá)到14.21%和3.15%。P739、P49和P03樣品中分別檢出21、15 種和22 種揮發(fā)性成分，其中P739樣品中醇類物質(zhì)含量較高（88.47%）；P49中鑒定出的化合物只占揮發(fā)性物質(zhì)總量的61.81%，尚有38.19%的化合物尚未被鑒定；而P03中醛類（8.73%）、酮類（7.77%）和酯類（20.85%）相對(duì)含量較高。P03中檢出1 種特有揮發(fā)性組分異戊醛（0.24%），且苯甲醛（6.45%）、3-辛酮（6.51%）和三辛酸甘油酯（20.56%）的相對(duì)含量是所有樣品中最高的。P380樣品中檢出16 種揮發(fā)性成分，其中醇類物質(zhì)高達(dá)86.61%，而醛類物質(zhì)只有3 種，相對(duì)含量為1.72%，與其他樣品相比偏低。P51樣品中檢出12 種揮發(fā)性成分，未檢出呋喃類、烯烴類、含氮化合物、含硫化合物和苯類化合物，是所有樣品中檢出揮發(fā)性成分種類最少的；12 種揮發(fā)性成分中醇類物質(zhì)高達(dá)92.32%，而醛類物質(zhì)只有3 種，相對(duì)含量也較低。P803、P650和P615樣品中分別檢出15、18 種和24 種揮發(fā)性成分，P803和P650中2-辛烯-1-醇含量較豐富，相對(duì)含量分別為3.16%和2.57%；P615中2-辛烯醛（2.08%）、3-辛醇（2.50%）、正辛醇（2.87%）、2-辛烯-1-醇（3.06%）、3-辛酮（3.10%）和1-辛烯-3-酮（4.25%）相對(duì)含量都較高，其中3-辛醇、正辛醇和1-辛烯-3-酮相對(duì)含量是所有樣品中最高的。2 個(gè)高溫種PH2和P712中分別檢出21 種和12 種揮發(fā)性成分，其中PH2中2-辛烯-1-醇相對(duì)含量為5.06%，是所有樣品中最高的；P712中醛類物質(zhì)相對(duì)含量較高（9.21%），但是未檢出酯類、呋喃類、烯烴類、含氮化合物、含硫化合物和苯類化合物。

圖2 14 種側(cè)耳屬食用菌揮發(fā)性香味物質(zhì)種類及相對(duì)含量Fig. 2 Classes and contents of volatile compounds identified in 14 Pleurotus species

2.3 14 種側(cè)耳屬食用菌主體揮發(fā)性香味成分分析

雖然食用菌干品中含有多種揮發(fā)性香味成分，但是只有一小部分對(duì)食用菌的整體風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，還有一些成分對(duì)整體風(fēng)味進(jìn)行修飾[13]。通常情況下，揮發(fā)性化合物對(duì)食用菌香氣的貢獻(xiàn)由其含量、氣味閾值共同決定，—些含量低但氣味閾值也很低的化合物也可能對(duì)食用菌的整體風(fēng)味起重要作用[19]。

14 種側(cè)耳屬食用菌干品揮發(fā)性香氣成分的ROAV見表2。PY1樣品中主體揮發(fā)性香味成分（ROAV≥1）有2 種，分別是1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇；起修飾作用的香味成分（0.1≤ROAV＜1）也有2 種，分別是壬醛和2-壬烯醛。1-辛烯-3-酮具有強(qiáng)烈的壤香、蘑菇香，而1-辛烯-3-醇具有蘑菇香、青香、蔬菜香及油膩的氣息[22]；壬醛具有蠟香、甜桔香、脂肪香和花香；而2-壬烯醛具有脂肪氣息、青香、蠟香、黃瓜香和甜瓜香[22]，這些化合物共同形成了榆黃蘑PY1特殊的香味。PH1樣品中主體揮發(fā)性香味成分（ROAV≥1）也是1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇，但發(fā)揮著修飾作用（0.1≤ROAV＜1）的物質(zhì)有3 種，分別是2-壬烯醛、2-辛烯醛和正辛醛。2-辛烯醛具有尖刺的脂肪、肉香、青香、黃瓜味道；正辛醛具有似甜橙、油脂、蜂蜜香氣[22]，這些化合物對(duì)紅平菇PH1獨(dú)特的香氣有重要修飾作用。PX1、P739、P49、P03和P380樣品中主體揮發(fā)性香味成分（ROAV≥1）均為1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇；PX1中發(fā)揮著修飾作用（0.1≤ROAV＜1）的物質(zhì)是正辛醛和壬醛，而P739和P380中發(fā)揮著修飾作用（0.1≤ROAV＜1）的物質(zhì)均只有1 種，分別是正辛醛和正己醛，后者具有強(qiáng)烈的青香、草香、蔬菜和水果香氣[22]；P49中起修飾作用（0.1≤ROAV＜1）的揮發(fā)性物質(zhì)有3 種，ROAV從大到小分別為正辛醛、壬醛和正己醛；P03樣品中起修飾作用（0.1≤ROAV＜1）的揮發(fā)性物質(zhì)也有3 種，分別為異戊醛、正己醛和3-辛酮；其中3-辛酮具有酮香、青香、蠟香、蔬菜香等[22]。PF6中主體揮發(fā)性香味成分（ROAV≥1）有3 種，分別為1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇和正辛醛；另外，正己醛和2-戊基呋喃是佛羅里達(dá)側(cè)耳PF6香味的重要輔助成分（0.1≤ROAV＜1），其中2-戊基呋喃具有果香、奶酪、酸性乳制品的香氣。P51樣品中主體揮發(fā)性香味成分是1-辛烯-3-醇（ROAV=100）和1-辛烯-3-酮（ROAV=99.36），沒有發(fā)現(xiàn)修飾成分。P803、P650、P615、PH2和P712中主體揮發(fā)性香味成分（ROAV≥1）均為1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇；P803中修飾成分（0.1≤ROAV＜1）有正辛醛、正己醛、壬醛和2-辛烯醛；P650中重要修飾成分（0.1≤ROAV＜1）也有4 種，分別是2-辛烯醛、正己醛、壬醛和苯乙醛，后者具有青香、玫瑰、花香、巧克力香氣[22]；P712中起重要修飾作用的物質(zhì)有2 種，分別是正己醛和2-辛烯醛。另外，有部分揮發(fā)性化合物因?yàn)闊o法查詢到相應(yīng)的感覺閾值而未作具體分析。

表2 14 種側(cè)耳屬食用菌干品中主體揮發(fā)性物質(zhì)及對(duì)應(yīng)ROAVTable 2 ROAV of key flavor compounds in 14 Pleurotus species

2.4 14 種側(cè)耳屬食用菌共有成分分析

表3 主成分分析的特征值Table 3 Eigenvalues of principal component analysis

表4 主成分分析的特征向量Table 4 Eigenvectors of principal component analysis

14 種側(cè)耳屬食用菌中共檢出8 種共有的揮發(fā)性成分，以8 種共有的香氣成分相對(duì)含量構(gòu)成的14×8的矩陣，利用SPSS 21.0進(jìn)行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，結(jié)果如表3和表4所示。第1主成分方差貢獻(xiàn)率為41.456%，其中1-己醇、正己醛和2-丁基-2-辛烯醛貢獻(xiàn)最大，對(duì)應(yīng)的特征向量分別為0.875、0.859和0.806；1-己醇具有青香、果香、醇香和甜香[22]，正己醛具有強(qiáng)烈的青香、草香、蔬菜和水果香氣[22]，而2-丁基-2-辛烯醛具有肉香味[23]，故第1主成分主要反映側(cè)耳屬食用菌中的青香、果香及肉香；第2主成分方差貢獻(xiàn)率為23.015%，正辛醇和2-辛烯-1-醇貢獻(xiàn)最大，對(duì)應(yīng)的特征向量分別為0.882和0.849，正辛醇和2-辛烯-1-醇具有強(qiáng)烈的油脂氣味，并帶有柑橘、玫瑰氣味，因此第2主成分主要反映側(cè)耳屬食用菌中的油脂味；第3主成分方差貢獻(xiàn)率為19.156%，1-辛烯-3-酮和3-辛酮的貢獻(xiàn)率最大，對(duì)應(yīng)的特征向量為0.816和0.784；1-辛烯-3-酮具有強(qiáng)烈的壤香、蘑菇香；而3-辛酮具有酮香、青香、蠟香、蔬菜香，故第3主成分主要反映側(cè)耳屬食用菌中的蘑菇香和酮香；3 個(gè)主成分方差累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到83.627%，可基本反映總體情況。

3 討 論

研究表明，栽培袋料和生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)食用菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有重要影響[24-25]，本實(shí)驗(yàn)中以棉籽殼為基料并統(tǒng)一栽培環(huán)境，消除了外界環(huán)境對(duì)側(cè)耳屬食用菌揮發(fā)性香味成分的影響，但是不同樣品中揮發(fā)性化合物的種類和相對(duì)含量仍然有差異較大。另外，同屬于糙皮側(cè)耳的P739、P49、P03、P51、P803、P650、P615、PH2和P712樣品的揮發(fā)性化合物也存在較大差異，如P03中檢測(cè)到22 種揮發(fā)性物質(zhì)，而P51和P712中只檢測(cè)到12 種揮發(fā)性物質(zhì)，這表明種以及菌株個(gè)體差異對(duì)食用菌揮發(fā)性香味成分有較大影響。

八碳化合物（C8H16O）是食用菌最重要的風(fēng)味物質(zhì)，是亞油酸及亞麻酸在脂肪氧化酶催化下轉(zhuǎn)變而成的物質(zhì)，主要包括1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、3-辛醇、3-辛酮和正辛醇等[26-27]。其中1-辛烯-3-醇具有濃烈的蘑菇味道，普遍存在于大部分食用菌中[7]，是食用菌的特征性香味成分。在本研究的14 種側(cè)耳屬食用菌樣品中均檢測(cè)到1-辛烯-3-醇的存在，且相對(duì)含量較高，為32.98%～90.58%。1-辛烯-3-酮具有強(qiáng)烈的壤香、蘑菇香；3-辛酮具有酮香、青香、蠟香、蔬菜香，且二者閾值較低，是食用菌關(guān)鍵性香味物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)14 個(gè)樣品中均含有這2 種香味成分。

在進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量分析時(shí)發(fā)現(xiàn)醇類化合物在14 種側(cè)耳屬食用菌中相對(duì)含量遠(yuǎn)高于其他類化合物。張瑩[28]研究幾種食用菌香味物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)糙皮側(cè)耳中醛類物質(zhì)含量最高；Tsai等[29]研究白靈菇（Pleurotus ferulae）、糙皮側(cè)耳香味物質(zhì)時(shí)均檢測(cè)到高含量的酮類化合物；而李秦等[30]發(fā)現(xiàn)黑平6號(hào)中酸類物質(zhì)含量最高。這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果有一定差異，可能是因?yàn)檠芯坎捎玫妮腿》椒ú煌嘘P(guān)；另外，揮發(fā)性物質(zhì)的含量可能還與食用菌的種類、生長(zhǎng)環(huán)境和成熟度等因素有關(guān)[20]。

揮發(fā)性香味成分是食用菌品質(zhì)的重要指標(biāo)，通過研究分析食用菌揮發(fā)性香味物質(zhì)的組成和含量有助于深入了解其風(fēng)味特征，對(duì)品種的改良、定向培育及食用菌的加工應(yīng)用具有指導(dǎo)作用和實(shí)踐意義[7]。本實(shí)驗(yàn)采用HSSPME方法提取了14 種側(cè)耳屬食用菌干品中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，經(jīng)GC-MS初步鑒定出41 種揮發(fā)性香氣成分，其中榆黃蘑PY1干品20 種，紅平菇PH1中16 種，秀珍菇PX1中18 種，佛羅里達(dá)側(cè)耳PF6中20 種，美味側(cè)耳P380中16 種，9 個(gè)糙皮側(cè)耳干品中最高的24 種（P615），最低的12 種（P51和P712）。不同食用菌干品揮發(fā)性成分的種類和含量差異很大，除PF6中主體揮發(fā)性香氣成分（ROAV≥1）有3 種（1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇和正辛醛）之外，余下13 種食用菌中主體揮發(fā)性香氣成分（ROAV≥1）均為1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇。此外，側(cè)耳屬食用菌中還存在一些重要的修飾性香氣成分，如1-己醇、正己醛、2-丁基-2-辛烯醛、正辛醇、2-辛烯-1-醇、1-辛烯-3-酮和3-辛酮等，這些眾多組分相互作用形成了側(cè)耳屬食用菌干品的獨(dú)特香氣。