李衛(wèi)霞 于智慧 白小紅

白芷，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，系傘形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.var.formosana （Boiss.）Shan et Yuan的干燥根[1]。主要產(chǎn)于浙江、河北、河南、四川四大地區(qū)[2]。香豆素類如花椒毒酚（Xanthotol）、補(bǔ)骨脂素（Psoralen）、佛手柑內(nèi)酯（Bergaptene）、歐前胡素（Imperatorin）、異歐前胡素（Isoimperatorin）等，和揮發(fā)油類是其主要的活性成分，前者有鎮(zhèn)痛的作用，后者具有活血化瘀的作用[3]。白芷具有抗炎[4-5]、誘導(dǎo)血管新生和抗腫瘤等活性[6-7]。目前提取白芷中香豆素成分的方法主要有回流溶劑提取[8]、微波法提取[9]和CO2超臨界萃取[10]，這些方法存在操作時(shí)間長(zhǎng)、富集效果差、設(shè)備復(fù)雜、溶劑消耗多。

液相微萃取技術(shù)（LPME）是Jeannot和Cantwell在20世紀(jì)90年代提出的一種新型預(yù)處理技術(shù)[11]。集萃取、純化、富集于一體，具有成本低、操作簡(jiǎn)單快速、溶劑消耗少、富集倍數(shù)多等特點(diǎn)。其中，漂浮有機(jī)液滴凝固液相微萃?。⊿FOD-LPME）檢測(cè)限低、富集倍數(shù)高。適合于痕量、低豐度微量[12]天然化合物的分析。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

LC-10A高校液相色譜儀（日本島津，LC-10A液泵，AT-330恒溫箱、SPD-10A紫外檢測(cè)器），色譜柱hypersil ODS2 C18（5μm，250 mm×4.6 mm），85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（江蘇榮華），8 mm×4 mm磁力攪拌子（博士德科技有限公司），TGL-16M高速冷凍離心機(jī)，電子天平。

1.2 對(duì)照品和試劑

花椒毒酚（批號(hào)：MUST-17031205，純度≥98%），補(bǔ)骨脂素（批號(hào)：MUST-17012215，純度≥99.99%），佛手柑內(nèi)酯（批號(hào)：A100525，純度≥98%），歐前胡素（批號(hào)：A0011，純度≥98%），異歐前胡素（批號(hào)：A0012，純度≥98%）均購(gòu)買自成都曼斯特生物科技有限公司。白芷產(chǎn)地安徽，購(gòu)自太原市北京同仁堂藥店。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，十二醇、鹽酸和氯化鈉購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠，甲醇為分析純，購(gòu)自天津四友化工研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜分離條件

色譜柱Hypersil ODS2 C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相甲醇：水=70∶30，流速1.0 ml/min，柱溫30℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm，進(jìn)樣量為20 μl。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取花椒毒酚、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素各10 mg，分別置于10 ml容量瓶中，甲醇定容，制成濃度均為1 mg/ml的儲(chǔ)備液，至4℃的冰箱中保存。

再精密量取上述儲(chǔ)備液，分別配置濃度為50μg/ml的對(duì)照品溶液，于4℃的冰箱中保存。

2.2.2 樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取每批次白芷藥粉各3 g，加30 ml甲醇浸泡2 h，超聲提取1 h，加甲醇至30 ml。放于4℃的冰箱中保存，備用。

2.3 操作方法

在10 ml玻璃容器內(nèi)加入2.2.1項(xiàng)下50 μg/ml對(duì)照品溶液各50μl，加水至5 ml，加入適量十二醇，以600 r/min的速度萃取30 min后，靜置，至于冰箱中冷凍，待十二醇凝固后，收集十二醇于EP管，在室溫下放置成液體后加甲醇，混勻，取20 μl進(jìn)行HPLC測(cè)定。

2.4 條件優(yōu)化

2.4.1 十二醇用量的選擇 比較不同體積萃取劑對(duì)萃取的影響，取20、30、40、50、60 μl十二醇分別加入玻璃瓶中，結(jié)果如圖1，20 μl十二醇的萃取效果最好。

圖1 十二醇用量對(duì)富集倍數(shù)的影響

2.4.2 樣品相溶液pH的選擇 加酸導(dǎo)致佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)發(fā)生水解開環(huán)，故不再考察pH值。

2.4.3 萃取時(shí)間的選擇 考察萃取時(shí)間為10、20、30、40、50和60 min對(duì)萃取效果的影響，結(jié)果如圖2，綜合比較60 min萃取效果最佳。

2.4.4 轉(zhuǎn)速的選擇 考察轉(zhuǎn)速為300、600、900、1 200和1 500 r/min時(shí)對(duì)香豆素類成分的萃取效果的影響，攪拌也可以增加物質(zhì)的擴(kuò)散速度，速度過(guò)快，十二醇發(fā)生乳化，萃取效果下降。結(jié)果如圖3，600 r/min萃取效果最好。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)富集倍數(shù)的影響

圖3 轉(zhuǎn)速對(duì)富集倍數(shù)的影響

2.4.5 樣品相體積的選擇 考察樣品相體積為3、4、5、6和7 ml時(shí)的萃取效果，結(jié)果如圖4，選擇樣品相體積為7 ml。

圖4 樣品相體積對(duì)富集倍數(shù)的影響

2.4.6 鹽濃度對(duì)萃取的影響 本實(shí)驗(yàn)考察鹽濃度分別為3%、6%、9%、12%、15%和18%（w/v） 時(shí)對(duì)萃取的影響，結(jié)果如圖5，15%時(shí)萃取效果最佳。

3 方法學(xué)考察

3.1 工作曲線和檢測(cè)限

制成濃度為 0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2 μg/ml的對(duì)照品溶液，依上述實(shí)驗(yàn)操作，經(jīng)HPLC測(cè)定后，繪制色譜峰面積y與分析物濃度c之間的線性關(guān)系。結(jié)果分別為花椒毒酚y=1 161 509c+4 208，R2=0.999 3；補(bǔ)骨脂素y=2 355 213.5c+ 4 649.9，R2=0.998 9；佛手柑內(nèi)酯y=4 046 730.3c+25 127.5，R2=0.999 1；歐前胡素y=7 431 042.7c+49 857.6，R2=0.999 6；異歐前胡素y=8 129 237c+12 671.9，R2=0.999 5。線性范圍均為0.005～2 μg/ml。檢測(cè)限（Limit of detection，LOD）定義為信噪比（S/N）為3，檢測(cè)限分別為0.5、0.01、0.01、0.01、0.1ng/ml。富集倍數(shù)的計(jì)算公式EF（Enrichment factor）=cs1/cs2，cs1和cs2分別為萃取后有機(jī)溶劑中化合物的濃度和萃取前樣品相溶液中的濃度，富集倍數(shù)分別為 52、113、189、248、250 倍。

3.2 精密度

精密量取對(duì)照品，制成0.01、0.1、1 μg/ml三種濃度的溶液，按照上述最佳操作條件，平行六組實(shí)驗(yàn)，計(jì)算日間精密度，連續(xù)測(cè)定3日，計(jì)算日內(nèi)精密度。測(cè)得日內(nèi)精密度RSD為0.73%～1.53%，日間精密度RSD為0.95%～1.69%。

圖5 鹽濃度對(duì)富集倍數(shù)的影響

3.3 加樣回收率

按照1.1.4制備加樣回收率供試品溶液，取70 μl白芷溶液于10 ml容器中，加入濃度為0.5 μg/ml的7 ml對(duì)照品溶液，并如上述優(yōu)化條件萃取，測(cè)定每種組分的平均回收率。測(cè)得花椒毒酚、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、花椒毒酚、歐前胡素和異歐前胡素的平均回收率和RSD分別為102.1%（1.27%）、101.8%（1.32%）、100.8%（0.89%）、100.5%（1.07%）、98.9%（0.92%）。

3.4 含量測(cè)定

取1.1.4項(xiàng)下制備的白芷供試品溶液，依上述方法操作，測(cè)定香豆素類成分含量，見圖6。測(cè)得白芷粉末中花椒毒酚、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素和異歐前胡素的平均含量分別為0.044 mg/g、0.385 mg/g、0.145 mg/g、1.12 mg/g、0.47 mg/g。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素和異歐前胡素的富集倍數(shù)分別為189、248和250，明顯高于花椒毒酚和補(bǔ)骨脂素的52倍和113倍，SFOD-LPME結(jié)合HPLC可以成功的用于白芷中這5種成分的前處理。

圖6 白芷中香豆素類活性成分色譜圖

漂浮有機(jī)液滴凝固液相微萃取具有操作簡(jiǎn)單、富集倍數(shù)高、成本低、檢測(cè)限低等特點(diǎn)，可用于中藥中微量天然化合物有效成分的分析。