方宗華,何 勇,高永好,于艷英,吳宗好

(合肥華方醫(yī)藥科技有限公司，安徽 合肥 230088)

本品是第二代磺酰脲類抗糖尿病藥。主要作用為刺激胰島β細胞分 泌胰島素，適用于在充分進行飲食控制的基礎上，治療2型糖尿病患者的高血糖及其相關癥狀。格列吡嗪有關物質(zhì)HPLC檢查方法收載于中國藥典2015年版，相關文獻也有報道[1-6]，但都不適用于格列吡嗪控釋片有關物質(zhì)的檢測，本文參照國內(nèi)外藥典，并經(jīng)方法優(yōu)化，建立專屬性強、靈敏度高且通過前處理有效去除高分子輔料PEO干擾的格列吡嗪控釋片有關物質(zhì)測定HPLC法并對其進行方法學驗證。

1 儀器與試藥

日本島津高效液相色譜儀(20AD,紫外檢測器)；日本GL Sciences lnc WondaSil ?C18色譜柱(150×4.6mm，5μm)；日本紫外可見分光光度計(UV-1700)；METTLER TOLEDO分析天平(AG135)；METTLER TOLEDO實驗室pH計(AG135)；格列吡嗪控釋片( 實驗室自制)； 格列吡嗪對照品和雜質(zhì)Ⅰ對照品(中國藥品生物制品檢定所) ；乙腈( 色譜純) ；水為純化水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18；流動相：水(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.7)為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫(0min，73%A；12min，73%；14min，63%；50min，63%；51min，73%；60min，73%)；檢測波長為225nm。

2.2 專屬性試驗

2.2.1 酸破壞試驗

供試品酸降解溶液的制備：取本品1片，用刀片切成4份，置50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置過夜，超聲振搖使溶解，加5mol/L鹽酸溶液5mL，振搖，室溫下放置4h，加5mol/L氫氧化鈉溶液5mL中和，用水稀釋至刻度，搖勻，離心(必要時濾過)，取上清液(續(xù)濾液)，即得。

2.2.2 堿破壞試驗

供試品堿降解溶液的制備：取本品1片，用刀片切成4份，精密稱定(205.46mg)，置50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置過夜，超聲振搖使溶解，放冷，加5mol/L氫氧化鈉溶液5mL，振搖，室溫下放置4h，加5mol/L鹽酸溶液5mL中和，用水稀釋至刻度，搖勻，離心(必要時濾過)，取上清液(續(xù)濾液)，即得。

2.2.3 氧化破壞試驗

供試品氧化破壞溶液的制備：取本品1片，用刀片切成4份，精密稱定(203.75mg)，置50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置過夜，超聲振搖使溶解，加30%雙氧水溶液5mL，室溫下放置2d，用水稀釋至刻度，搖勻，離心(必要時濾過)，取上清液(續(xù)濾液)，即得。

2.2.4 高溫破壞試驗

供試品熱降解溶液的制備：取本品1片，用刀片切成4份，精密稱定(212.14mg)，置50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置過夜，超聲振搖使溶解，置80℃水浴下3h，放冷至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻，離心(必要時濾過)，取上清液(續(xù)濾液)，即得。

2.2.5 光照破壞試驗

供試品光降解溶液的制備：取本品1片，用刀片切成4份，精密稱定(213.87mg)，置50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置過夜，超聲振搖使溶解，置強光下(4500lx±500lx)照射2天，用水稀釋至刻度，搖勻，離心(必要時濾過)，取上清液(續(xù)濾液)，即得。

2.2.6 測定法

分別取上述溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.2.7 試驗結果

本品在氧化條件下穩(wěn)定，未產(chǎn)生新的雜質(zhì)，原有的雜質(zhì)含量也未見增大；在強酸條件下不穩(wěn)定，雖未產(chǎn)生新的雜質(zhì)，但原有雜質(zhì)Ⅰ(雜質(zhì)Ⅰ)和雜質(zhì)G含量均增大；在高溫、強光、強堿條件下不穩(wěn)定，均能產(chǎn)生新的雜質(zhì)及原有雜質(zhì)含量增大；但我們所選色譜條件均能將主峰與雜峰以及雜峰與雜峰較好的分離，且空白溶劑和空白輔料不干擾檢測。因此采用本法作為本品的有關物質(zhì)檢查，方法專屬，可行。各色譜圖見圖1～圖5。

圖1 高溫破壞色譜圖

圖2 光照破壞色譜圖

圖3 堿破壞色譜圖

圖4 酸破壞色譜圖

圖5 氧化破壞色譜圖

2.3 雜質(zhì)Ⅰ精密度試驗

精密稱取雜質(zhì)Ⅰ對照品10.48mg，置100mL量瓶中，加甲醇75mL使溶解并用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL，置100mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL中含1.048μg的溶液，精密量取上述對照品溶液20μL，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，以峰面積計算相對標準偏差RSD(%)。結果見表1。

表1 雜質(zhì)Ⅰ精密度試驗結果(n=6)

結果表明，本法精密度良好。RSD(%)=0.44%<2.0%。

2.4 雜質(zhì)Ⅰ線性關系與線性范圍

精密量取上述同一雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL、25μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以進樣量(ng) 對峰面積(A)進行線性回歸，得回歸方程。結果見表2。

表2 雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液線性回歸方程結果

結果表明，格列吡嗪雜質(zhì)Ⅰ的進樣量在2.096ng～26.200ng之間，線性關系良好。

2.5 檢測限與定量限試驗

2.5.1 格列吡嗪檢測限

精密稱取格列吡嗪對照品10.78mg，置250mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL，置100mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL，置10mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按信噪比(S/N)=3∶1計算，本品最小檢出量為0.2405 ng。表明本法測定格列吡嗪控釋片中的有關物質(zhì)靈敏度高，能滿足有關物質(zhì)的檢測需要。

2.5.2 雜質(zhì)Ⅰ檢測限

精密稱取雜質(zhì)Ⅰ對照品10.66mg，置100mL量瓶中，加甲醇50mL，超聲使溶解，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL，置100mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL，置25mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取該溶液2μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按信噪比(S/N)=3∶1計算，本品最小檢出量為0.1228ng。表明本法測定格列吡嗪控釋片中的雜質(zhì)Ⅰ靈敏度高，能滿足雜質(zhì)Ⅰ的檢測需要。

2.5.3 雜質(zhì)Ⅰ定量限

精密量取雜質(zhì)Ⅰ最低檢出限項下的對照品溶液4μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按信噪比(S/N)=10∶1計算，本品最小定量限為0.3198ng。表明本法測定格列吡嗪控釋片中的雜質(zhì)靈敏度高，能滿足雜質(zhì)Ⅰ的限量檢測需要。

2.6 雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液穩(wěn)定性試驗

精密量取上述同一雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液在0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h后，分別進樣20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積計算RSD(%)，考察雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液在室溫放置48h的穩(wěn)定性。結果見表3。

表3 雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液穩(wěn)定性試驗結果

結果表明，雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液在室溫放置48h，峰面積無明顯變化，RSD(%)=0.47%<2.0%。說明本品在室溫放置48h穩(wěn)定。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗

取本品1片，用刀片切成4份，全量轉移至50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置過夜后充分振搖，超聲使溶解，放冷至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻，離心(必要時濾過)，即得，并在0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h后，分別進樣20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖?？疾鞓悠啡芤涸谑覝胤胖?8h的穩(wěn)定性。結果見表4。

表4 有關物質(zhì)供試品溶液穩(wěn)定性試驗結果

結果表明，本品在室溫放置48h，主成分峰面積無明顯變化，RSD(%)=0.72%<2.0%；雜質(zhì)Ⅰ峰面積無明顯變化，RSD(%)=0.72%；總雜峰面積無明顯變化，RSD(%)=1.83%<2.0%；且未出現(xiàn)新的雜質(zhì)。說明本品在室溫放置48h穩(wěn)定。

2.8 雜質(zhì)Ⅰ中間精密度試驗

取同一批格列吡嗪控釋片，分別由不同的人配樣，在不同的儀器上進樣，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算雜質(zhì)Ⅰ含量，以含量(%)計算RSD(%)，結果見表5。

表5 雜質(zhì)Ⅰ中間精密度試驗結果

由上述試驗結果可知：同一供試品(170301)，由不同的人，不同儀器，依法測定雜質(zhì)Ⅰ含量，最低含量為0.0727%，最高含量為0.0733%，平均含量為0.0730%， RSD(%)=0.32%，表明用該法測定格列吡嗪控釋片雜質(zhì)Ⅰ含量，中間精密度良好。

2.9 雜質(zhì)Ⅰ重復性試驗

取同一批號(170301)格列吡嗪控釋片1片，用刀片切成4份，全量轉移至50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置過夜后充分振搖，超聲使溶解，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，離心(必要時濾過)，作為供試品溶液，同法制備6份；分別量取上述雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液和供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算雜質(zhì)Ⅰ含量，以含量(μg/片)計算RSD(%)，結果見表6。

由上述試驗結果可知：同一批供試品(170301)重復測定6次，雜質(zhì)Ⅰ平均含量為4.1693(μg/片)，RSD(%)=1.20%，表明用該法測定格列吡嗪控釋片雜質(zhì)Ⅰ含量重復性良好。

2.10 雜質(zhì)Ⅰ準確度試驗

采用加樣回收法測定，取格列吡嗪控釋片1片，用刀片切成4份，全量轉移至50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置過夜后充分振搖，超聲使溶解，放冷至室溫，共9份，分別精密加入雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液(10μg/mL)4mL(三份)，5mL(三份)，6mL(三份)，用水稀釋至刻度，搖勻，離心(必要時濾過)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另精密稱取雜質(zhì)Ⅰ對照品適量，加甲醇超聲使溶解并用水定量稀釋制成每1mL中約含1.0μg的溶液，作為對照品溶液，同法測定，按外標法以峰面積計算回收率。結果見表7。

表7 雜質(zhì)Ⅰ準確度試驗結果

結果表明，雜質(zhì)Ⅰ平均回收率為98.79%，RSD(%)=0.82%<2.0%。說明本方法測定格列吡嗪控釋片中的雜質(zhì)Ⅰ準確度高，結果令人滿意。

2.11 耐用性試驗

取格列吡嗪控釋片1片，用刀片切成4份，全量轉移至50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置過夜后充分振搖，超聲使溶解，放冷至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻，離心(必要時濾過)，作為供試品溶液；在下表中各變動因素條件下，精密量取供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果見表8。

表8 有關物質(zhì)耐用性試驗結果表(面積歸一化法)

結論：由耐用性試驗結果可見，在測定條件有小的變動時，主峰與雜質(zhì)峰之間仍能分離良好；檢查雜質(zhì)個數(shù)相同；平均總雜為0.173%，RSD(%)=1.88%<2.0%，雜質(zhì)總量變化較小，表明本方法耐用性良好。

2.12 三批樣品的有關物質(zhì)的測定

取本品1片，用刀片切成4份，全量轉移至50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置過夜，超聲振搖使溶解，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，離心(必要時濾過)，取上清液(續(xù)濾液)作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1mL，置100mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液；另取4-[2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基]苯磺酰胺(雜質(zhì)Ⅰ)對照品10mg，置100mL量瓶中，加甲醇50mL超聲使溶解，放冷，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)Ⅰ對照品貯備液，精密量取1mL，置100mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液；再取格列吡嗪對照品10mg，置100mL量瓶中，加甲醇50mL超聲使溶解，放冷，精密加入雜質(zhì)Ⅰ對照品貯備液1mL，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液。照高效液相色譜法(中國藥典2015年版四部通則0512)測定，用C18色譜柱；以水(用磷酸調(diào)節(jié)pH值值至3.7)為流動相A，乙腈為流動相B，進行線性梯度洗脫；檢測波長為225nm。取系統(tǒng)適用性試驗溶液20μL注入液相色譜儀，理論塔板數(shù)按格列吡嗪峰計算不低于20000，格列吡嗪峰與雜質(zhì)Ⅰ峰的分離度應大于30。精密量取供試品溶液、對照溶液與對照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品溶液色譜圖中如有與雜質(zhì)Ⅰ(4-[2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基]苯磺酰胺)保留時間一致的色譜峰，按外標法以峰面積計算，不得過格列吡嗪標示量(格列吡嗪標示量按5.5mg計)的1.0%；其他單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.5倍(0.5%)；雜質(zhì)總量不得過2.0%。

取自制樣品三批(規(guī)格：5mg ，批號：170301、170302、170303)依照上述方法檢查有關物質(zhì)，結果見表9。

表9 三批中試樣品有關物質(zhì)檢查結果

2.13 小結

經(jīng)過不同色譜條件的篩選，確定選定色譜條件可有效分離主峰與雜質(zhì)，通過分析方法的驗證進一步說明了該分析方法準確可靠。適合格列吡嗪控釋片有關物質(zhì)測定。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

取格列吡嗪對照品溶液和雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液，照紫外-可見分光光度法，以50%甲醇為空白溶液，在200～400nm波長范圍內(nèi)掃描，記錄紫外吸收圖譜。

結果顯示格列吡嗪對照品溶液在227.5nm的波長處有最大吸收；格列吡嗪雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液在224.5nm的波長處有最大吸收。參考相關文獻。選用225nm作為格列吡嗪控釋片有關物質(zhì)檢查的測定波長。

3.2 色譜柱的選擇

參考相關文獻，其均為色譜柱C18。本文所用的色譜柱為日本GL Sciences公司生產(chǎn)的(150mm×4.6mm，5μm)WondaSil?C18柱色譜柱。