蘇格木勒-4抗失眠藥效學(xué)研究

果佳霖 孫利東 孟根花 白東浩 那木希來 查干夫 馬麗杰 靳尚武

通訊作者：馬麗杰 靳尚武

蘇格木勒-3味湯是蒙醫(yī)傳統(tǒng)藥方, 出自蒙醫(yī)經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》,《 蒙醫(yī)百科全書》、《蒙藥方劑學(xué)》(統(tǒng)編教材)均有記載［1］。本研究使用的蘇格木勒-4是根據(jù)蒙醫(yī)查干夫教授改良傳統(tǒng)配方后的配方, 即在原方白豆蔻15 g、白苣勝10 g、蓽菝5 g的基礎(chǔ)上, 添加炒酸棗仁15 g。方中酸棗仁味甘,性平；白豆蔻味苦、辛, 性溫, 為鎮(zhèn)赫依主藥；白苣勝味甘,性平, 為鎮(zhèn)赫依輔助藥；加配調(diào)理體素藥蓽菝, 四藥合用,相互協(xié)調(diào), 主治失眠, 為安神的良藥［2,3］。蘇格木勒-4雖然在臨床實踐中取得了顯著的抗失眠藥效, 但其作用機制還需進一步研究予以闡明。本文通過蘇格木勒-4味湯對小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用影響的實驗研究, 為蘇格木勒-4味湯的進一步探索提供參考依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 ICR小鼠120只, 雄性, 體質(zhì)量18～22 g, 由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供, 動物合格證號:SCXK(京 )2016-0002。

1.2 儀器 小動物活動記錄儀, 型號：YLS-1C, 濟南益延科技發(fā)展有限公司；電子天平, 型號：AL204-IC, 梅特勒-托利多；真空干燥箱, 型號：DZF-2B, 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀, 型號：R-215, Buchi；臺式高速冷凍離心機, 型號TGL-20M；小動物體重秤。

1.3 藥材 白豆蔻為姜科植物白豆蔻Amomum kravanh Pierre ex Gagnep和爪哇白豆蔻Amomum compactum Soland.ex Maton的果實, 批號：20160801；白苣勝為菊科植物萵苣Lactuca sativa L.的種子, 批號：20160401；蓽茇為胡椒科(Piperaceae)胡椒屬(Piper) 植物蓽茇(Piper longum L.)的干燥近成熟或成熟的果穗, 批號：20170101；酸棗仁是鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa (Bunge) Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子, 批號：20161201。藥材均購自安徽和濟堂中藥飲片有限公司。

1.4 藥物制備 由白豆蔻15 g、白苣勝10 g、蓽菝5 g、炒酸棗仁15 g組成, 稱取以上4味藥材共10付, 共計450 g, 加10倍水, 浸泡1 h后煎煮, 煮沸后30 min濾過, 藥渣加5倍量水煎煮, 煮沸后20 min濾過, 合并濾液, 采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、減壓干燥器濃縮至浸膏狀, 得浸膏58 g。使用時用蒸餾水稀釋成相應(yīng)生藥濃度。

1.5 小鼠自主活動測定 ICR雄性小鼠120只, 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后, 實驗前, 篩選合格小鼠。篩選方法：將120只小鼠分別置于小鼠自發(fā)活動儀中, 8只/次, 使之適應(yīng)環(huán)境5 min后,記錄5 min內(nèi)的活動次數(shù), 選取活動數(shù)相當(dāng)?shù)男∈?00只用于實驗。實驗在光照節(jié)律12L∶12D(9:00～21:00), 安靜、通風(fēng)、室溫22℃左右的屏障環(huán)境下進行。將篩選后的100只小鼠按體重分為正常對照組、安神補腦液對照組及蘇格木勒-4高劑量組、蘇格木勒-4中劑量組、蘇格木勒-4低劑量組, 各20只。將小鼠依次放入小鼠自發(fā)活動儀中, 使其適應(yīng)環(huán)境5 min后, 記錄5 min的自主活動數(shù)。之后, 各組小鼠以0.2 ml/10 g體積灌胃給藥。安神補腦液對照組按照0.13 ml/10 g濃度灌胃給藥, 蘇格木勒-4高劑量組、蘇格木勒-4中劑量組、蘇格木勒-4低劑量組分別以52 mg/10 g、26 mg/10 g、13 mg/10 g(以生藥含量算)濃度灌胃給藥。灌胃前禁食不禁水12 h, 灌胃1 次/d, 連續(xù)灌胃7 d, 末次灌胃給藥60 min后, 以同樣方法記錄小鼠的自主活動次數(shù)。

1.6 戊巴比妥鈉催眠作用

1.6.1 實驗方法 各組小鼠灌胃給藥1 次/d, 連續(xù)7 d, 并于末次給藥后1 h, 腹腔注射閾劑量戊巴比妥鈉溶液(預(yù)實驗確定為39 mg/kg) 。

1.6.2 判斷指標 ①翻正反射消失：小鼠仰臥1 min內(nèi)未翻轉(zhuǎn), 說明已進入翻正反射消失階段；②翻正反射恢復(fù)：小鼠能夠由仰臥位自動翻轉(zhuǎn)過來并且在1 min 內(nèi)不再翻轉(zhuǎn)過去,說明翻正反射恢復(fù)；③潛伏期：從注射開始到翻正反射消失所用的時間；④睡眠時間：從翻正反射消失到翻正反射恢復(fù)所用的時間。

1.7 戊巴比妥鈉閾下催眠量作用的實驗

1.7.1 實驗方法 各組小鼠灌胃給藥1 次/d, 連續(xù)7 d, 并于末次給藥后1 h, 腹腔注射閾劑量戊巴比妥鈉溶液(預(yù)實驗確定為28 mg/kg) 。

1.7.2 判斷指標 小鼠注射戊巴比妥鈉后15 min內(nèi)翻正反射消失, 且翻正反射消失持續(xù)時間達1 min以上者為陽性,記錄小鼠入睡潛伏期及翻正反射消失持續(xù)時間。

1.8 觀察指標 比較五組小鼠自主活動次數(shù)、睡眠潛伏期時間及睡眠時間、入睡率情況, 并比較其中正常對照組、蘇格木勒-4高劑量組、蘇格木勒-4中劑量組、蘇格木勒-4低劑量組的生化指標。第7天灌胃結(jié)束后1 h對小鼠進行麻醉后摘除眼球取血。血液置于1.5 ml EP管中于高速離心機中離心, 取上清液進行生化指標檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示, 采用t檢驗；多組間比較采用單向方差分析(One-Way ANOVA)處理實驗結(jié)果, 首先進行Levene方差齊性檢驗, 方差齊性且整體比較組間有顯著性差異時采用LSD法進行多重比較, 方差分析不顯著時不進行多重比較。方差不齊, 采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗。計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組小鼠自主活動次數(shù)比較 采用方差分析, 方差齊,整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.442, P=0.012＜0.05), 進一步進行多重比較。每組16只。蘇格木勒-4高劑量組、蘇格木勒-4中劑量組、蘇格木勒-4低劑量組小鼠自主活動次數(shù)與正常對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 安神補腦液對照組與正常對照組小鼠自主活動次數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表 1。

表1 五組小鼠自主活動次數(shù)比較( ±s, 次)

表1 五組小鼠自主活動次數(shù)比較( ±s, 次)

注：與正常對照組比較, aP<0.05

組別 只數(shù) 自主活動數(shù)蘇格木勒-4高劑量組 16 183.19±66.91a蘇格木勒-4中劑量組 16 196.19±46.94a蘇格木勒-4低劑量組 16 208.13±48.82a安神補腦液對照組 16 248.63±56.18正常對照組 16 246.06±24.13

2.2 五組小鼠睡眠潛伏期時間比較 睡眠潛伏期采用方差分析, 方差齊, 整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.879,P=0.032＜0.05)。每組11只, 其中蘇格木勒-4中劑量組有1只未入睡。蘇格木勒-4高劑量組與安神補腦液對照組睡眠潛伏期時間明顯短于正常對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 蘇格木勒-4中劑量組與蘇格木勒-4低劑量組睡眠潛伏期時間比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 五組小鼠睡眠潛伏期時間比較( ±s, min)

表2 五組小鼠睡眠潛伏期時間比較( ±s, min)

注：與正常對照組比較, aP<0.05

只數(shù) 睡眠潛伏期時間組別蘇格木勒-4高劑量組 11 8.55±2.98a蘇格木勒-4中劑量組 10 9.30±1.43蘇格木勒-4低劑量組 11 10.27±1.42安神補腦液對照組 11 7.45±0.58a正常對照組 11 12.55±1.23

2.3 五組小鼠睡眠時間比較 睡眠時間因不符合正態(tài)分布, 故用非參數(shù)檢驗, 整體比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02＜0.05)。每組16只, 正常對照組10只小鼠；其中蘇格木勒-4高劑量組有1只未入睡, 2只死亡；安神補腦液對照組及蘇格木勒-4低劑量組各有1只未入睡1只死亡。安神補腦液對照組及蘇格木勒-4高劑量組、蘇格木勒-4中劑量組、蘇格木勒-4低劑量組睡眠時間均長于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 五組小鼠睡眠時間比較( ±s, min)

表3 五組小鼠睡眠時間比較( ±s, min)

注：與正常對照組比較, aP<0.05

組別 只數(shù) 睡眠時間蘇格木勒-4高劑量組 13 100.62±30.41a蘇格木勒-4中劑量組 16 71.69±4.88a蘇格木勒-4低劑量組 14 69.93±9.32a安神補腦液對照組 14 67.07±6.38a正常對照組 10 41.10±4.06

2.4 五組小鼠入睡率比較 每組20只, 其中安神補腦液對照組有3只未入睡。安神補腦液對照組及蘇格木勒-4高劑量組、蘇格木勒-4中劑量組、蘇格木勒-4低劑量組入睡率均優(yōu)于正常對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 蘇格木勒-4高劑量組入睡率高于蘇格木勒-4中劑量組、蘇格木勒-4低劑量組、安神補腦液對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表 4。

表4 五組小鼠入睡率比較(只, %)

2.5 生化指標檢測結(jié)果 每組10只。蘇格木勒-4高劑量組、蘇格木勒-4中劑量組、蘇格木勒-4低劑量組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、AST/ALT、血糖(GLU)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、血尿酸(UA-G)、血肌酐(CRE-G)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IDBIL)指標與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)?？偰懝檀?CHOL)指標比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 蘇格木勒-4低劑量組與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 蘇格木勒-4低劑量組與蘇格木勒-4中劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 其余均無意義。甘油三酯(TG)指標比較總體結(jié)果有意義, 但其方差分析不顯著, 不進行多重比較。見表5。

表 5 四組小鼠生化檢驗比較( ±s)

表 5 四組小鼠生化檢驗比較( ±s)

指標 蘇格木勒-4高劑量組(n=10) 蘇格木勒-4中劑量組(n=10) 蘇格木勒-4低劑量組(n=10) 正常對照組(n=10)ALT(U/L) 46.14±13.78 43.70±8.49 51.43±11.67 38.83±5.23 AST(U/L) 224.50±68.59 204.60±39.68 231.40±70.31 165.50±25.39 AST/ALT 5.04±1.45 4.75±0.82 4.64±1.49 4.38±1.12 GLU(mmol/L) 5.89±1.45 6.24±1.60 5.89±1.59 6.50±1.54 CHOL(mmol/L) 2.41±0.55 2.01±0.46 2.68±0.52 2.19±0.27 TG(mmol/L) 0.83±0.25 1.00±0.26 1.27±0.49 0.99±0.36 GGT(U/L) -1.64±1.87 -1.00±2.79 -1.71±1.64 -1.00±2.97 UA-G(μmol/L) 109.88±47.52 108.51±18.62 110.21±38.56 92.72±27.70 CRE-G(μmol/L) 21.46±67.98 25.57±30.93 13.73±39.51 34.78±16.09 TBIL(μmol/L) 0.43±4.51 0.09±3.68 -0.55±5.26 2.73±2.10 DBIL(μmol/L) 0.43±1.36 0.76±0.20 0.34±1.28 0.92±0.37 IDBIL(μmol/L) 0.00±3.46 -0.67±3.63 -0.89±4.51 1.65±1.86

3 討論

薩礎(chǔ)拉等［3］通過工藝提取白豆蔻-白苣勝揮發(fā)油發(fā)現(xiàn)其可減少小鼠動時間及小鼠前肢上抬次數(shù), 縮短戊巴比妥所致小鼠入睡的潛伏時間, 延長睡眠持續(xù)時間。酸棗仁被認為是中藥中最常用的鎮(zhèn)靜安眠藥。在臨床的大量應(yīng)用中, 通過高質(zhì)量的隨機對照試驗(RTCs)評估含酸棗仁組分的中藥方劑如酸棗仁湯等的療效及安全性, 分析表明療效明確, 且總體安全性較高?；诖罅克幚韺W(xué)實驗表明, 酸棗仁各化學(xué)組分均有安神寧心, 鎮(zhèn)靜催眠的作用, 且可能主要通過γ-氨基丁酸(GABA)能和5-羥色胺能系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)靜和催眠作用,項目組還在進行進一步實驗確定［4-11］。綜上本實驗采用的蘇格木勒-4味湯在原有君藥白豆蔻臣藥白苣勝和輔藥蓽菝的基礎(chǔ)上, 再重用酸棗仁, 取得了良好的臨床效果。安神補腦液對照組為本實驗的陽性對照方, 是臨床應(yīng)用中比較常用且療效顯著地復(fù)方中藥制劑。目前國內(nèi)外對安神補腦液從其有效成分的測定到鎮(zhèn)靜安神作用再到不同工藝其作用的影響及毒理作用都有研究［12-17］。

本實驗中鎮(zhèn)靜作用的代表指標為小鼠自主活動次數(shù), 動物的自主活動情況反映其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能狀態(tài), 興奮時活動次數(shù)增加, 抑制時活動次數(shù)減少, 所以小鼠自主活動實驗是評價中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮狀態(tài)的一項重要指標［18］。催眠作用的代表指標為注射戊巴比妥鈉后小鼠的睡眠潛伏期時間及睡眠時間。結(jié)果表明:①蘇格木勒-4高劑量組、蘇格木勒-4中劑量組、蘇格木勒-4低劑量組小鼠自主活動次數(shù)與正常對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 表現(xiàn)出較明顯的鎮(zhèn)靜作用。而安神補腦液對照組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。②蘇格木勒-4高劑量組與安神補腦液對照組睡眠潛伏期時間明顯短于正常對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 蘇格木勒-4中劑量組與蘇格木勒-4低劑量組睡眠潛伏期時間比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。提示蘇格木勒-4對小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用與其劑量相關(guān), 劑量越大,對小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用越強。③蘇格木勒-4各劑量組和安神補腦液對照組均能延長閾上劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠的時間, 增強戊巴比妥鈉的催眠作用。④與正常對照組相比, 蘇格木勒-4各劑量組與安神補腦液對照組均能提高小鼠入睡率, 蘇格木勒-4高劑量效果依次高于中劑量、低劑量和安神補腦液對照組。提示蘇格木勒-4對小鼠促眠作用與其劑量相關(guān), 劑量越大, 對小鼠促眠作用越強。⑤小鼠生化檢測顯示, 實驗組小鼠與正常小鼠比較肝腎功能未發(fā)現(xiàn)明顯差異。

本實驗結(jié)果顯示, 蘇格木勒-4有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用,高劑量效果尤為明顯。本實驗?zāi)壳拔磁c原方進行比較, 沒有實驗基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持本方療效優(yōu)于原方。未來本課題組將進行這一部分試驗, 也將篩選有效部位群進行更深一步的藥效及機制研究。

此外, 在注射戊巴比妥鈉實驗過程中, 因為存在個體差異,所以當(dāng)給藥結(jié)束后注射預(yù)實驗測得閾下閾上劑量時, 仍部分組別的小鼠出現(xiàn)翻正消失或者死亡現(xiàn)象。這類情況在此前實驗中也有報道［19］, 所以在以后進行此類研究時, 每組參與實驗的小鼠只數(shù)要多出幾只, 保證樣本量避免產(chǎn)生實驗誤差。

總之, 蘇格木勒-4味湯對小鼠有一定程度的鎮(zhèn)靜催眠作用。