潘瑞 杜業(yè)亮 牟偉男

[摘要] 目的 探討蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）并發(fā)腦心綜合征（CCS）大鼠腎素-血管緊張素的變化。 方法 枕大池注入自體動(dòng)脈血法復(fù)制SAH模型，健康雄性Wistar大鼠75只，6周齡，體重150～200 g，所有大鼠均與動(dòng)力實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)連接（Power Lab系統(tǒng)）檢測(cè)心電圖，排除異常心電圖者。將動(dòng)物隨機(jī)分為手術(shù)組（50只）、假手術(shù)組（25只）。手術(shù)組根據(jù)術(shù)后心電圖不同分為SAH組、CCS組，每組各25只（不足者同條件新鼠補(bǔ)入），各組大鼠按取材時(shí)段不同隨機(jī)分為1、3、5、7、14 d等5個(gè)亞組，每組5只。造模后用Power Lab系統(tǒng)檢測(cè)心電圖，分別于1、3、5、7、14 d再次檢測(cè)心電圖，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血漿中腎素活性（PRA）及血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的含量。 結(jié)果 造模成功后，假手術(shù)組心電圖未見(jiàn)明顯變化，手術(shù)組術(shù)后2 h CCS病發(fā)率最高。1 d時(shí)SAH組、CCS組PRA、AngⅡ含量均高于假手術(shù)組（P < 0.05），且CCS組高于SAH組（P < 0.05）；SAH組和CCS組PRA、AngⅡ在3 d時(shí)達(dá)到高峰，顯著高于假手術(shù)組（P < 0.05），而CCS組高于SAH組（P < 0.05）；5、7 d時(shí)SAH組、CCS組PRA、AngⅡ含量逐漸下降，仍高于假手術(shù)組（P < 0.05）。假手術(shù)組PRA、AngⅡ含量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降至7 d后趨于穩(wěn)定；SAH組及CCS組PRA、AngⅡ含量3 d達(dá)高峰，后逐漸下降至14 d基本趨于假手術(shù)組水平（P > 0.05）。 結(jié)論 SAH并發(fā)CCS的PRA、AngⅡ呈逐漸上升達(dá)高峰后逐漸下降趨于穩(wěn)定的變化，提示PRA、AngⅡ在SAH并發(fā)CCS的發(fā)生與發(fā)展中起到了一定的作用。

[關(guān)鍵詞] 腦心綜合征；蛛網(wǎng)膜下腔出血；腎素活性；血管緊張素Ⅱ

[中圖分類號(hào)] R743.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）08（c）-0018-04

[Abstract] Objective To investigate the changes of renin-angiotensin in rats with subarachnoid hemorrhage （SAH） complicated by cerebral-cardiac syndrome （CCS）. Methods The occipital large pool was injected with autologous arterial blood to replicate the SAH model. Seventy-five healthy male Wistar rats were 6 weeks old and weighed 150-200 g. All rats were connected to a dynamic laboratory system （Power Lab system） to detect ECG， excluding abnormal ECG. The rats were randomly divided into surgery group （50 rats） and sham group （25 rats）. The surgical group was divided into SAH group and CCS group according to different electrocardiograms after surgery. Each group had 25 animals （insufficient ones were recruited in the same condition as new rat）. Different time periods were randomly divided into five subgroups： 1， 3， 5， 7， 14 d group， with 5 rats in each group. Electrocardiograms were measured with the Power Lab system after modeling， and electrocardiograms were again detected on day 1， 3， 5， 7 and 14. The levels of plasma renin activity （PRA） and angiotensin Ⅱ （AngⅡ） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results After successful modeling， there was no significant change in electrocardiogram in the sham-operated group. The incidence of cerebral-cardiac syndrome was highest in the surgical group at 2 hours after surgery. The levels of PRA and AngⅡ in SAH group and CCS group were higher than those in sham-operated group at day 1 （P < 0.05）， and the CCS group was higher than the SAH group （P < 0.05）； PRA and AngⅡ peaked at 3 days in SAH group and CCS group were significantly higher than that in sham operation group （P < 0.05）， and CCS group was higher than the SAH group （P < 0.05）. The contents of PRA and AngⅡ in SAH group and CCS group decreased gradually after 5 and 7 days， which was still higher than that in sham operation group （P < 0.05）. The contents of PRA and AngⅡ gradually decreased to 7 days and then stabilized in the sham operation group. The levels of PRA and AngⅡ in the SAH group and the CCS group reached the peak at 3 days， and then gradually decreased to 14 days afterwards， and the levels of PRA and AngⅡ basically reached the level of the sham operation group （P > 0.05）. Conclusion PRA and AngⅡ in SAH complicated with CCS gradually increase and reach a peak， then gradually decrease and tend to be stable. This suggests that PRA and AngⅡ play a certain role in the occurrence and development of SAH concurrent with CCS.

[Key words] Cerebral-cardiac syndrome； Subarachnoid hemorrhage； Plasma renin activity； Angiotensin Ⅱ

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種發(fā)病率高的致死性疾病[1]，是一種較為常見(jiàn)和嚴(yán)重的腦出血性疾病，人群每年的發(fā)病率為6/10萬(wàn)～10/10萬(wàn)，占腦卒中的3%～5%[2]，主要指由多種因素所致腦表面或底部血管破裂，血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，從而并發(fā)的以劇烈頭痛、肢體癱瘓、甚至昏迷為主要臨床表現(xiàn)的一種綜合征[3]。腦心綜合征（cerebral-cardiac syndrome，CCS）又稱為腦源性心臟損害，指各種腦部病變所致的繼發(fā)性心臟損害，主要表現(xiàn)為心電圖復(fù)極改變、心律失常、血漿心肌酶活性升高、心力衰竭等，嚴(yán)重者可發(fā)生猝死[4]。目前，CCS的發(fā)病機(jī)制尚不明確，本研究通過(guò)大鼠枕大池注入自體動(dòng)脈血法建立SAH致CCS模型，檢測(cè)大鼠血漿中腎素活性（PRA）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的動(dòng)態(tài)變化，為進(jìn)一步探討SAH并發(fā)CCS的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠75只，6周齡，體重150～200 g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司供應(yīng)（許可證號(hào)：SCXK[魯]20140007）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 大鼠腦立體定位儀（上海醫(yī)療儀器廠），1 mL注射器。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 大鼠PRA酶聯(lián)免疫分析試劑盒（96T，批號(hào)E-30960）、大鼠AngⅡ酶聯(lián)免疫分析試劑盒（96T，批號(hào)E-31022）（上海一研生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

所有大鼠均與動(dòng)力實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)連接（Power Lab系統(tǒng)）檢測(cè)心電圖，排除異常心電圖者，將其隨機(jī)分為手術(shù)組（50只）、假手術(shù)組（25只）。手術(shù)組根據(jù)術(shù)后心電圖不同分為SAH組、CCS組，每組各25只（不足者同條件新鼠補(bǔ)入），各組大鼠按取材時(shí)段不同隨機(jī)分為1、3、5、7、14 d等5個(gè)亞組，每組5只。

1.3 模型制備

采用自體股動(dòng)脈血枕大池單次注血法復(fù)制SAH模型。手術(shù)組大鼠：常規(guī)消毒手術(shù)器械；按體重0.35 mL/100 g用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉；連接Power Lab系統(tǒng)測(cè)心電圖正常后，備皮、固定、消毒，切開(kāi)皮膚，分離出股動(dòng)脈供放血用。后俯臥于立體定向儀上，備皮、消毒，以寰枕交界部為中心，縱向切開(kāi)暴露枕骨下緣、寰椎和寰枕膜。1 mL注射器針頭刺破寰枕膜中點(diǎn)，連接注射器，進(jìn)入小腦延髓池，回抽見(jiàn)有腦脊液后固定針頭，20 s內(nèi)注入0.2 mL自體股動(dòng)脈血，膠海綿修補(bǔ)，大鼠急性顱內(nèi)壓維持，切口縫合，頭部維持30 min。術(shù)后動(dòng)態(tài)檢測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖6 h，選擇心電圖異常（ST段壓低、T波改變、出現(xiàn)U波、心律失常等）大鼠入CCS組，正常心電圖者入SAH組，假手術(shù)組未分離股動(dòng)脈，注入等量生理鹽水，給予各組大鼠充足食物及水喂養(yǎng)，于48 h后再次重復(fù)注血。于造模結(jié)束后各組取1只大鼠麻醉后灌注處死，獲取腦部標(biāo)本，其中造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為見(jiàn)到枕骨大池、基底池、小腦、大腦、腦干以及大腦表面有血塊存在。每組造模后，1、3、5、7、14 d組檢測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖2 h，取每組血漿待測(cè)。

1.4 樣品采集及處理

將大鼠麻醉固定后，穿刺抽取大鼠右心室血2 mL，于低溫離心機(jī)4℃、3000 r/min、半徑10 cm條件下離心20 min，如出現(xiàn)沉淀再次離心，后放置于-80℃冰箱保存待測(cè)。準(zhǔn)備試劑，加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)30 min，洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)30 min，洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10 min，加入終止液，15 min之內(nèi)讀OD值，計(jì)算出樣品濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均選用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠心電圖比較

造模成功后持續(xù)檢測(cè)心電圖6 h，1、3、5、7、14 d假手術(shù)組心電圖未見(jiàn)明顯變化；手術(shù)組術(shù)后已建立的SAH模型中2 h出現(xiàn)心電圖異常發(fā)病率最高，CCS組25只心電圖異常大鼠（其中心律失常12只、ST-T段壓低7只、T波改變4只、出現(xiàn)U波2只）。

2.2 三組大鼠血漿腎素活性含量比較

造模成功后，用LSD-t檢驗(yàn)對(duì)1、3、5、7 d時(shí)刻血漿中的PRA情況進(jìn)行后續(xù)的多重比較，結(jié)果如下：1 d時(shí)SAH組、CCS組PRA含量均高于假手術(shù)組（P < 0.05），且CCS組高于SAH組（P < 0.05）；3 d時(shí)SAH組、CCS組PRA含量達(dá)高峰，均顯著高于假手術(shù)組（P < 0.05），且CCS組高于SAH組（P < 0.05）；5、7 d時(shí)SAH組、CCS組PRA含量逐漸下降，仍高于假手術(shù)組（P < 0.05）。隨時(shí)間延長(zhǎng)假手術(shù)組PRA含量逐漸下降，7 d后趨于穩(wěn)定，SAH組及CCS組PRA含量3 d達(dá)高峰，然后逐漸下降，14 d后基本趨于假手術(shù)組水平（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 三組大鼠血漿血管緊張素Ⅱ含量比較

造模成功后，用LSD-t檢驗(yàn)對(duì)1、3、5、7 d時(shí)刻血漿中的AngⅡ情況進(jìn)行后續(xù)的多重比較，結(jié)果如下：1 d時(shí)SAH組、CCS組AngⅡ含量均高于假手術(shù)組（P < 0.05），且CCS組高于SAH組（P < 0.05）；3 d時(shí)SAH組、CCS組AngⅡ含量達(dá)高峰，均顯著高于假手術(shù)組（P < 0.05），且CCS組高于SAH組（P < 0.05）；5、7 d時(shí)SAH組、CCS組AngⅡ含量逐漸下降，仍高于假手術(shù)組（P < 0.05）；假手術(shù)組AngⅡ含量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，至7 d后趨于穩(wěn)定；SAH組及CCS組AngⅡ含量3 d達(dá)高峰，后逐漸下降至14 d基本趨于假手術(shù)組水平（P > 0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 三組大鼠血漿PRA與AngⅡ含量的相關(guān)分析

Pearson線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，血漿PRA含量與AngⅡ含量呈正相關(guān)（r = 0.854，P < 0.01）。

3 討論

急性腦血管病引起CCS的發(fā)病率為62%～90%[5]，其核心特點(diǎn)是心臟運(yùn)動(dòng)異常的區(qū)域與冠狀動(dòng)脈供血區(qū)域不一致[6-10]，其病理生理及分子機(jī)制尚未闡明。目前，大多數(shù)研究表明，CCS與植物神經(jīng)功能的異常改變和腦部病變引起的體液改變相關(guān)。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）或腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）在維持機(jī)體內(nèi)水、電解質(zhì)及血壓平衡過(guò)程中具有重要作用，并具有調(diào)節(jié)大腦生理和病理性的作用[11]，其中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶可促進(jìn)腎素轉(zhuǎn)化為AngⅡ后進(jìn)一步與其受體結(jié)合[12]，有研究指出，其與腦血管事件發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[13]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)存在單獨(dú)的RAS，與循環(huán)系統(tǒng)的RAS協(xié)同參與腦組織結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)[14]。AngⅡ是RAS系統(tǒng)的主要效應(yīng)物質(zhì)，它也被稱為最強(qiáng)的內(nèi)源性縮血管因子，能直接促進(jìn)醛固酮的分泌，進(jìn)一步促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞對(duì)水的通透性，增加水的重吸收，加重腦水腫。已有研究表明[15]，在大鼠顱腦損傷模型中AngⅡ水平顯著升高。

SAH至顱內(nèi)壓升高，機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[16]，血漿中AngⅡ含量升高，引起冠狀動(dòng)脈收縮，增加心肌灌注阻力，減少心肌血液供應(yīng)，誘發(fā)急性心肌缺血性損傷[17-19]，經(jīng)磷酸肌醇激酶和AngⅡ受體調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和交感神經(jīng)相互作用，導(dǎo)致心肌過(guò)度收縮，引起心肌缺血和缺氧，高濃度的AngⅡ可提升醛固酮、精氨酸加壓素等，增加心臟前負(fù)荷，而心律失常為最常見(jiàn)的癥狀，不同類型心律失常發(fā)生率不同，最常見(jiàn)的是QT間期延長(zhǎng)[20-22]，這可能與CCS的發(fā)生及發(fā)展有一定的關(guān)聯(lián)。

本研究觀察了SAH后持續(xù)6 h心律失常的發(fā)生情況，以及14 d中血漿PRA、AngⅡ含量的變化。結(jié)果顯示，PRA、AngⅡ含量在SAH及SAH并發(fā)CCS組中均明顯升高，且3 d達(dá)最高，后含量逐漸下降并趨于穩(wěn)定。相比單純SAH組，SAH并發(fā)CCS組血漿及心肌局部組織中PRA、AngⅡ含量升高幅度更加明顯，隨著CCS組出現(xiàn)心律失常及其逐漸恢復(fù)，血漿中的PRA、AngⅡ含量亦達(dá)高峰后迅速下降，說(shuō)明RAS系統(tǒng)在CCS的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CCS在SAH 2 h發(fā)生率最高，這與文獻(xiàn)中AngⅡ增高直接或間接刺激交感神經(jīng)而增強(qiáng)對(duì)冠脈和心肌的收縮作用，使心臟做功加強(qiáng)但心肌供血卻相對(duì)不足，心肌氧耗量增加而氧供減少，以致能量耗竭，呼吸鏈功能紊亂[23]，從而加重心肌損傷一致。另有報(bào)道稱AngⅡ還通過(guò)激活交感神經(jīng)系統(tǒng)使去甲腎上腺素釋放增多，進(jìn)一步加重心臟的負(fù)荷；收縮冠脈使冠脈循環(huán)障礙，內(nèi)皮細(xì)胞收損，內(nèi)皮依賴性舒張減弱，促使自由基產(chǎn)生。

綜上所述，SAH早期RAS系統(tǒng)被激活，血漿中PRA、AngⅡ含量迅速上升，經(jīng)過(guò)急性期后，心律失常逐漸恢復(fù)，血漿中PRA、AngⅡ含量亦逐漸下降趨于正常，提示PRA、AngⅡ在SAH并發(fā)CCS的發(fā)生與發(fā)展中起到了一定的作用。由于實(shí)驗(yàn)組試驗(yàn)次數(shù)較少，所有CCS病例均無(wú)心肌梗死及其他嚴(yán)重心肌組織損傷，在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Dong Y，F(xiàn)an C，Hu W，et al. Melatonin attenuated early brain injury induced by subarachnoid hemorrhage via regulating NLRP3 inflammasome and apoptosis signaling [J]. J Pineal Res 2016，60（3）：253-262.

[2] 黃偉.去鐵胺改善大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后認(rèn)知功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2016.

[3] 李智奇，劉東輝，王錫麗，等.右美托咪定對(duì)動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者心血管功能的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，26（17）：1929-1931.

[4] 張呈祥，侯明，鮑海詠，等.蛛網(wǎng)膜下腔出血并腦心綜合征60例臨床分析[J].重慶醫(yī)學(xué)，2012，41（24）：2516-2517.

[5] 張艷麗，王曉麗，吳會(huì)蔚，等.RAS與腦心綜合征關(guān)系的初步探討[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，44（1）：45-48，52.

[6] Y-Hassan S. Acute cardiac sympathetic disruption in the pathogenesis of the takotsubo syndrome：A systematic review of the literature to date [J]. Cardiovasc Revasc Med，2014，15（1）：35-42.

[7] Y-Hassan S. Myocarditis changes in the stunned myocardial segments in takotsubo syndrome： The role of the pattern of ventricular wall motion abnormality [J]. Int J Cardiol，2015，191：267-269.

[8] Y-Hassan S. Too many cooks spoil the broth：The currently existing diagnostic criteria for Takotsubo syndrome-International Journal of Cardiology [J]. Int J Cardiol，2014， 173（3）：568-570.

[9] Showkathali R，Patel H，Ramoutar A，et al. Typical takotsubo cardiomyopathy in suspected ST elevation myocardial infarction patients admitted for primary percutaneous coronary intervention [J]. Eur J Intern Med，2014，25（2）：132-136.

[10] Ravi Y，Campagna R，Rosas PC，et al. Successful heart transplantation using a donor heart afflicted by takotsubo cardiomyopathy [J]. Proc（Bayl Univ Med Cent），2016，29（1）：73-74.

[11] 李蓓華，魯國(guó)洲，黃新武.血管性癡呆大鼠腎素-血管緊張素-醛固醇系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2017，37（14）：3423-3425.

[12] 戴榕，王超，周軍，等.硫氫化鈉對(duì)慢性心力衰竭大鼠心臟功能和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2018，34（2）：276-280.

[13] Ganguly P，Alam SF. Role of homocysteine in the development of cardiovascular disease [J]. Nutr J，2015，14（1）：6.

[14] 丁濤.亞低溫治療對(duì)急性腦出血患者腎素血管緊張素系統(tǒng)的影響[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2017，29（4）：436-437.

[15] 王娜，夏青，趙劍，等.AngⅡ/Ang-（1-7）/Mas系統(tǒng)通路與腦心綜合征關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，46（3）：207-211.

[16] 郭德偉.蛛網(wǎng)膜下腔出血急性期磁共振特點(diǎn)及早期腦損傷機(jī)制研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2017.

[17] 李捷，龍霄翱，黃拔齊，等.經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈輸注尼莫地平治療動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血后癥狀性腦血管痙攣的臨床分析[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2016，23（13）：53-56.

[18] 姜睿璇.蛛網(wǎng)膜下腔出血急性期腦心綜合征及預(yù)后相關(guān)研究[D].北京：首都醫(yī)科大學(xué)，2014.

[19] 曾唐怡.法舒地爾用于蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后腦血管痙攣（CVS）患者中的作用分析[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2017，55（20）：40-42.

[20] 謝飛，陳志遠(yuǎn)，曾家良，等.Hunt-Hess分級(jí)Ⅲ、Ⅳ級(jí)動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的早期手術(shù)的臨床研究[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2017，24（4）：61-63.

[21] Mierzewska-Schmidt M，Gawecka A. Neurogenic stunned myocardium - do we consider this diagnosis in patients with acute central nervous system injury and acute heart failure？ [J]. Anaesthesiol Intensive Ther，2015，47（2）：175-180.

[22] Murthy SB，Shah S，Venkatasubba Rao CP，et al. Clinical characteristics of myocardial stunning in acute stroke [J]. J Clin Neurosci，2014，21（8）：1279-1282.

[23] Wang R，Liu YY，Liu XY，et al. Resveratrol protects neurons and the myocardium by reducing oxidative stress and ameliorating mitochondria damage in a cerebral ischemia rat model [J]. Cell Physiol Biochem，2014，34（3）：854-864.

（收稿日期：2018-03-27 本文編輯：張瑜杰）