福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院/福建省醫(yī)學(xué)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001

澤瀉為多年沼生澤瀉科植物澤瀉Alismaorientalis(Sam.)Juzep.的干燥塊莖，最早歷史記載可追溯到《神農(nóng)本草經(jīng)》。其性寒味甘，有泄熱、利水滲濕、化濁降脂的功效[1]，主要有利尿[2]、降血糖[3-5]，降血脂[6-9]等活性。澤瀉主產(chǎn)福建、四川、江西等地，素有“建澤瀉”、“川澤瀉”、“江澤瀉”之稱，以建澤瀉、川澤瀉量大且使用廣泛，其中又以建澤瀉質(zhì)佳，被載入中國(guó)的道地藥材。目前主要采用性狀鑒別和化學(xué)成分分析對(duì)澤瀉進(jìn)行鑒定，該方法鑒定結(jié)果主觀性較強(qiáng)，準(zhǔn)確性無(wú)法得到保證。焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyrosequencing) 是一種基于酶催化反應(yīng)的新一代測(cè)序技術(shù)，其精確性和可重復(fù)性高，并能夠?qū)崟r(shí)、直觀地提供序列信息，同時(shí)能定性定量分析差異堿基。該技術(shù)利用生物素標(biāo)記一條擴(kuò)增引物，擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)需熒光標(biāo)記與電泳分離，因此操作更為簡(jiǎn)便、快捷。本實(shí)驗(yàn)采收福建省建甌建澤瀉藥材，同時(shí)以川澤瀉作為對(duì)照藥材(采自四川省眉山)，采用焦磷酸測(cè)序方法鑒定其基源，為今后澤瀉的質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 PCR儀(美國(guó)Bio-Rad)；高速離心機(jī)(德國(guó)eppendorf)；生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)；超微量核酸/蛋白分析儀(英國(guó)Biochrom)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(江南儀器廠)；電泳儀(六一儀器廠)；暗箱式紫外投射儀(上海顧村電光儀器廠)；實(shí)時(shí)定量焦磷酸測(cè)序儀(凱杰生物工程有限公司)；恒溫孵育器(德國(guó)eppendorf)。

1.2 材料 建澤瀉藥材采自福建省建甌吉陽(yáng)鎮(zhèn)，川澤瀉藥材采自四川省眉山市彭山區(qū)謝家鎮(zhèn)，經(jīng)福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院徐榕青研究員鑒定為澤瀉科植物澤瀉。分別取建澤瀉與川澤瀉的須根、葉柄及葉片樣本。

1.3 試劑 Binding Buffer、Denaturation Solution、Wash Buffer、annealing buffer、PyroMark Gold Q 24 Reagents均購(gòu)自凱杰生物工程有限公司；2×EasyTaqPCRSuperMix(AS111-14)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自美國(guó)BIOSHAPR；三羥甲基氨基甲烷、瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)NOVON；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)引物由鉑尚生物技術(shù)公司合成。

2 方法

2.1 DNA提取 采用的改良CTAB法分別提取建澤瀉、川澤瀉的須根、葉柄及葉片DNA。

2.2 PCR擴(kuò)增 25 μL PCR擴(kuò)增體系中包含有1 μL DNA模板(約50～100 ng)，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，10 μmol/L上下游引物各1 μL(引物序列見(jiàn)表1)，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件為94℃-5 min；(94℃-30 s，58℃-30 s，72℃-45 s)×30 cycle；72℃-5 min；擴(kuò)增產(chǎn)物保存于4℃。

表1 引物序列

2.3 焦磷酸測(cè)序 取5 μL PCR產(chǎn)物、1 μL的beads、40 μL bingding buffer，補(bǔ)足MQ至80 μL，25℃1400rpm振蕩孵育10 min。經(jīng)變性和洗滌后，使未標(biāo)記生物素的DNA單鏈與已標(biāo)記單鏈分離，將含有beading的反應(yīng)板于80℃孵育2 min后冷卻至室溫。試劑倉(cāng)中加入所需的酶、底物和dNTP等進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 測(cè)序驗(yàn)證 中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)中查詢所得ITS2序列上游引物：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，下游:5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR擴(kuò)增條件為94℃-5 min；(94℃-30 s，56℃-30 s，72℃-45 s)×30 cycle；72℃—10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。未經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

3 結(jié)果與分析

3.1 焦磷酸測(cè)序結(jié)果 采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)進(jìn)行SNP分析。根據(jù)ITS2位點(diǎn)突變情況，得兩種峰圖，建澤瀉(含須根、葉柄、葉片)突變位點(diǎn)堿基為A(如圖1所示)，川澤瀉(含須根、葉柄、葉片)突變位點(diǎn)堿基為T(如圖2所示)，二者突變頻率均不小于83%(見(jiàn)表2)。

表2 樣本的具體突變情況及頻率

3.2 測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 測(cè)序序列與下載序列見(jiàn)表3，同時(shí)由圖3可以看出，建澤瀉ITS2序列與東方澤瀉一致，與澤瀉存在A-T突變；川澤瀉ITS2序列與澤瀉一致，與東方澤瀉存在A-T突變。有研究表明東方澤瀉與澤瀉在ITS2序列上的A-T變異是穩(wěn)定突變，因此可準(zhǔn)確鑒定這兩個(gè)物種[10]。故可判斷建澤瀉與東方澤瀉基源一致，即Alismaorientalis(Sam.)Juzep.

表3 澤瀉測(cè)序結(jié)果及下載序列信息表

4 討論

實(shí)驗(yàn)采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)ITS2突變位點(diǎn)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)建澤瀉與川澤瀉在突變位點(diǎn)堿基不同，且毛細(xì)管電泳測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果，說(shuō)明焦磷酸測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此本實(shí)驗(yàn)建立的基于ITS2突變位點(diǎn)的焦磷酸鑒定技術(shù)能準(zhǔn)確鑒定不同產(chǎn)地的澤瀉物種。與直接測(cè)序法相比，焦磷酸測(cè)序所用DNA不需要經(jīng)過(guò)凝膠電泳純化和熒光標(biāo)記，測(cè)序過(guò)程中可對(duì)測(cè)序結(jié)果實(shí)時(shí)觀察，同時(shí)能定性定量分析差異堿基，靈敏度高，操作便捷，適合已知序列的DNA短片段測(cè)序，是一種適用于中藥材的分子生物學(xué)鑒定手段。