吳 永，王淑軍，呂明生，房耀維，劉 姝，嚴 翠，焦豫良,*

(1.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇連云港 222005; 2.江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室,江蘇連云港 222005)

普魯蘭酶(Pullulanase,EC 3.2.1.41)能夠特異性地水解普魯蘭多糖及淀粉中的α-1,6糖苷鍵,得到直鏈淀粉,屬于淀粉脫支酶的一種,在淀粉相關(guān)行業(yè)已得到廣泛應(yīng)用[1]。全酶法工藝具有安全、高效、成本低等特點,廣泛應(yīng)用于淀粉行業(yè)。在此工藝中加入普魯蘭酶可優(yōu)化工藝、充分利用原料、提高生產(chǎn)效率、改善品質(zhì)。目前普魯蘭酶已成功應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)[2]、高麥芽糖漿制備[3]、玉米淀粉改性[4]等淀粉相關(guān)行業(yè)。在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中,普魯蘭酶還可以與其他酶類協(xié)同作用于不同底物,得到不同的終產(chǎn)物,應(yīng)用于化工、制藥等行業(yè)[5-6]。所以普魯蘭酶的開發(fā)研究具有重要價值。

不同來源普魯蘭酶的酶學(xué)特性各有不同,為適應(yīng)不同生產(chǎn)需求,研究者們不斷從不同樣品中篩選產(chǎn)酶菌株,以獲得性質(zhì)獨特的普魯蘭酶。近年來,報道的產(chǎn)酶菌株有鹽球菌(Halococcussp.)[7],肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)[8],不動桿菌(Acinetobactersp.)[9]等。從研究現(xiàn)狀看,已有普魯蘭酶在其性質(zhì)上尚不能滿足工業(yè)需求,因此尋找酶學(xué)性質(zhì)良好的產(chǎn)生菌種仍然是必不可少的任務(wù)之一。海洋具有豐富的生物資源,海洋來源的普魯蘭酶具有耐鹽、耐堿、耐低溫等特性,在食品工業(yè)中具有更廣闊的應(yīng)用前景,為研究者提供了新的研究方向。本文從連云港海域的海泥中篩選目的菌株,以獲得性質(zhì)良好的出發(fā)菌株。

海帶多糖(Laminariajaponicapolysaccharide)具有生物量大、生物活性多樣、毒性較低等特點,在醫(yī)藥保健食品等行業(yè)都有不錯的應(yīng)用前景[10]。目前,已報道的海帶多糖生物活性主要有降血脂、降血糖和抗氧化等[11-12]。近年來植物多糖酶解產(chǎn)物的研究已成為研究熱點[13]。報道顯示超聲和雙氧水法降解海帶多糖,能產(chǎn)生抗氧化性增強的產(chǎn)物[14],但是酶解產(chǎn)物抗氧化活性的研究較少。

本試驗從連云港海域海泥中篩選得到一株產(chǎn)普魯蘭酶的巨大芽孢桿菌P6,對該菌株進行了發(fā)酵純化及酶學(xué)性質(zhì)分析,并選取海帶多糖為酶解底物,對其水解產(chǎn)物的抗氧化活性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海泥樣品 采集于連云港低潮海岸帶海域;普魯蘭多糖、麥芽糖、α-中溫淀粉酶(1000 U/g) 江蘇銳陽生物科技有限公司;酵母粉、瓊脂、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、聚乙二醇20000等 均為分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;結(jié)晶紫、預(yù)染蛋白Marker II、果膠酶(20 U/mg)、木瓜蛋白酶(15 U/mg) 上海生工生物工程有限公司;葡聚糖凝膠(SephadexTMG-100) GE Heathcare公司;聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒 Coolaber公司;十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑 均購自寶生物工程有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) ALDRICH公司。

JSM-6390LA掃描電鏡 日本TEOL;Nikon SMZ18體式顯微鏡 北京新卓儀器有限公司;PCR儀、酶標儀 BIO-RAD公司;HD-4電腦核酸蛋白檢測儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;日立CR22G高速冷凍離心機 日本HITACH;85-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器廠;DK-BD型電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DYY-2C型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)普魯蘭酶菌株篩選鑒定

1.2.1.1 主要培養(yǎng)基的配制 篩選培養(yǎng)基:普魯蘭多糖0.3%,酵母粉0.5%,瓊脂2%,海水。發(fā)酵培養(yǎng)基:普魯蘭多糖1%,酵母粉1%,磷酸緩沖液,pH6.5。

1.2.1.2 菌株的篩選 稱取1 g海泥于10 mL無菌海水中混勻,梯度稀釋至10-6,取10-3、10-4、10-5、10-6各50 μL涂布于以普魯蘭多糖為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基上,于25 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h,將長有單菌落平板的平皿蓋倒入適量乙醇,倒置于4 ℃冰箱,8 h后觀察,挑取有透明圈的菌落進行劃線純化培養(yǎng),并斜面保存。

1.2.1.3 菌株的鑒定 將純化后的P6菌株進行形態(tài)學(xué)觀察,挑菌涂布于蓋玻片,戊二醛、磷酸緩沖液固定,不同濃度乙醇脫水處理,干燥后噴金,掃描電鏡觀察;參考伯杰氏細菌手冊對菌株P(guān)6進行生理生化鑒定[15]。

1.2.1.4 P6菌株16S rRNA與gyrB序列分析 芽孢桿菌屬16S rRNA序列具有高度相似性,單一用16S rRNA鑒定不夠可靠[16]。將16S rRNA、gyrB序列分析相結(jié)合[17],可獲得更可靠的結(jié)果。以P6菌株細胞為模板進行PCR擴增,16S rRNA引物(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),gyrB引物(上游:5′-GGCGGCGGCGGCTATAA-3′,下游:5′-TAGCTGCCATTCTTGC-3′)。反應(yīng)體系:2×Taq Mix(12.5 μL),上下游引物(各0.3 μL),模板(OD6000.5細胞懸液0.5 μL),dd H2O(11.4 μL)。反應(yīng)程序:94 ℃變性10 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,30個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。PCR純化產(chǎn)物送上海生工測序,測序結(jié)果提交至GenBank。利用Mega 7.0.14軟件分別基于16S rRNA和gyrB基因序列對菌株P(guān)6進行系統(tǒng)進化分析,選擇鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)與純化

1.2.2.1 產(chǎn)酶曲線的測定 將處于生長期的P6菌株稀釋成OD600為0.05的細胞懸液,按0.1%(v/v)接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,25 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)72 h,每6 h取樣分別測菌體與上清的酶活。

普魯蘭酶活力測定方法(DNS法):發(fā)酵液12000 r/min、4 ℃離心,取上清100 μL,加100 μL 1%普魯蘭多糖溶液(pH6.5磷酸緩沖液配制),45 ℃反應(yīng)2 h,加DNS 100 μL,沸水浴10 min,以相同溶液的混合液沸水浴10 min作對照;100 μL離心菌體沉淀加100 μL pH6.5磷酸緩沖液,后續(xù)步驟同上清,測定反應(yīng)液540 nm處吸光值。酶活力定義:在45 ℃條件下,單位時間(h)內(nèi)分解普魯蘭糖生成1 μmol還原糖所需的酶量為一個活力單位(U)。

酶活(U)=W×1000/M×T×V

式中:W:麥芽糖(mg),標準曲線求得;M:麥芽糖分子量,360.32;T:反應(yīng)時間(h);V:酶用量(mL)。

1.2.2.2 普魯蘭酶的純化 收集發(fā)酵48 h的菌體,pH6.5磷酸緩沖液重懸,超聲波破碎1 h(250 W,破碎2 s間隔3 s),12000 r/min、4 ℃離心25 min,取上清作為純化粗酶液,進行硫酸銨梯度鹽析,收集鹽析沉淀,用pH6.5磷酸緩沖液重溶,透析脫鹽,聚乙二醇20000濃縮至2 mL,過葡聚糖凝膠柱進一步純化,收集有普魯蘭酶活性的組分,進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.3 酶學(xué)性質(zhì)的測定 酶活力測定方法參照1.2.2.1。以1%普魯蘭多糖為底物,在pH6.5下,將反應(yīng)物分別置于30～60 ℃下,每5 ℃為間隔,反應(yīng)2 h,測定酶活力,分析其最適反應(yīng)溫度。在pH為3～8.5,每0.5個pH為間隔,45 ℃反應(yīng)2 h,測定酶活力,分析其最適反應(yīng)pH。將該酶在30、40、45、50、65 ℃下分別保溫5 h,每1 h取樣,加入底物，45 ℃反應(yīng)2 h,測定其殘余酶活,分析溫度穩(wěn)定性。在pH為5、6、6.5、7、7.5、8下45 ℃保溫12 h,每2 h取樣,測定其殘余酶活,分析pH穩(wěn)定性。取每組的最高酶活作為100%,計算不同條件下的相對酶活力,以溫度或pH為橫坐標,以相對酶活力為縱坐標,分析其酶學(xué)性質(zhì)。

1.2.4 海帶多糖普魯蘭酶水解產(chǎn)物的抗氧化研究

1.2.4.1 海帶多糖的提取 參考翟為等[18]的方法提取海帶多糖。

1.2.4.2 海帶多糖普魯蘭酶水解物的制備 取1 mL 1%(w/v)海帶多糖溶液(pH6.5磷酸緩沖液配制),加1 mL純化后pH6.5磷酸緩沖液透析得到的普魯蘭酶溶液(58 U/mL),45 ℃反應(yīng)12 h,反應(yīng)液作為海帶多糖普魯蘭酶反應(yīng)組。取上述1 mL普魯蘭酶溶液100 ℃滅活10 min,加入1 mL1%海帶多糖溶液,45 ℃保溫12 h,混合液作為海帶多糖普魯蘭酶滅活組。α-淀粉酶操作同上,反應(yīng)溫度為60 ℃。

1.2.4.3 海帶多糖水解產(chǎn)物抗氧化活性的測定 實驗共7組樣品。樣品1:pH6.5磷酸緩沖液作空白對照組;樣品2∶1.2.4.2中海帶多糖普魯蘭酶滅活組;樣品3:1.2.4.2中海帶多糖普魯蘭酶反應(yīng)組;樣品4:1.2.4.2中海帶多糖α-淀粉酶滅活組;樣品5:1.2.4.2中海帶多糖α-淀粉酶反應(yīng)組;樣品6:1.2.4.2中1 mL 1%海帶多糖溶液加1 mL pH6.5磷酸緩沖液的混合液作為酶滅活組對照;樣品7:pH6.5磷酸緩沖液配制0.5%(w/v)維生素C(VC)溶液作為陽性對照。

抗氧化活性測定方法:清除DPPH自由基活性測定方法參照Amarowicz等[19];清除·OH自由基活性測定方法參照劉俊的結(jié)晶紫法[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實驗設(shè)三組平行,實驗結(jié)果用平均值±標準差(n=3)表示,采用Origin 9.0、SPSS V17.0對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析,以p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)普魯蘭酶菌株鑒定

2.1.1 菌株P(guān)6的形態(tài)學(xué)特征 菌株P(guān)6菌落呈白色、不透明、邊緣圓潤、表面粗糙,中間稍有隆起無褶皺(如圖1a),生長后期菌落中間出現(xiàn)液化;顯微觀察:P6為革蘭氏陽性桿狀細菌,有芽孢,不能運動。菌體大小約為1.2～1.6×2.0～4.0 μm,長桿狀,末端圓,兩個或多個呈鏈狀排列(如圖1b);芽孢大小為0.7～1.1×1.2～2.0 μm,橢圓形,次端生。

圖1 菌株P(guān)6菌落形態(tài)(a)和電鏡觀察的細胞形態(tài)(b)Fig.1 Colony morphology(a)and electron microcell microscopy(b)of Strain P6

2.1.2 菌株P(guān)6的生理生化特征 該菌株部分生理生化結(jié)果見表1,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征,將P6菌株初步鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。

表1 菌株P(guān)6部分生理生化試驗結(jié)果Table 1 Some physiological and biochemical test results of strain P6

2.1.3 P6菌株的16S rRNA、gyrB基因擴增 將菌株P(guān)6的16S rRNA、gyrB基因測序結(jié)果提交到GenBank(16S rRNA注冊號:KU206387;gyrB注冊號:KY412801)進行Blast比對,并利用Mega 7.0.14構(gòu)建進化樹(如圖2、圖3),發(fā)現(xiàn)P6菌株與Bacillusmegaterium的同源性最高,16S rRNA、gyrB相似度達100%、99%,且在同一分支上。該結(jié)果與形態(tài)學(xué)特征、生理生化分析結(jié)果一致,P6菌株鑒定為巨大芽孢桿菌。目前,國內(nèi)尚無產(chǎn)普魯蘭酶巨大芽孢桿菌的報道,菌種保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號為CCTCC M2017009。

圖2 基于菌株P(guān)6 16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strain P6 based on 16S rRNA sequences注:▲:目的菌株；圖3同。

圖3 基于菌株P(guān)6 gyrB序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the strain P6 based on gyrB sequences

2.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)與純化

2.2.1 產(chǎn)酶曲線的測定 測定菌株P(guān)6細胞內(nèi)與上清中的普魯蘭酶活力,繪制曲線(圖4)。由圖4可以看出,P6發(fā)酵液上清中無酶活,細胞菌體有酶活,該普魯蘭酶為細胞壁結(jié)合型酶,目前已報道的細胞壁結(jié)合型普魯蘭酶較少;P6菌株生長至24 h時,酶活力約達最高酶活的60%,48 h酶活達到最高;48 h后P6菌的酶活力開始下降,72 h酶活力損失約30%。目前已報道的芽孢桿菌屬的產(chǎn)普魯蘭酶時間多為54 h[21-22]。本結(jié)果表明,相較于其他桿菌,巨大芽孢桿菌P6產(chǎn)酶較快。

圖4 發(fā)酵時間對P6產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of the fermentation time on enzyme production of strain P6

2.2.2 酶的純化 細胞壁結(jié)合型普魯蘭酶在提取過程無需對發(fā)酵液進行濃縮,直接收集菌體,破碎離心得到上清作為純化粗酶液,進行硫酸銨鹽析,測得普魯蘭酶活性最高的鹽析梯度為60%～80%,收集該梯度鹽析產(chǎn)物,然后進行SephadexTM G-100層析,BCA試劑盒分別測出每一步的總蛋白,計算出比活力,結(jié)果見表2。初步純化后的普魯蘭酶的比活力為62.3 U/mg,回收率為9.1%。通過對凝膠過濾后不同組分的蛋白進行酶活測定和SDS-PAGE電泳分析,得出普魯蘭酶蛋白的分子量約為43 kDa(圖5)。

表2 普魯蘭酶的純化Table 2 Purification of pullulanase

圖5 純化普魯蘭酶蛋白電泳Fig.5 Protein electrophoresis of purified pullulanse注:1:純化后普魯蘭酶;M:預(yù)染蛋白Marker II。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)分析

P6產(chǎn)普魯蘭酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃(如圖6)。在40 ℃保溫5 h,仍有95%以上相對殘余酶活;45 ℃保溫5 h,殘余酶活達70%;50 ℃保溫5 h,酶活下降到30%;65 ℃保溫1 h,酶活完全喪失(如圖7)。該酶的最適pH為6.5(如圖8),在pH5.0～8.0均有較強的酶活,說明該普魯蘭酶pH范圍廣泛,酸性或堿性條件都有一定酶活力。在pH6～7.5保溫12 h,殘余酶活仍有40%以上;在pH5.0～8.0保溫2 h后,酶活力下降較快,在2～10 h保溫過程中,酶活力保持穩(wěn)定(如圖9),說明該酶具有較好的pH穩(wěn)定性。P6菌株所產(chǎn)普魯蘭酶最適溫度和最適pH均低于已報道的海洋來源普魯蘭酶,其最適pH多為8,最適溫度均在50 ℃以上[24-25]，可能由于產(chǎn)酶菌株的來源不同顯示出了地域差異。

圖6 溫度對普魯蘭酶酶活的影響Fig.6 Effect of temperature on the enzymatic activity of pullulanse

圖7 溫度對普魯蘭酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of temperature on the stability of pullulanse

圖8 pH對普魯蘭酶酶活的影響Fig.8 Effect of pH on the enzymatic activity of pullulanse

圖9 pH對普魯蘭酶穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effects of pH on the stability of pullulanse

2.4 海帶多糖普魯蘭酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性

從圖10和圖11可以看出,海帶多糖對DPPH和·OH自由基的清除率均顯著高于空白對照(p<0.05),顯著低于VC(p<0.05),即海帶多糖具有顯著的抗氧化能力,但弱于VC,與文獻[11]報道一致。海帶多糖酶滅活組與海帶多糖組的清除力無顯著性差異(p>0.05),說明酶已滅活,海帶多糖未被水解,樣品保持了海帶多糖的抗氧化活性。海帶多糖普魯蘭酶反應(yīng)組對DPPH和·OH自由基的清除率均顯著高于普魯蘭酶滅活組(p<0.05),顯著低于VC(p<0.05),說明海帶多糖普魯蘭酶水解后抗氧化活性顯著增強,抗氧化能力低于VC。α-淀粉酶海帶多糖水解產(chǎn)物對DPPH和·OH自由基的清除率均顯著低于普魯蘭酶海帶多糖水解產(chǎn)物(p<0.05)。本研究對普魯蘭酶在最適條件下水解海帶多糖的酶解產(chǎn)物進行了抗氧化研究,證明了海帶多糖水解后抗氧化活性得到增強,不同條件下的酶解產(chǎn)物與抗氧化活性之間的關(guān)系還有待于進一步研究與探討。

圖10 α-淀粉酶、普魯蘭酶水解海帶多糖的 水解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力Fig.10 Scavenging capacity of Laminaria japonica polysaccharide hydrolysate hydrolysised by α-amylase and pullulanse against DPPH free radicals

圖11 α-淀粉酶、普魯蘭酶水解海帶多糖的 水解產(chǎn)物清除·OH自由基的能力Fig.11 Scavenging capacity of Laminaria japonica polysaccharide hydrolysate hydrolysised byα-amylase and pullulanse against ·OH free radicals

3 結(jié)論

從連云港海域的海泥中篩選得到一株產(chǎn)普魯蘭酶的巨大芽孢桿菌P6(Bacillusmegaterium)。對該菌株進行了產(chǎn)酶培養(yǎng)純化,純化后普魯蘭酶比活力提高到62.3 U/mg,回收率為9.1%,蛋白電泳顯示其分子量為43 kDa。該普魯蘭酶的最適溫度為45 ℃,最適pH為6.5,在40 ℃具有良好的熱穩(wěn)定性。在pH4～8范圍均有酶活性,在pH6～7.5具有良好的pH穩(wěn)定性。海帶多糖經(jīng)普魯蘭酶水解后抗氧化活性顯著增強(p<0.05),抗氧化能力顯著低于VC,顯著高于α-淀粉酶海帶多糖水解產(chǎn)物。本研究為普魯蘭酶在抗氧化功能食品方面的研究提供參考。