何山，李利，楊景暉

鈣衛(wèi)蛋白主要來自小腸黏膜層內(nèi)活化的中性粒細(xì)胞，并且已被證實(shí)是腸道炎性反應(yīng)中一個(gè)重要的免疫標(biāo)志物，尤其在新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）、腸道缺血-再灌注損傷中表達(dá)更為明顯［1］。關(guān)于鈣衛(wèi)蛋白與NEC的相關(guān)性研究，近年來開始成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。有國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，鈣衛(wèi)蛋白在NEC中的表達(dá)明顯升高，并且可能成為日后作為早期診斷及預(yù)警的非侵入性檢測指標(biāo)［2］。研究發(fā)現(xiàn)鈣衛(wèi)蛋白在足月兒NEC的發(fā)生中有較高的表達(dá)，并將腸型脂肪酸結(jié)合蛋白和糞便鈣衛(wèi)蛋白聯(lián)合檢測，在足月兒NEC的診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值［3］。但目前仍然缺乏比較敏感及準(zhǔn)確的早期預(yù)警NEC發(fā)生的生化指標(biāo)，并且很多患兒在輸血后48 h以內(nèi)發(fā)生NEC，所以筆者提出“糞便鈣衛(wèi)蛋白的變化可能與輸血有關(guān)”的假設(shè)。糞便中的鈣衛(wèi)蛋白在室溫內(nèi)穩(wěn)定，且糞便標(biāo)本較血液標(biāo)本采集更加容易及無侵入性，故非常適合用來作為極低出生體質(zhì)量兒及早產(chǎn)兒發(fā)生NEC的早期預(yù)警指標(biāo)。早產(chǎn)兒尤其是極低出生體質(zhì)量兒需要接受輸血治療的比例明顯高于足月兒和體質(zhì)量大的新生兒，然而，輸血后引發(fā)NEC的現(xiàn)象，已在國內(nèi)外許多研究中證實(shí)［4-5］，因此，本研究主要檢測患兒輸注懸浮紅細(xì)胞后72 h內(nèi)，糞便鈣衛(wèi)蛋白的變化，從而進(jìn)一步證實(shí)糞便鈣衛(wèi)蛋白的上升與輸血相關(guān)，佐證輸血可能誘發(fā)NEC的觀點(diǎn)，并對(duì)鈣衛(wèi)蛋白在日后NEC的早期診斷中的價(jià)值做出研究，對(duì)日后早產(chǎn)兒接受輸血治療的標(biāo)準(zhǔn)修訂提供一定的依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年1月—2017年1月云南省第一人民醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房出生體質(zhì)量＜1 500 g的極低出生體質(zhì)量兒27例為研究對(duì)象。符合《實(shí)用新生兒學(xué)》［6］中早產(chǎn)兒貧血輸血治療標(biāo)準(zhǔn)、患兒輸血指征，接受過懸浮紅細(xì)胞輸注為輸血組，19例；未接受輸血患兒為未輸血組，8例。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重的先天缺陷；產(chǎn)前篩查有嚴(yán)重的染色體或基因缺陷；嚴(yán)重的消化道畸形；NEC發(fā)生在研究之前。本研究經(jīng)云南省第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；均經(jīng)患兒家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集患兒的一般資料，包括性別、孕周、出生體質(zhì)量、出生時(shí)輕度窒息、出生時(shí)重度窒息、母親感染、順產(chǎn)。

1.2.2 治療方法 輸血組19例患兒，根據(jù)《實(shí)用新生兒學(xué)》［6］中早產(chǎn)兒貧血輸血治療標(biāo)準(zhǔn)，均接受懸浮紅細(xì)胞15 ml/kg的輸血治療。對(duì)照組8例患兒由于貧血程度不嚴(yán)重，未接受任何輸血及血液制品的治療。

1.2.3 觀察指標(biāo) （1）兩組患兒在采集糞便前，均查血常規(guī)中的紅細(xì)胞比容。（2）所有患兒采集時(shí)間相似，即未輸血組患兒每24 h采集1次糞便，共采集4次；輸血組患兒采集輸血前最后1次糞便，以及輸血后24、48、72 h糞便。糞便標(biāo)本均用無菌塑料容器貯存，存放于-70 ℃冰箱中冷凍保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測標(biāo)本中鈣衛(wèi)蛋白的含量，試劑盒購自美國PhiCal/Genova Diagnostics，Ashville公司。（3）觀察NEC發(fā)生情況。NEC的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《實(shí)用新生兒學(xué)》［6］，即滿足：①腹脹；②便血；③嗜睡、呼吸暫停，肌張力低下；④腸壁積氣，只要4條中滿足2條，并有影像學(xué)表現(xiàn)（腹部X線片提示腸管擴(kuò)張，積氣）便可診斷NEC。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料進(jìn)行單樣本K-S正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對(duì)輸血組不同時(shí)間點(diǎn)之間鈣衛(wèi)蛋白的比較采用單組重復(fù)測量方差分析，組間兩兩比較采用校正LSD-t法，相同時(shí)間點(diǎn)兩組間鈣衛(wèi)蛋白的比較采用協(xié)方差分析（協(xié)變量為紅細(xì)胞比容）。以初始鈣衛(wèi)蛋白水平為控制變量，采用偏相關(guān)分析方法分析紅細(xì)胞比容與鈣衛(wèi)蛋白變化幅度（第4個(gè)時(shí)間點(diǎn)水平-初始水平）

的相關(guān)性；采用Pearson線性相關(guān)性分析方法分析紅細(xì)胞比容與鈣衛(wèi)蛋白變化幅度的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 兩組患兒男性、孕周、出生體質(zhì)量、出生時(shí)輕度窒息、出生時(shí)重度窒息、母親感染、順產(chǎn)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

2.2 兩組患者紅細(xì)胞比容比較 輸血組紅細(xì)胞比容為（33.0±6.0）%，未輸血組紅細(xì)胞比容為（45.8±5.8）%，輸血組的紅細(xì)胞比容低于未輸血組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.114，P＜0.001）。

2.3 輸血組不同時(shí)間點(diǎn)糞便鈣衛(wèi)蛋白水平比較 輸血組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的糞便鈣衛(wèi)蛋白比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。輸血后24、48、72 h糞便鈣衛(wèi)蛋白高于輸血前，輸血后24 h糞便鈣衛(wèi)蛋白低于輸血后48、72 h，輸血后48 h糞便鈣衛(wèi)蛋白低于輸血后72 h，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。對(duì)輸血組糞便鈣衛(wèi)蛋白隨時(shí)間的變化趨勢進(jìn)行曲線擬合分析，結(jié)果顯示，糞便鈣衛(wèi)蛋白隨時(shí)間的變化呈線性上升趨勢（F=33.390，P＜0.001，見圖1）。

表1 兩組患兒一般資料比較Table 1 Comparison of baseline characteristics between the two groups of VLBWI

2.4 輸血后NEC發(fā)生情況 共發(fā)生2例NEC，均在輸血組。1例于輸血結(jié)束后78 h，1例于輸血結(jié)束后81 h。

2.5 校正紅細(xì)胞比容后不同時(shí)間點(diǎn)兩組間糞便鈣衛(wèi)蛋白的比較 以紅細(xì)胞比容為協(xié)變量，不同時(shí)間點(diǎn)糞便鈣衛(wèi)蛋白水平為因變量，進(jìn)行協(xié)方差分析，結(jié)果顯示，在校正紅細(xì)胞比容對(duì)糞便鈣衛(wèi)蛋白水平的影響后，兩組各時(shí)間點(diǎn)糞便鈣衛(wèi)蛋白比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表3）。

2.6 紅細(xì)胞比容與糞便鈣衛(wèi)蛋白相關(guān)性分析 未控制初始糞便鈣衛(wèi)蛋白水平時(shí)，紅細(xì)胞比容與糞便鈣衛(wèi)蛋白變化幅度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.696，P=0.001，見圖2）?？刂瞥跏技S便鈣衛(wèi)蛋白水平后，采用偏相關(guān)分析結(jié)果顯示，紅細(xì)胞比容與糞便鈣衛(wèi)蛋白變化幅度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.653，P=0.003，見圖3）。

表2 輸血組不同時(shí)間點(diǎn)糞便鈣衛(wèi)蛋白水平比較（±s，μg/g，n=19）Table 2 Fecal calprotectin level at different time points in VLBWI receiving RBC suspension transfusion

表2 輸血組不同時(shí)間點(diǎn)糞便鈣衛(wèi)蛋白水平比較（±s，μg/g，n=19）Table 2 Fecal calprotectin level at different time points in VLBWI receiving RBC suspension transfusion

注：與輸血前比較，aP＜0.05；與輸血后24 h比較，bP＜0.05；與輸血后48 h比較，cP＜0.05

時(shí)間點(diǎn) 糞便鈣衛(wèi)蛋白輸血前 116±53輸血后24 h 147±68a輸血后48 h 185±82ab輸血后72 h 228±116abc F值 26.320 P值 ＜0.001

圖1 糞便鈣衛(wèi)蛋白隨時(shí)間的變化趨勢圖Figure 1 Fecal calprotectin level in the transfusion group at different time points

表3 校正紅細(xì)胞比容后不同時(shí)間點(diǎn)兩組間糞便鈣衛(wèi)蛋白的比較（±s，μg/g）Table 3 Comparison of fecal calprotectin level between two groups at different time points after the HCT correction

表3 校正紅細(xì)胞比容后不同時(shí)間點(diǎn)兩組間糞便鈣衛(wèi)蛋白的比較（±s，μg/g）Table 3 Comparison of fecal calprotectin level between two groups at different time points after the HCT correction

組別 例數(shù) 第1次 第2次 第3次 第4次未輸血組 8 107±28 107±22 106±15 101±18輸血組 19 116±53 147±68 185±82 228±116 F值 4.132 1.785 0.610 0.139 P值 0.053 0.194 0.442 0.712

3 討論

許多研究證實(shí)鈣衛(wèi)蛋白是極具價(jià)值的腸道炎性指標(biāo)［7］。在腸道發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，血液循環(huán)里活化的中性粒細(xì)胞會(huì)趨化到腸道黏膜，其中一部分中性粒細(xì)胞會(huì)移行進(jìn)入腸腔。雖然在糞便中可以檢測到多種白細(xì)胞相關(guān)性炎性因子，但是鈣衛(wèi)蛋白是研究最廣的一種。其為中性粒細(xì)胞更新的標(biāo)志物，在許多炎癥情況下升高。中性粒細(xì)胞在輸血后可以被活化從而導(dǎo)致宿主組織發(fā)生炎性反應(yīng)，并已在血液疾病中得到證實(shí)，如輸血相關(guān)性肺損傷、腫瘤、創(chuàng)傷后輸血治療等［8］。有研究報(bào)道輸注的懸浮紅細(xì)胞中含有多種可致宿主中性粒細(xì)胞活化的成分，如黏膜碎片、血管微顆粒、脂質(zhì)分子（如溶血卵磷脂）、抗中性粒細(xì)胞抗原抗體等［9］。國外有研究報(bào)道，如果宿主在輸血前貧血程度重，紅細(xì)胞比容低，在輸血后引起的NEC發(fā)生率更高（OR=1.10，P=0.01）［10］。本研究結(jié)果顯示，在貧血需要輸血的極低出生體質(zhì)量兒中，輸血后72 h內(nèi)，糞便鈣衛(wèi)蛋白水平上升。而鈣衛(wèi)蛋白作為腸道非常敏感的炎性指標(biāo)，可能對(duì)NEC的早期預(yù)警有很好的價(jià)值，本研究就提出假設(shè)：是否可以在極低出生體質(zhì)量兒出現(xiàn)輸血或消化道相關(guān)癥狀時(shí)，如嘔吐、腹脹、喂養(yǎng)不耐受，常規(guī)篩查腸道中的鈣衛(wèi)蛋白水平，并根據(jù)鈣衛(wèi)蛋白水平對(duì)患兒進(jìn)行早期干預(yù)，如禁食、持續(xù)胃腸道減壓、抗感染、改善循環(huán)等治療，從而降低NEC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

圖2 未控制初始糞便鈣衛(wèi)蛋白水平時(shí)紅細(xì)胞比容與糞便鈣衛(wèi)蛋白變化幅度的相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis of HCT and fecal calprotectin level when the baseline fecal calprotectin level was uncontrolled

圖3 控制初始糞便鈣衛(wèi)蛋白水平后紅細(xì)胞比容與糞便鈣衛(wèi)蛋白變化幅度的相關(guān)性分析Figure 3 Correlation analysis of HCT and fecal calprotectin level when the baseline fecal calprotectin level was controlled

本研究結(jié)果顯示，輸血組糞便鈣衛(wèi)蛋白隨時(shí)間的變化呈線性上升趨勢，提示輸血組的患兒腸道上皮發(fā)生了炎性反應(yīng)。2例患兒在輸血后發(fā)生了NEC。在動(dòng)物研究中，貧血時(shí)腸系膜灌注將會(huì)減少，導(dǎo)致缺氧及乳酸堆積［11］，同時(shí)貧血也可以改變胎兒到新生兒轉(zhuǎn)變過程中腸系膜血管的阻力，進(jìn)而加劇腸道的缺血、缺氧，導(dǎo)致NEC的發(fā)生［12］。紅細(xì)胞比容可以反映貧血程度，紅細(xì)胞比容與鈣衛(wèi)蛋白變化幅度呈負(fù)相關(guān)，說明極低出生體質(zhì)量兒在貧血時(shí)腸道處于偏低灌注水平，當(dāng)輸血后，導(dǎo)致腸道灌注水平改變，從而啟動(dòng)了腸道內(nèi)較為明顯的炎性反應(yīng)，而炎性反應(yīng)可能與NEC的發(fā)生密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在校正紅細(xì)胞比容對(duì)糞便鈣衛(wèi)蛋白水平的影響后，兩組各時(shí)間點(diǎn)糞便鈣衛(wèi)蛋白比較無差異，其原因可能與輸血組的樣本量較小有關(guān)，日后將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，驗(yàn)證研究結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示，未控制初始糞便鈣衛(wèi)蛋白水平時(shí)，紅細(xì)胞比容與糞便鈣衛(wèi)蛋白變化幅度呈負(fù)相關(guān)；以初始糞便鈣衛(wèi)蛋白為控制變量，紅細(xì)胞比容與糞便鈣衛(wèi)蛋白變化幅度呈負(fù)相關(guān)。提示輸血前貧血越嚴(yán)重（紅細(xì)胞比容水平越低），鈣衛(wèi)蛋白的上升幅度越大。鈣衛(wèi)蛋白在NEC患兒的腸道中含量高于正常兒童，而輸血組患兒發(fā)生NEC的風(fēng)險(xiǎn)可能比未輸血的患兒要高。雖然極低出生體質(zhì)量兒的發(fā)生率相對(duì)較小，然而孕周＜33周，體質(zhì)量＜1 500 g的早產(chǎn)兒及極低出生體質(zhì)量兒是新生兒人群中死亡率最高的［13］，其中嚴(yán)重威脅患兒生存及預(yù)后的疾病中，NEC扮演著重要的角色。所以盡可能減少對(duì)患兒的輸血治療，嚴(yán)格把握輸血指征。本研究提示，糞便鈣衛(wèi)蛋白的變化對(duì)極低出生體質(zhì)量兒腸道內(nèi)炎癥的預(yù)警及診斷有著極高的價(jià)值。但由于極低出生體質(zhì)量兒的出生率較低，本研究是單中心且樣本量較少，日后將擴(kuò)大樣本含量，提高研究結(jié)果的價(jià)值。

綜上所述，輸血后極低出生體質(zhì)量兒腸道內(nèi)的鈣衛(wèi)蛋白隨時(shí)間的變化明顯上升，而糞便鈣衛(wèi)蛋白對(duì)腸道炎性反應(yīng)的發(fā)生有很強(qiáng)的預(yù)警作用，在輸注懸浮紅細(xì)胞后，尤其貧血程度重的極低出生體質(zhì)量兒可能會(huì)誘發(fā)腸道內(nèi)炎性反應(yīng)，從而增加發(fā)生NEC的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)極低出生體質(zhì)量兒輸血治療時(shí)應(yīng)嚴(yán)格把握指征，在非輸血的患兒中盡早進(jìn)行NEC的預(yù)防干預(yù)。

作者貢獻(xiàn)：李利進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；何山進(jìn)行文獻(xiàn)資料收集，撰寫論文；楊景暉進(jìn)行文章的可行性分析。

本文無利益沖突。