周少波，靳浩

（1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 普通外科，安徽 蚌埠 233000；2. 廣東省珠海市人民醫(yī)院 普外二科，廣東 珠海 519000）

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1]，其惡性程度高、臨床癥狀出現(xiàn)遲、早期診斷困難。不僅如此，膽囊癌的進(jìn)展極快，膽囊癌患者術(shù)后的5年生存率僅為5%～12%[2]。乙酰肝素酶（heparanase）作為哺乳動物體內(nèi)唯一可以特異性切割細(xì)胞表面HS鏈的酶，在人類的腫瘤[3]、炎癥[4]、血管增生[5]、先兆子癇[6]、朊病毒病[7]等多種病理生理過程當(dāng)中發(fā)揮著重要的作用。一些研究發(fā)現(xiàn)，乙酰肝素酶可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，因此，乙酰肝素酶的抑制劑作為潛在的抗腫瘤藥物，受到極大的關(guān)注[8]。作為細(xì)胞表面的黏蛋白多糖，多配體蛋白聚糖1（syndecan-1）同樣是一種與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)的生物大分子蛋白。多配體蛋白聚糖1參與調(diào)控多項(xiàng)生命活動，包括聚集淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫機(jī)制和重塑細(xì)胞基質(zhì)等，尤為重要的是可以對腫瘤細(xì)胞的侵襲和黏附起到調(diào)節(jié)作用[9]。已經(jīng)有研究證實(shí)，在消化道腫瘤當(dāng)中，乙酰肝素酶可以調(diào)低多配體蛋白聚糖1的水平，而多配體蛋白聚糖1水平的降低則引起腫瘤的生長加速[10-14]。但在膽囊癌細(xì)胞中是否存在相同的情況，還沒有相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。本研究就兩者在膽囊癌細(xì)胞中的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD購自上海中國科學(xué)院生物科學(xué)研究院生物細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購于四季青公司；1:250胰蛋白酶，RPMI-1640培養(yǎng)基，F(xiàn)BS，TRIzol溶液，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購于美國Invitrogen公司；PCR引物，分子標(biāo)志物和dNTPs購于上海生工生物有限公司；逆轉(zhuǎn)錄元件，限制性內(nèi)切酶BglII和SalI，T4 DNA連接酶，BCA蛋白定量和實(shí)時(shí)qPCR元件購于MBI Fermentas中國有限公司；質(zhì)粒pcDNA3.1購于本諾生物技術(shù)有限公司，PCR提純和質(zhì)粒提取元件購自美國Axygen生物公司；乙酰肝素酶單克隆一抗，辣根過氧化物酶兔抗IgG購自博士德生物科技有限公司；基質(zhì)膜購自美國BD生物科學(xué)公司。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建和驗(yàn)證

構(gòu)建乙酰肝素酶過表達(dá)的載體。乙酰肝素酶基因序列由GeneBank檢索得出，依據(jù)乙酰肝素酶序列（基因ID：ENSG00000225609.1）合成單鏈脫氧核苷酸，再通過變性和退火轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA。將特殊序列嵌入pGPU6/GFP/Neo載體。將載體轉(zhuǎn)染入大腸埃希菌，于37 ℃ 室溫下在含有慶大霉素的培養(yǎng)基上對大腸埃希菌進(jìn)行隔夜培養(yǎng)。將大腸埃希菌質(zhì)粒中的質(zhì)粒進(jìn)行分離并確定其DNA序列，將具有正確序列的質(zhì)粒用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

根據(jù)操作說明在脂質(zhì)體介導(dǎo)下使用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD。在轉(zhuǎn)染24 h后使用反式熒光顯微鏡測定其轉(zhuǎn)染率。在加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中對被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系進(jìn)行保存和培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR檢測

使用Primer Express軟件從GeneBank數(shù)據(jù)庫中檢索出乙酰肝素酶、多配體蛋白聚糖1、β-actin引物的基因序列，以此構(gòu)建引物。乙酰肝素酶引物正向：5'-AGC CTC GAA GAA AGA CGG-3'；反向：5'-GTA GTG ATG CCA TGT AAC TGA ATC-3'。多配體蛋白聚糖1引物正向：5'-GGA AAG AGG TGC TGG GAG GG-3'；反向：5'-TTG GTG GGC TTC TGG TAG GC-3'。β-actin引物正向：5'-GGA AAT CGT GCG TGA CAT TAA G-3'；反向：5'-GGA AAT CGT GCG TGA CAT TAA G-3'。通過TRIzol提取液將細(xì)胞中全部乙酰肝素酶mRNA提取出，然后依據(jù)操作手冊實(shí)施RT-PCR。

1.5 Western blot檢測

使用二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）從細(xì)胞中分離出等量的乙酰肝素酶或多配體蛋白聚糖1。將乙酰肝素酶抗體或多配體蛋白聚糖1 抗體和β-actin抗體按1:500比例進(jìn)行稀釋。以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）Western blot檢測系統(tǒng)檢測條帶。

1.6 細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移試驗(yàn)

Transwell侵襲和轉(zhuǎn)移試驗(yàn)的具體實(shí)施方法在之前的文獻(xiàn)[15]中已經(jīng)具體講述過。將小室（8 mm孔隙小格）上層的24個(gè)小格中均勻的加入無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，分別取5×104的GBC-SD細(xì)胞和GBD-SD細(xì)胞放置在小室上層中，每個(gè)小格都加入了瓊脂凝膠。對于轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，上層小室中不加入基質(zhì)膠。含有10%FBS的RPMI-1640加入下層小室作為化學(xué)誘導(dǎo)物。經(jīng)過24 h孵育后，小室上層表面的細(xì)胞被清理掉；而侵襲穿透入基質(zhì)膠膜的細(xì)胞則被多聚甲醛固定下來并被結(jié)晶紫染色。通過在轉(zhuǎn)化顯微鏡200倍視野下每層膜隨機(jī)選擇5個(gè)視野從而將侵襲細(xì)胞的數(shù)目計(jì)算出來。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)及單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組載體與轉(zhuǎn)染率的鑒定

序列檢測結(jié)果顯示DNA載體序列和所設(shè)計(jì)的序列相同。未監(jiān)測到刪除、嵌入或突變。在轉(zhuǎn)染后48 h采用免疫熒光顯象法觀測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的細(xì)胞，重組質(zhì)粒的平均轉(zhuǎn)染率為81.6%。

2.2 乙酰肝素酶表達(dá)量檢測

經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中乙酰肝素酶mRNA和蛋白含量明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中乙酰肝素酶蛋白和mRNA的含量（P＜0.05）（圖1）。

圖1 乙酰肝素酶的表達(dá)量檢測 A：乙酰肝素酶蛋白表達(dá)量檢測；B：乙酰肝素酶mRNA表達(dá)量檢測

2.3 多配體蛋白聚糖1表達(dá)量檢測

經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中多配體蛋白聚糖1蛋白與mRNA含量均明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，RT-PCR結(jié)果定量分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

2.4 細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力檢測

經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)與轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)均明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞（均P＜0.05）（圖3）。

圖2 多配體蛋白聚糖1的表達(dá)量檢測 A：多配體蛋白聚糖1 蛋白表達(dá)量檢測；B：多配體蛋白聚糖1 mRNA表達(dá)量檢測

圖3 細(xì)胞侵襲性和轉(zhuǎn)移能力檢測 A：侵襲的細(xì)胞數(shù)檢測；B：轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)檢測

3 討 論

乙酰肝素酶此前已經(jīng)被廣泛地研究過[16]。有證據(jù)[17-27]表明，乙酰肝素酶對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵的作用。為了證明乙酰肝素酶誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化的能力，本研究采用重組DNA技術(shù)構(gòu)建出乙酰肝素酶基因過表達(dá)的載體，并轉(zhuǎn)染膽囊癌細(xì)胞。結(jié)果顯示，過表達(dá)的乙酰肝素酶降低了多配體蛋白聚糖1 的含量，即多配體蛋白聚糖1蛋白的含量與乙酰肝素酶的含量呈負(fù)向關(guān)系，這與其他相關(guān)的研究結(jié)果基本一致[9,28-29]。

本研究結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞中乙酰肝素酶可以調(diào)低多配體蛋白聚糖1表達(dá)從而增強(qiáng)膽囊癌細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，提示出一種新的乙酰肝素酶增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲性的機(jī)制。盡管乙酰肝素酶和乙酰肝素蛋白黏多糖在腫瘤細(xì)胞中有著多種作用，最重要的一種作用可能是乙酰肝素酶-多配體蛋白聚糖1在腫瘤和其他疾病中的促血管增生作用。HS和VEGF是腫瘤血管形成中重要的調(diào)節(jié)劑。研究[15]結(jié)果表明，乙酰肝素酶可以增加體內(nèi)VEGF的含量，提示乙酰肝素酶和多配體蛋白聚糖1是調(diào)控腫瘤微環(huán)境和促進(jìn)血管增生的重要物質(zhì)。

有越來越多的證據(jù)表明，乙酰肝素酶可以上調(diào)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和血管增生、糖代謝、免疫反映、炎癥和動脈粥樣硬化[30-40]。例如，Nadir等[41]發(fā)現(xiàn)在血管上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中乙酰肝素酶可以誘導(dǎo)組織因子表達(dá)。Yang等[42]發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶可以通過上調(diào)NF-κB配體（RANKL）的受體激動劑在多種骨髓瘤中促進(jìn)系統(tǒng)性骨質(zhì)溶解。在2011年，Ramani等[43]發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶通過促進(jìn)肝細(xì)胞生長因子（HGF）的表達(dá)和活動在促進(jìn)HGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到重要作用。在2012年，Cohen-Kaplan等[44]發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活因子（STAT）的磷酸化。不僅如此，Masola等[45]在2014年報(bào)道了乙酰肝素酶通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）的表達(dá)可以在腎纖維化的過程中起到關(guān)鍵作用。這些研究都表明乙酰肝素酶在細(xì)胞核外可以發(fā)揮功能，并在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程中起到關(guān)鍵作用。多配體蛋白聚糖1，一種黏多糖蛋白，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要的作用，并影響腫瘤的侵襲能力。之前的研究顯示，多配體蛋白聚糖1促進(jìn)骨髓瘤的生長、血管增生和腫瘤的轉(zhuǎn)移[9,12]。

盡管乙酰肝素酶的調(diào)控機(jī)制仍是一個(gè)有極高價(jià)值探討的問題，本項(xiàng)研究的主要結(jié)論是和大多數(shù)腫瘤一樣，在膽囊癌細(xì)胞中，乙酰肝素酶抑制多配體蛋白聚糖1的表達(dá)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性，這提供了一個(gè)新的視野去了解乙酰肝素酶如何激活腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；而乙酰肝素酶抑制劑將有望成為治療腫瘤的新的藥物。