自然發(fā)酵甜面醬中芽孢桿菌的分離、篩選及鑒定

劉達(dá)玉，劉陽(yáng)，鄧靜，楊進(jìn)軍，姜元華*

(1.成都大學(xué) 生物工程學(xué)院，成都 610106；2.四川旅游學(xué)院，成都 610100)

甜面醬是以小麥粉或面粉為主要原料，經(jīng)制曲和保溫發(fā)酵制成的一種醬狀調(diào)味品[1]，其味甜中帶咸，同時(shí)擁有醬香和酯香。甜面醬含有多種風(fēng)味物質(zhì)和豐富的營(yíng)養(yǎng)物，在人們?nèi)粘Ｉ钪惺遣豢苫蛉钡恼{(diào)味品，其在烹飪醬爆和醬燒菜中，具有上色、提鮮、增香的作用；此外，甜面醬還作為黃瓜、大蔥、烤鴨等菜品的蘸料，其味道鮮甜可口，具有增加食欲的功效，深受廣大消費(fèi)者喜愛[2-4]。

甜面醬屬于傳統(tǒng)發(fā)酵醬類制品，其在形成過(guò)程中與微生物活動(dòng)密不可分。目前，甜面醬研究中已研究報(bào)道的有霉菌、酵母菌、細(xì)菌等，其中霉菌主要包括米曲霉、黑曲霉、根霉等，酵母菌主要為假絲酵母、產(chǎn)酯酵母等，細(xì)菌則為芽孢桿菌、乳酸菌等[5-7]。霉菌主要是在甜面醬發(fā)酵的前期發(fā)揮作用，諸如米曲霉、毛霉、根霉和黑曲霉等是制曲階段的主要菌種，其中米曲霉與釀造過(guò)程的快慢、顏色、滋味有直接關(guān)系[8,9]；酵母菌主要是在甜面醬發(fā)酵的第二個(gè)階段起作用，在無(wú)氧環(huán)境下酵母菌通過(guò)EMP途徑將葡萄糖分解最終還原生成乙醇，對(duì)甜面醬的特有香氣有一定的促進(jìn)作用[10]；細(xì)菌在甜面醬發(fā)酵過(guò)程中也至關(guān)重要，醬醅中的乳酸菌可發(fā)酵糖類，進(jìn)行乳糖代謝，對(duì)醬制品風(fēng)味有著重要的貢獻(xiàn)[11]；此外，一些芽孢桿菌在發(fā)酵過(guò)程中可利用淀粉酶、蛋白酶降解的小分子糖類和氨基酸等進(jìn)行生長(zhǎng)，并通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)酸和氨基酸等物質(zhì)，形成了醬類成品的風(fēng)味成分和營(yíng)養(yǎng)成分[12]。

可見，在甜面醬發(fā)酵形成過(guò)程中，各種微生物共同協(xié)作，才使得其營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味香醇?，F(xiàn)階段在甜面醬的研究中，人們對(duì)霉菌和酵母菌進(jìn)行了很多研究，對(duì)細(xì)菌的研究相對(duì)較少，特別是忽略了芽孢桿菌的重要性。芽孢桿菌是一類優(yōu)秀的潛在益生菌，擁有繁殖速度快，產(chǎn)酶性能高，抵抗有害病原菌效果好等優(yōu)點(diǎn)，工業(yè)生產(chǎn)中常用作動(dòng)物微生態(tài)制劑的生產(chǎn)菌種[13-15]。目前，芽孢桿菌在甜面醬發(fā)酵中發(fā)揮的作用有待深度探討，其對(duì)甜面醬形成的風(fēng)味成分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有何種關(guān)系還是未知，因此非常有必要對(duì)甜面醬中的芽孢桿菌進(jìn)行分離、篩選，并對(duì)其相關(guān)特性進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)從成熟的自然發(fā)酵甜面醬中，分離、篩選得到芽孢桿菌，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，從而確定其種屬，為進(jìn)一步探究其在甜面醬發(fā)酵過(guò)程中的作用機(jī)理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料來(lái)源

樣品：成熟的自然發(fā)酵甜面醬，四川自貢仙味源釀造有限公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SHP0201147047型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SM530C型立式壓力蒸汽滅菌器 成都盛德先華科貿(mào)有限公司；BH200型微生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；QYC-2102C型搖床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TGL-16B型臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司；S-3C型pH計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司；S1000型PCR擴(kuò)增儀、Gel Doc 2000型凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)BIO-RAD公司；DY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.1.3 主要試劑

蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖、肌酸、甲基紅試劑、溴甲基酚紫、麥芽糖、乳糖、蔗糖、氫氧化鈉、酵母浸膏、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉、硫代硫酸鈉、草酸銨、結(jié)晶紫、碘化鉀、碘、鹽酸、甘油、甲醛、苯酚、品紅、異戊醇、乙醇、溴化乙錠(EB)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)：購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠。

1.1.4 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏3 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min(液體培養(yǎng)基不加瓊脂即可)。

PCA培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.8～7.2，121 ℃滅菌20 min。

蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g，氯化鈉 2.5 g，水1000 mL，pH 7.4～7.6。

葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，磷酸氫二鉀5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2。

H2S培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，氯化鈉5 g，檸檬酸鈉0.5 g，硫代硫酸鈉0.5 g，瓊脂5～8 g，水1000 mL，pH 7.2。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離

三角瓶中加入99.0 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，再加入1.0 g自然發(fā)酵的甜面醬，置于37 ℃，140 r/min搖床富集培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的菌懸液于85 ℃水浴15 min，用移液槍取1.0 mL菌懸液，以無(wú)菌水按10倍系列梯度稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。分別吸取不同梯度的菌懸液各0.1 mL，無(wú)菌環(huán)境下在牛肉膏蛋白胨平板上涂布分離，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，挑選單菌落純化培養(yǎng)。

1.2.2 芽孢桿菌的篩選

選取單菌落進(jìn)行芽孢染色，挑出產(chǎn)生芽孢的菌落，進(jìn)一步在牛肉膏蛋白胨平板純化培養(yǎng)，并多次于固體培養(yǎng)基中四區(qū)劃線分離，37 ℃培養(yǎng)24 h后，仔細(xì)觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行記錄。確認(rèn)為純培養(yǎng)物后，取菌落的一部分轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中同條件培養(yǎng)24 h，待生長(zhǎng)旺盛后，置于4 ℃冰箱中保藏，每月移種1次，另取生長(zhǎng)旺盛的菌體用甘油懸液保藏法保藏，以備用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

1.2.3.1 菌落形態(tài)觀察

按無(wú)菌操作將各個(gè)菌株接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色、光澤度、透明度等，做好記錄。

1.2.3.2 個(gè)體形態(tài)觀察

芽孢染色：取潔凈的小試管加入0.2 mL無(wú)菌水，加入1～2接種環(huán)的芽孢桿菌的菌苔充分混合得到菌懸液；在菌懸液中加入0.2 mL苯酚品紅溶液，沸水浴加熱3～5 min；接種環(huán)挑取少量菌懸液，在載玻片上涂薄，風(fēng)干，用95%乙醇沖洗載玻片至無(wú)紅色液流出；再用自來(lái)水沖洗，濾紙吸干；吸取少量黑色素溶液于涂片處，均勻涂薄，自然干燥，進(jìn)行油鏡觀察。

按革蘭氏染色法對(duì)各菌株染色，辨別其為陽(yáng)性菌或是陰性菌；并在100倍油鏡下觀察其菌體形態(tài)、大小、有無(wú)芽孢及著生位置等，嚴(yán)謹(jǐn)觀察、描述、拍照、記錄。

1.2.4 生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定

對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行了酶觸反應(yīng)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、明膠液化、檸檬酸鹽的利用實(shí)驗(yàn)，對(duì)已經(jīng)分離出的芽孢桿菌進(jìn)行鑒定，從而確定其生理生化特性。

1.2.5 16S rDNA菌種鑒定

分子鑒定的主要依據(jù)是細(xì)菌的16S rDNA片段，其具有高度的保守性、穩(wěn)定性，可作為分子指標(biāo)，快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定。本研究中DNA的提取參考吉志偉等[16]的方法；PCR擴(kuò)增采用引物27F/1492r對(duì)醋酸菌和乳酸菌的16S rDNA區(qū)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系參考文獻(xiàn)[17]，將結(jié)果送至上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將所測(cè)定菌株的16S rDNA序列同GenBank中已提交的序列進(jìn)行B1ast N分析和同源比對(duì)，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種，進(jìn)一步確定菌株的種屬性質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的篩選

通過(guò)1.2.2的實(shí)驗(yàn)步驟，用標(biāo)準(zhǔn)枯草芽孢桿菌作對(duì)照菌，獲得純種芽孢桿菌共計(jì)13株，分別標(biāo)明為B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13。進(jìn)行芽孢染色之后，將各菌株置于微生物顯微鏡下油鏡觀察，在淡紫灰色背景的襯托下，菌體呈現(xiàn)白色，菌體內(nèi)的芽孢呈現(xiàn)紅色。部分染色照片見圖1(a～c)，由此可初步判斷該13株菌株均為芽孢桿菌(圖片均能清晰觀察，考慮到全部顯示凸顯多余，則以少許圖片為代表表明結(jié)果)。

圖1 芽孢染色(10×100)Fig.1 Spore staining (10×100)

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)分離出的13株細(xì)菌的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察鑒定，其形態(tài)表征結(jié)果見表1。通過(guò)各菌株革蘭氏染色結(jié)果可知，13株菌株均為陽(yáng)性菌。菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)圖片詳見圖2和圖3。由于本實(shí)驗(yàn)菌株圖片太多，選取3種菌株作為代表。

表1 芽孢桿菌形態(tài)描述Table 1 The description of morphology of Bacillus

續(xù) 表

圖2 芽孢桿菌菌落形態(tài)Fig.2 The colony morphology of Bacillus

圖3 芽孢桿菌菌體形態(tài)(10×100)Fig.3 The cell morphology of Bacillus(10×100)

2.3 生理生化鑒定結(jié)果

按照1.2.4的生理生化實(shí)驗(yàn)方法步驟，對(duì)已篩選得到的13株芽孢桿菌進(jìn)行鑒定，各個(gè)實(shí)驗(yàn)鑒定菌株結(jié)果見表2。通過(guò)不同芽孢桿菌對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同，確定生理特性，從而得出菌株的種類。

表2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of physiological and biochemical test

續(xù) 表

注：“+”表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，“-”表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.4 16S rDNA菌種鑒定

根據(jù)1.2.5的方法步驟，篩選到13株芽孢桿菌，并得到各個(gè)菌株的16S rDNA序列，具體各菌株測(cè)序結(jié)果見表3。由于本實(shí)驗(yàn)菌株較多，故選取3種菌株作為代表。將各個(gè)菌株的16S rDNA序列在CNBI基因庫(kù)中進(jìn)行同源性比較，獲得和各菌株序列相似度最高的菌株，即初步認(rèn)定該菌株種類，具體結(jié)果見表4。

表3 16S rDNA基因序列Table 3 The genetic sequence of 16S rDNA

續(xù) 表

表4 16S rDNA菌種鑒定Table 4 The identification of 16S rDNA strain

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用10倍梯度稀釋法涂布平板，從自然發(fā)酵的甜面醬中篩選芽孢桿菌，共計(jì)得到13株菌株，其革蘭氏結(jié)果均為陽(yáng)性。各菌株的單菌落形態(tài)呈圓形，白色，直徑1～5 mm，不透明，邊緣整齊，菌體的顯微形態(tài)多為橢圓或柱狀，芽孢基本分布在細(xì)胞體的中心。通過(guò)對(duì)其進(jìn)行菌落、顯微形態(tài)觀察和16S rDNA片段擴(kuò)增及序列分析技術(shù)分析，最終確定13株菌株中：菌株B2，B4，B5，B6，B7，B8，B11，B12為枯草芽孢桿菌，菌株B3，B10，B13為解淀粉芽孢桿菌，菌株B1為特基拉芽孢桿菌，菌株B9為短小芽孢桿菌。

現(xiàn)階段，芽孢桿菌在甜面醬發(fā)酵中發(fā)揮的作用有待深度探討，其對(duì)甜面醬形成的風(fēng)味成分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有何種關(guān)系還是未知，因此本研究所得菌株可為進(jìn)一步探究其在甜面醬發(fā)酵過(guò)程中的作用機(jī)理奠定重要基礎(chǔ)。