于治凡，劉英華，肖均財，王明偉

1榮成市中醫(yī)院外科，山東 榮成 264300

2湖北省腫瘤醫(yī)院病理科，武漢 430079

甲狀腺癌是一種常見的發(fā)生于頭頸部的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，在女性中發(fā)病尤為突出，越來越引起人們的關(guān)注[1-2]。甲狀腺癌的治療目前仍以外科手術(shù)為主，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。由于中藥材具有安全、不良反應(yīng)輕和藥源豐富等特點，國內(nèi)外學(xué)者們越來越關(guān)注從中藥材中尋找和研發(fā)抗腫瘤藥物。

山慈菇是蘭科植物杜鴉蘭Gremastra appendiculata（D.Don）Makino、獨蒜蘭Pleione bulbocodioides（Franch.）Rolfe或云南獨蒜蘭Pleione yunnanensisRolfe的干燥假鱗莖，含有菲類、苷類、芳香類和糖類等多種化合物，具有解毒消腫的功效[3]。臨床上山慈菇已作為抗腫瘤的中藥，常用于治療乳腺癌、胃癌和結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，山慈菇對甲狀腺癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用[6]，但關(guān)于山慈菇調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的機(jī)制尚不完全清楚。本研究采用不同濃度的山慈菇處理甲狀腺癌SW579細(xì)胞，觀察其對SW579細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并分析B細(xì)胞淋巴瘤因子-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達(dá)情況，探討其分子機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 制備山慈菇提取液

將粉碎的山慈菇用去離子水浸泡2 h，采用水煎法制備提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對水提液進(jìn)行濃縮，得到濃度為1 g/ml的山慈菇提取液。經(jīng)高壓滅菌后，4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ门囵B(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.2 主要試劑和儀器

山慈菇購自武漢生物制品研究所，人甲狀腺癌SW579細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Hyclone公司，噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒和膜聯(lián)蛋白（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡試劑盒均購自美國Invitrogen公司，兔抗Bcl-2抗體、β-actin抗體、羊抗兔二抗均購自美國Santa Cruz公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在RPMI-1640培養(yǎng)基（含100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素和10%胎牛血清）中培養(yǎng)SW579細(xì)胞，置于相對濕度為95%、溫度為37℃、CO2含量為5%的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔2天更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，采用0.25%胰蛋白酶在37℃水浴中消化5 min，然后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）清洗，離心收集細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以細(xì)胞密度（1∶3）～（1∶5）的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞增殖檢測 取上述培養(yǎng)的對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，重懸細(xì)胞液，按每孔1×105個細(xì)胞接種于96孔板上，每孔100 μl，經(jīng)培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，加入不同濃度的山慈菇提取液，使山慈菇終濃度為10、20、40、80、160 mg/ml，同時以只加培養(yǎng)液的處理組為對照組。培養(yǎng)48 h后，加入15 μl MTT（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，加入100 μl二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO），完全溶解后在酶標(biāo)儀490 nm處測每組的吸光值A(chǔ)，計算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=（1－實驗組A/對照組A）×100%。實驗重復(fù)3次。

1.3.3 細(xì)胞凋亡檢測 收集經(jīng)10 mg/ml和20 mg/ml山慈菇處理48 h的SW579細(xì)胞和只加培養(yǎng)液處理48 h的對照組SW579細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，離心收集細(xì)胞。經(jīng)PBS洗滌，加入100 μl結(jié)合緩沖液重懸，使細(xì)胞濃度為1×106/ml。然后分別加入5 μl Annexin V-FITC和2 μl PI，避光處理15 min后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測Bcl-2蛋白表達(dá) 收集經(jīng)10 mg/ml和20 mg/ml山慈菇處理48 h的SW579細(xì)胞，采用RAPI裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），采用 1%牛血清白蛋白（bovine serum albumins，BSA）封閉后加入 Bcl-2和β-actin抗體（1∶1000），過夜后加入羊抗兔二抗（1∶2000），孵育1 h后，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色。以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件計算Bcl-2與β-actin的灰度值之比，即為Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山慈菇對SW579細(xì)胞的增殖抑制作用

MTT檢測結(jié)果顯示，山慈菇濃度為0、10、20、40、80、160 mg/ml時，對SW579細(xì)胞的增殖抑制作用呈先上升后下降的趨勢。山慈菇濃度為0、10、20 mg/ml時，對SW579細(xì)胞的增殖抑制率隨著濃度的增加而提高，且在山慈菇濃度為20 mg/ml時的細(xì)胞增殖抑制率最高；山慈菇濃度為40、80、160 mg/ml時，對SW579細(xì)胞的增殖抑制率隨著濃度的增大而減小。經(jīng)計算，半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為 11.59 mg/ml。（圖 1）

圖1 不同濃度山慈菇提取液作用于SW579細(xì)胞后的增殖抑制率

2.2 山慈菇對SW579細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)10 mg/ml和20 mg/ml山慈菇處理的SW579細(xì)胞的凋亡率分別為（25.56±1.62）%和（58.85±2.26）%，均高于對照組的（8.05±1.05）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2）

圖2 不同組別SW579細(xì)胞的凋亡情況

2.3 山慈菇對Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，經(jīng)10 mg/ml和20 mg/ml山慈菇處理的SW579細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平均低于對照組。（圖3）

圖3 Western blot檢測Bcl-2蛋白表達(dá)情況

3 討論

甲狀腺癌作為內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例占所有惡性腫瘤發(fā)病的1%～5%[7]，已成為發(fā)病率增長最快的實體瘤，其發(fā)病與性別、年齡、家族史等多種因素有關(guān)[8-9]。近年來，有關(guān)甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的研究取得了重大進(jìn)展[10-12]。目前，甲狀腺癌的治療方法主要有手術(shù)、化療、放療以及基因治療，但是這些治療方法都會導(dǎo)致術(shù)后不良反應(yīng)。由于中藥具有不良反應(yīng)輕、有效的特點，中藥抗腫瘤的研究越來越受到學(xué)者們的關(guān)注[13]。

山慈菇在中國為常用的抗腫瘤中藥，可以通過多種分子機(jī)制達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，山慈菇能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。研究報道，山慈菇提取物對結(jié)腸癌HT29細(xì)胞有明顯的促凋亡作用，其機(jī)制可能與上調(diào)Cyt-C、caspase 3、Bax蛋白和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)[4]。研究報道，山慈菇抑制甲狀腺癌SW579細(xì)胞增殖與NIS基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)[15]。Bcl-2是Bcl-2家族中一種重要的抑制細(xì)胞凋亡的因子，它是位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及核膜上的一種內(nèi)膜蛋白，能夠通過抑制鈣離子釋放從而阻止核酸內(nèi)切酶的活化，發(fā)揮抗凋亡作用[16]。

本研究采用不同濃度（10、20、40、80和160 mg/ml）的山慈菇作用于甲狀腺癌SW579細(xì)胞48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山慈菇濃度為0、10、20 mg/ml時，隨著濃度的增加，山慈菇對SW579細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)，具有明顯的濃度依賴性。經(jīng)計算，IC50為11.59 mg/ml。本研究采用10 mg/ml和20 mg/ml的山慈菇進(jìn)行細(xì)胞凋亡實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10 mg/ml和20 mg/ml山慈菇處理48 h后的SW579細(xì)胞的凋亡率分別為（25.56±1.62）%和（58.85±2.26）%，均高于對照組的（8.05±1.05）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot檢測結(jié)果顯示，經(jīng)10 mg/ml和20 mg/ml山慈菇處理48 h的SW579細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平均低于對照組。表明山慈菇提取液的加入下調(diào)了Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。

Bcl-2抗凋亡信號通路通過激活Bcl-2的表達(dá)，減少氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)氧化物的形成，抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì)細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子，抑制促凋亡的Bax/Bak細(xì)胞毒作用。Bcl-2能夠結(jié)合Apaf-1和caspase 9，并維持其非活化狀態(tài)，阻止caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而抑制細(xì)胞凋亡。山慈菇提取液對甲狀腺癌細(xì)胞的促凋亡機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，低濃度的山慈菇提取液對甲狀腺癌細(xì)胞具有增殖抑制作用和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，且其促凋亡機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。