維生素B12對壇紫菜響應高溫脅迫的影響

吳 磊，許 凱，徐 燕，紀德華，王文磊，陳昌生，謝潮添

(集美大學水產學院，福建 廈門 361021)

0 引言

維生素是人類和其他生物所必須的微量營養(yǎng)成分之一，在維持生物的新陳代謝平衡中起著至關重要的作用，是生物多種代謝通路中關鍵酶的輔因子，維生素缺乏時會誘發(fā)一系列疾病的發(fā)生[1]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，B族維生素在藻類的生長發(fā)育中起著重要作用。許多藻類屬B族維生素的營養(yǎng)缺陷型，其中22%的藻類屬維生素B1(thiamine)的營養(yǎng)缺陷型，5%屬維生素B7(biotin)的營養(yǎng)缺陷型，超過50%的藻類屬維生素B12(cobalamin)的營養(yǎng)缺陷型[2]。由于藻類的維生素B12可能來源于其共生細菌，因此維生素B12在細菌與藻類相互作用的研究中越發(fā)受到重視[3]。

維生素B12在自然界中只能由細菌合成，真核生物不能合成B12，該合成過程需要20多種酶的參與。維生素B12是一種水溶性的咕啉類化合物，又稱鈷胺素，在生物體內有多種存在方式，具有重要輔酶功能。目前已知的維生素B12依賴型酶有20多種，如甲基丙二酰輔酶A變位酶(methylmalonyl-coA mutase，MCM)、谷氨酸變位酶(glutamate mutase,GM)、甲硫氨酸合成酶(methionine synthase H,METH)，其中最為重要的就是甲硫氨酸合成酶[4]。甲硫氨酸是20種必須氨基酸之一，在生物的蛋白合成和甲基化中發(fā)揮關鍵作用。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，甲硫氨酸能夠顯著提高萊茵衣藻在25 ℃下的耐熱能力。需要指出的是，一些藻類還存在另一種B12非依賴型甲硫氨酸合成酶METE(B12-independent methionine synthase)，在沒有B12條件下也可合成甲硫氨酸。

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)是我國福建省、浙江省和廣東省廣泛栽培的大型經濟海藻，具有極高的經濟價值和基礎研究價值[6]。近年來，壇紫菜筏式培養(yǎng)初期的高溫回暖天氣造成 “高溫爛菜”頻繁發(fā)生，給壇紫菜養(yǎng)殖戶造成嚴重的經濟損失[7]。謝波等[5]研究發(fā)現(xiàn)，某些B12產生菌在與萊茵衣藻共培養(yǎng)時，能夠顯著提高衣藻的耐熱能力。紫菜等大型海藻中含有較高濃度的維生素B12，與動物肝臟中的濃度相當[8]。而壇紫菜作為真核藻類，自身并不能合成維生素B12，維生素B12的來源至今仍未確認。對壇紫菜的B12是否來源于其共生原核細菌還存有疑問，而維生素B12在壇紫菜應對高溫脅迫時是否發(fā)揮作用仍不清楚。為了評估維生素B12在壇紫菜應對高溫脅迫時的影響和可能發(fā)揮作用的機制，本研究考察了高溫下維生素B12對壇紫菜的生理影響。

1 材料與方法

1.1 藻株來源和高溫處理

實驗選用的壇紫菜品系為Z-61，由集美大學選育。壇紫菜葉狀體的最適培養(yǎng)溫度為21℃，光照強度50 ～ 60 μmol/(m2·s)，光照周期12 L∶12 D，每2天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為營養(yǎng)鹽加富的天然海水，營養(yǎng)鹽濃度參考Provasoli’s enrichment solution (PES)[9]。

取長度為10～15 cm的健康藻體，分別在21 ℃和31 ℃下培養(yǎng)5 d。為了研究維生素B12和甲硫氨酸對高溫脅迫的響應，往培養(yǎng)基中分別添加維生素B12至終質量濃度為10 μg/L和100 μg/L，添加甲硫氨酸至終濃度為1 mmol/L和10 mmol/L。每個處理設置3個生物學重復。

1.2 藻體長度和鮮重

分別在高溫處理的第0天及第5天進行壇紫菜Z-61葉狀體長度測量。用紗布吸干藻體表面水分，測量藻體鮮重。藻體長度和鮮重日生長速率的計算公式與數(shù)據處理方式同參考文獻[10]。

1.3 形態(tài)觀察

為評估高溫脅迫以及維生素B12和甲硫氨酸的作用，對壇紫菜Z-61葉狀體進行形態(tài)觀察。將葉狀體平鋪在標本紙上，對Z-61葉狀體進行拍照。

1.4 最大量子產量

用DIVING-PAM儀(德國，Walz)測量壇紫菜的光化學效率及快速光曲線。葉片經過15 min暗處理后，用微弱的檢測光(0.15 μmol/(m2·s))測量藻體的最小熒光值F0，此時光系統(tǒng)Ⅱ的所有反應中心均處于開放狀態(tài)。然后，給一個0.8 s的飽和脈沖，獲得最大熒光值Fm，此時光系統(tǒng)II的所有反應中心均處于關閉狀態(tài)。最大量子產量(Fv/Fm)的計算公式是：(Fm-F0)/Fm。使用8個不同強度(166，607，1267，1795，2724，3395，4934，6578 μmol/(m2·s))，持續(xù)時間為10 s的光化光來測定快速光響應曲線。相對電子傳遞速率(rETR)計算公式為rETR = yield×0.84×0.5×PAR,其中：yield為光系統(tǒng)Ⅱ的有效光化學效率，0.84代表大約有84%的入射光被植物/藻體所吸收，0.5代表約50%被吸收的光能分配到光系統(tǒng)Ⅱ，PAR則為光化光的強度?？焖俟忭憫€用公式(Jasby and Platt,1976)ETR=ETRmax×tanh (α×PAR/Pmax)擬合，其中：ETRmax為ETR的最大值，PAR則為光化光的強度，α為光限制部分的初始斜率。

1.5 數(shù)據分析

采用單因素方差(one-way ANOVA，LSD)分析不同pH處理的差異，P>0.05代表差異不顯著，具統(tǒng)計意義；P<0.05代表差異顯著，具統(tǒng)計意義。

2 結果

2.1 藻體長度和鮮重

21℃常溫下，壇紫菜葉狀體長度日增加速率ΔL達到(2.77±0.326)cm/d，鮮重平均日增長速率ΔW達到(0.045±0.0052)g/d(見表 1)。而31 ℃高溫脅迫下，葉狀體幾乎停止生長，其長度和鮮重日增加速率分別約為常溫的7%和9%。維生素B12和甲硫氨酸在高溫脅迫下并未促進壇紫菜的生長。

表 1 壇紫菜葉狀體高溫脅迫下長度和鮮重平均日增長速率Tab.1 The length-growth rates and weight-growth rates of P.haitanensis under high temperature stress

2.2 形態(tài)學觀察

在高溫處理第5天時，31 ℃高溫空白對照組已明顯發(fā)生大面積潰爛(見圖1)，而在外源添加維生素B12和甲硫氨酸下的壇紫菜葉狀體并未出現(xiàn)明顯潰爛，但是在維生素B12100 μg/L處理組和甲硫氨酸1 mmol/L處理組已經出現(xiàn)點狀潰爛(見圖1紅色箭頭標注處)。說明維生素B12和甲硫氨酸能夠顯著提高壇紫菜葉狀體的耐熱性。

2.3 光合參數(shù)

通過快速光曲線的測定發(fā)現(xiàn)(見圖2)，在高溫脅迫處理下，各組Fv/Fm均呈下降趨勢；維生素B12處理0～2 d時與對照組相比Fv/Fm并未有明顯變化，在處理3 d時，處理組相較于對照組Fv/Fm顯著下降，10 μg/L組與100 μg/L組Fv/Fm在整個高溫脅迫處理過程中都無顯著差異；甲硫氨酸處理組與維生素B12處理組Fv/Fm變化趨勢整體較為相似，在高溫處理0～2 d時與對照組相比Fv/Fm并未有顯著差異，處理3 d時1 mmol/L組與10 mmol/L 組Fv/Fm均顯著高于對照組，但處理4 d時10 mmol/L組Fv/Fm卻顯著低于對照組，處理5 d時1 mmol/L 組與10 mmol/L組Fv/Fm卻顯著低于對照組。提示維生素B12和甲硫氨酸在提高壇紫菜耐高溫能力中都發(fā)揮了重要作用，但作用方式可能存在不同。

通過快速光曲線的測定發(fā)現(xiàn)(見圖3)，在第0天，維生素B12組、甲硫氨酸組和對照組的曲線幾乎重合，對rETRmax 、Ik和α的影響較小，變化幅度<30%。而高溫脅迫處理3 d后，維生素B12顯著增強了rETRmax，10 μg/L組上升約60%，100 μg/L組上升約30%。而甲硫氨酸顯著降低了rETRmax 、Ik和α，rETRmax降幅在80左右，Ik和α下降約40%。高溫處理5 d后，所有藻體的rETRmax 、Ik和α都大幅度降低。(見表2)。

表2 快速光曲線的3個擬合參數(shù)Tab.2 Three parameters fitted from the rapid light curves

3 討論

高溫是壇紫菜養(yǎng)殖過程中最常見的脅迫之一，高溫脅迫會對壇紫菜的各項生理指標造成影響。在持續(xù)的高溫脅迫下，壇紫菜基本停止生長,長度日平均生長速率在0.1～0.2 cm/d左右，部分潰爛藻體鮮重甚至呈負增長(見表 1)。李兵等[11]研究表明，壇紫菜在高溫30 ℃靜水脅迫下的品質會顯著降低，生長緩慢，光合色素含量、粗蛋白含量、總氨基酸含量會顯著降低。壇紫菜在高溫脅迫下生長受到抑制，隨著高溫脅迫時間的延長，藻體會發(fā)生潰爛。但是在外源添加維生素B12和甲硫氨酸后，藻體并未發(fā)生明顯潰爛(見圖1)，說明維生素B12和甲硫氨酸能夠提高壇紫菜的耐熱性。謝波等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下萊茵衣藻METE基因的表達量會顯著下調，METH基因部分表達；在添加維生素B12后，只有METH基因能夠發(fā)揮作用繼續(xù)合成甲硫氨酸，從而提高衣藻的耐熱能力。

光合作用是植物最重要的生理反應之一，也是對高溫響應最為敏感的生理反應。高溫會對壇紫菜光反應中心造成影響，導致光合色素的含量下降。光合參數(shù)能夠直接反應植物的光合作用。壇紫菜葉狀體在高溫脅迫下各項光合參數(shù)都受到影響(見圖 2)。所有藻體Fv/Fm在高溫處理前2 d時未見明顯下降，2 d后開始下降(見圖 2)。Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，壇紫菜Z-61在29 ℃高溫下培養(yǎng)2 d未見顯著下降，這與本研究結果保持一致。本研究在添加了維生素B12和甲硫氨酸處理2 d后，rETRmax 、Ik和α下降速率會減慢(見圖3)，這提示添加了維生素B12和甲硫氨酸的藻體光合保護能力更強；隨著處理時間的延長(3～5 d)，維生素B12能夠繼續(xù)保護壇紫菜的光合系統(tǒng)，維生素B12處理組的ETR和Fv/Fm的一致性很高，但是添加了甲硫氨酸的藻體在脅迫后期光合參數(shù)下降較快，高濃度甲硫氨酸處理組降低了ETR和Fv/Fm，而低濃度組僅降低了Fv/Fm，且對ETRmax沒有顯著影響。

外源添加維生素B12，一方面可以促進壇紫菜合成甲硫氨酸。甲硫氨酸可參與有關抗逆蛋白的合成或者作為甲基供體參與甲基化來協(xié)助壇紫菜應對脅迫。Giovanelli等[13]研究發(fā)現(xiàn)植物體內的甲硫氨酸有兩種去向，大約20%的甲硫氨酸將用于合成蛋白質參與各種生理活動，剩下80%的甲硫氨酸用于合成生物體內主要的甲基供體S-腺苷甲硫氨酸，用于DNA、RNA和蛋白質等分子的甲基化反應。甲基化在植物應對非生物脅迫時發(fā)揮著重要作用。另一方面，維生素B12也可以調節(jié)某些相關基因的表達來共同應對脅迫。在只添加甲硫氨酸的條件下，通過相關蛋白的合成和甲基化調控可以維持壇紫菜的存活，但是對壇紫菜PSⅡ反應中心的保護不及外源添加維生素B12，維生素B12可能激活了某些抗逆相關基因的表達，保證了光系統(tǒng)的正常運行。在原核生物中，維生素B12可以通過控制核糖開關(Riboswitch)對目標基因的表達進行調節(jié)[14]，但是，藻類中目前仍未發(fā)現(xiàn)與維生素B12相關的核糖開關。綜上所述，維生素B12和甲硫氨酸在壇紫菜應對高溫脅迫時發(fā)揮了重要作用，但作用機理還需要進一步研究。