響應(yīng)面法優(yōu)化垂盆草中總黃酮提取工藝的研究

韓濤　王瑞　馬俊杰　鄭賁　李長江

【摘 要】本文考查垂盆草中總黃酮的溶劑浸提工藝，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用響應(yīng)面（Box-Behnken）設(shè)計方法，對提取時間、溫度、料液比進行優(yōu)化，結(jié)果：提取時間為60 min，以50℃為提取溫度，垂盆草與乙醇（76.8 %）料液比為1：15時，提取垂盆草中總黃酮的工藝最佳，總黃酮得率為17.1814 mg/g。實驗結(jié)果與模型預(yù)測值相符度高。

【關(guān)鍵詞】垂盆草；響應(yīng)面法；總黃酮；提取工藝

中圖分類號： R284.2 文獻標(biāo)識碼： A 文章編號： 2095-2457（2018）15-0026-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.15.012

Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Sedum

Sarmentosum Bunge by Response Surface Methodology

HAN Tao WANG Rui MA Jun-jie ZHENG Ben LI Chang-jiang*

（College of Chemistry and Chemical Engineering， Huangshan University， Anhui， Huangshang， 245041）

【Abstract】To optunize the extraction technology of total flavonoids from Sedum sarmentosum Bunge. The factors such as extraction temperature， material-liquid ratio and ethanol concentration were optimized by response surface methodology. The results show that the Box-Behnken design method is reliable.The highest extraction rate of total flavonoids by extraction could arrive at 17.1814 mg/g using extraction temperature 50 ℃， material-liquid ratio of 1：15， 76.8 % ethanol concentration， and extraction time 60 min， which was agreed with model predictions.

【Key words】Sedum sarmentosum Bunge；Response surface method；Total flavonoids；Extraction process

垂盆草為景天科植物，是一種具有觀賞性的中草藥，收錄在《中國藥典》2015 年版一部，利濕退黃、清熱解毒； 用于治療濕熱黃疸，小便不利，癰腫瘡瘍，急、慢性肝炎等[1]。從化學(xué)成分角度來看，垂盆草主要成分為黃酮類、氨基酸類、糖類、蛋白質(zhì)、三萜類等，研究表明這些化學(xué)組分在臨床應(yīng)用中有較好的生物學(xué)活性，其中垂盆草總黃酮是垂盆草中重要的保肝降酶活性成分之一[2-4]。目前對垂盆草總黃酮的種類、藥理的研究很深入，但在提取工藝方面的研究還不夠深入，目前研究廣泛使用的是正交試驗法[5-8]。本文利用響應(yīng)面設(shè)計方法[9，10]優(yōu)化傳統(tǒng)的溶劑提取工藝參數(shù)，為垂盆草總黃酮類功效成分的開發(fā)利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

垂盆草購自安徽黃山同德仁藥鋪，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自國藥集團，其他試劑均購自阿拉丁試劑網(wǎng)。

UV-2600紫外可見分光光度計（島津儀器蘇州有限公司），F(xiàn)A2104B電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司），XFB-1000中藥粉碎機（中誠制藥機械廠），移液槍（大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配置4mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液（準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品16.00mg，然后加入60%乙醇定容到4mL），分別移取0.75mL，0.5mL，0.25mL和0.025mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，分別用60 %的乙醇溶液將其定容到1mL，配置濃度為3mg/mL，2mg/mL，1mg/mL和0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法[11]，分別吸取0.1mg/mL，1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品各1mL加入10mL的具塞離心管中，各加入5%的NaNO2溶液0.4mL混勻后靜置5min，然后加入10%的Al（NO3）3溶液0.4mL混勻后靜置5min，最后加入4%的NaOH溶液4mL，定容后混勻靜置20min。用60 %的乙醇溶液做參比掃描基線，依次在最大吸收波長504nm（蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長）處下測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，如圖1-1，得出在504nm波長處測定吸光度，以樣品濃度對吸光度進行線性回歸，得到吸光度與濃度的回歸方程為y=1.0701x+0.0003，R=0.9989。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，蘆丁對照品濃度在0～3mg/mL之間時與吸光度成較好的線性關(guān)系。

1.2.2 垂盆草總黃酮的提取和含量的測定

用電子天平準(zhǔn)確稱取粉碎后的垂盆草2.0000g，稱取5份，分別倒入50 mL 的錐形瓶中，用不同濃度的乙醇溶液，在不同的溫度下，按照一定的料液比進行提取，提取結(jié)束后靜置離心，取清澈提取液，然后進行如 1.2.1 的顯色處理后測得吸光度，代入回歸方程，計算出總黃酮的提取率。

2 響應(yīng)面設(shè)計實驗結(jié)果及分析

2.1 試驗設(shè)計

依照中心組合設(shè)計規(guī)律，綜合響應(yīng)面分析方法，考慮單因素篩選實驗結(jié)果。以提取溫度（A），料液比（B），乙醇濃度（C）三個因素為自變量，以–1、0、1分別代表自變量的低、中、高水平，按方程X1=（χ1-60）/10、X2=（χ2-20）/5、X3=（χ3-70）/20對自變量進行編碼，以總黃酮的提取量為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平共17個實驗點的響應(yīng)面分析實驗，因子編碼及水平見表2-1。

2.2 二次響應(yīng)面回歸模型的建立

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件設(shè)計試驗條件，采用Box-Behnken模型[12]，對表2-2的結(jié)果進行擬合，得到總黃酮的提取量對提取溫度（A），料液比（B），乙醇濃度（C）的二次多項回歸方程模型：

Y=14.19+0.31A-0.49B+1.47C-O.41AB-0.36AC-0.27BC+0.63A2+0.59B2-1.34C2 （i）

2.3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析

再次檢驗回歸方程的可靠性，進一步確定因素A，B，C對總黃酮提取量的影響程度，對回歸模型進行了方差分析，結(jié)果見表3-3。

觀察模型的F=13.26，P<0.001，差異顯著，即對總黃酮提取量的影響較為顯著?？梢钥闯鲈摂M合方程各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系能與回歸方程很好擬合。把A，B，C帶入回歸方程模型，可以看到回歸系數(shù)p值均小于0.05。提取溫度、料液比和乙醇濃度均對提取總黃酮量有影響。

2.4 響應(yīng)面分析

繪制響應(yīng)面立體分析圖及等高線是把因素A，B，C帶入Design-Expert軟件依據(jù)回歸方程（i），觀察擬合響應(yīng)曲面的形狀，結(jié)合提取條件對垂盆草總黃酮提取量的影響。分析響應(yīng)面的情況。

我們知道因素的改變對響應(yīng)值影響很大，觀察響應(yīng)曲面坡度，可以看出坡度越陡，影響越明顯。而因素的改變越小，則響應(yīng)面曲線越平緩 。從圖2-1～2-3可以看出各顯著性影響因素交互作用對響應(yīng)值的影響，提取時間和料液比交互作用曲面如果越陡，表明對總黃酮提取量交互作用越明顯，反之，交互作用曲面越緩，表明對總黃酮提取量交互作用越不明顯。

2.5 最優(yōu)條件的確定

為確定各因素的最佳取值，利用Design-Expert軟件中的Optimization的Numerical功能，在模型濃度范圍內(nèi)選擇最低點為出發(fā)點，使用最大值優(yōu)化，得提取垂盆草總黃酮的理論工藝：在提取時間60min下，反應(yīng)溫度為50℃，垂本草和溶劑比為1：15，乙醇濃度為76.8%，得到的總黃酮的量為17.1814mg/g。為驗證響應(yīng)面法的可行性，采用修正的最佳提取工藝：垂本草和溶劑比為1：15，在提取時間60min，反應(yīng)溫度為50 ℃，乙醇濃度為75%的條件下進行優(yōu)化實驗，實驗結(jié)果如表2-4。

從表中可以得出，該優(yōu)化條件三次提取平均值偏差為1.05 %比理論值3 %小，說明實驗值與理論值有較好的擬合性。

3 結(jié)論

本實驗以垂盆草為原料，打磨成粉，溶劑浸提。由于黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)特征，采用乙醇為溶劑進行提。由實驗結(jié)果可知，在提取溫度為30℃-50℃范圍內(nèi)，溫度升高可以加快提取總黃酮的速率，但溫度超過50℃時，苷鍵水解和細胞內(nèi)色素的溶出會影響總黃酮的提取速率。適合的料液比可以有效地溶解總黃酮，而且不會造成浪費。本實驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取總黃酮的反應(yīng)條件，優(yōu)化結(jié)果與試驗較接近，說明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化提取垂盆草中總黃酮的方法是可靠的。

通過響應(yīng)面分析，得到用乙醇為溶劑提取垂盆草總黃酮的最佳工藝：為垂本草與溶劑比為1：15提取時間60min，提取溫度為50℃，乙醇濃度76.8%，的條件下所提取的總黃酮含量為17.1814mg/g。與單因素提取相比較，采用響應(yīng)面法可以更有效的提取總黃酮，對垂盆草的研究開發(fā)具有重要意義。

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