馮旭，許恩師

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 錦州 121001)

隨著社會的不斷發(fā)展，目前缺血性腦血管病已經(jīng)成為危害人類健康最常見的一種疾病，其主要的病理基礎為動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成，目前大量的臨床實驗及研究證實，AS在血管壁形成的主要原因為，富含脂類的泡沫不斷聚集而產生[1]。其中巨噬細胞源性泡沫細胞的形成原因是由于氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)在細胞內的不斷蓄積而產生[2]。

近年來，為了研究新型改善血脂類藥物，人們將關注點集中在血漿脂蛋白代謝過程中的兩個關鍵步驟中： 其一為ox-LDL參與的泡沫細胞的形成，其二為與高密度脂蛋白代謝密切相關的細胞中膽固醇逆向轉運(RCT)的相關信號靶點。

丹酚酸B屬于酚酸類化合物，作為丹參的重要藥理學活性水溶性組成成分，被廣泛認為具有抗氧化活性，包含預防LDL氧化作用以及對脂質過氧化的作用[3]。ATP 結合盒轉運體G1(ABCG1 )目前已知的主要作用是促進細胞內膽固醇流出到成熟高密度脂蛋白粒子上，同時與其他轉運載體相互作用，促進膽固醇逆轉運。ABCG1的重要功能除了能移除體內過多含量的膽固醇，并且可以參與炎癥抑制，因此ABCG1作為重要的靶點，用于抑制動脈粥樣硬化發(fā)展的研究過程[4]。

現(xiàn)有的臨床研究中，未發(fā)現(xiàn)丹酚酸B對巨噬細胞中ABCG1 mRNA表達的相關報道，此次實驗擬通過觀察丹酚酸B對人單核源性巨噬細胞泡沫化的影響，通過RT-PCR 檢測ABCG1 mRNA的表達，從而將ABCG1這一重要靶點引入泡沫細胞內膽固醇代謝的研究中。

1 材料與方法

1.1 主要藥品、試劑及儀器

THP-1單核巨噬細胞株，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)(北京協(xié)生細胞生物學研究所)，佛波酯(PMA)，RPMI-1640培養(yǎng)基，油紅0(Sigma公司)；淋巴細胞分離液(上海山進生物科技有限公司)，逆轉錄試劑盒，實時熒光定量RT-PCR試劑盒(瑞士Roche公司)；CO2培養(yǎng)箱(上海杰涵實驗設備有限公司)，實時定量PCR 儀(ABI 公司)，丹酚酸B(中國藥品生物制品檢定所，純度為97.2%)，其它試劑均為進口或國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗中泡沫細胞的培養(yǎng)及實驗方法分組

首先將THP-1細胞放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，細胞的生活環(huán)境為10%的小牛血清、其中加入1×108U/L青霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。在每次實驗開始前，首先分化THP-1細胞，方法為采用150 nmol/L佛波酯加入細胞培養(yǎng)基中24 h，此過程可以使THP-1細胞轉化為巨噬細胞，之后加入ox-LDL，將濃度調整為100 mg/L時，泡沫細胞形態(tài)及活性良好。將實驗細胞在每次實驗開始時分別加在6孔培養(yǎng)板中，每孔的密度平均分配。先以100 μmol/L 丹酚酸B加入實驗細胞中,分別在8、16、24 h收集細胞，提取每個實驗組中的mRNA，根據(jù)檢測結果選擇16 h處理時間；再分別以不同濃度丹酚酸B加入巨噬細胞中，進行實驗檢測數(shù)據(jù)。每組設置5個重復，每次試驗獨立重復5次。

1.2.2 油紅O對于泡沫細胞的染色和實驗組脂質染色的半定量分析

細胞經(jīng)上述方法處理后，用PBS將泡沫細胞反復沖冼，將其放置在4 ℃的環(huán)境中，加入10%的甲醛，放置10 min，固定細胞，用油紅O方法進行細胞染色：水冼 5 min,放置在60%的異丙醇中5 min,放置在新鮮過濾的油紅O中染色10 min 60%異丙醇分5 min，水冼5 min,采用明礬染液染色細胞5 min，分色及反藍巨噬泡沫，水洗細胞5 min，然后進行照相比對。Wada方法[5]進行半定量分析細胞內脂類含量。如果被染色劑染成紅色的細胞脂類成分面積小于細胞核的面積，可以將該類細胞標記為陰性細胞,相反，被染色劑染成紅色的脂類成分面積等于或大于細胞核的面積則可以將這類細胞標記為陽性細胞。每個實驗組孔隨機計數(shù)一個視野(×400)的細胞。

1.2.3 高效液相色譜法分析細胞內脂類含量

參照peat J的實驗方法，對于實驗細胞組分的膽固醇含量進行高效液相色譜測定[6]，膽固醇數(shù)量值用外標法峰面積進行定性定量測定。C18為色譜柱，流動相：異丙醇∶正庚烷∶乙腈的比值設定為35∶12∶52，單位為v/v，采用非梯度洗脫；實驗流速為1 mL/min；檢測波長設定為210 nm，檢測到第8分鐘；柱溫設定為20 ℃。使用已知的CE酶水解CE得到總膽固醇(TC)量,以TC-FC量代表膽固醇酯(CE)的量。

1.2.4 熒光實時定量(RT-PCR)

將實驗組及對照組細胞處理完畢，按照說明書的方法提取RNA，使用電泳方法檢測RNA的完整性，使用核酸蛋白檢測儀檢測測定RNA 溶液的濃度和純度。公司預先設定好引物基因，使用兩步法擴增mRNA，按公司提供的引物序列進行RT-PCR反應，擴增采用20 μL體系，每個樣品設5 個重復。

1.2.5 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 細胞泡沫化模型的建立

將ox-LDL加入THP-1單核巨噬細胞24 min后,應用油紅O染色半定量分析結果顯示：正常對照組中，細胞中脂類無紅染現(xiàn)象，在ox-LDL誘導組中,經(jīng)油紅O染色后，陽性細胞滿布于視野中。使用半定量方法測定經(jīng)過油紅O處理的陽性細胞數(shù)量可以看出(表1)，陽性細胞比率由(8.35±1.20)%增加到(83.7±0.78)%，比例提高約10倍，說明此種方法處理的巨噬細胞泡沫化效果明顯。

表1 不同濃度丹酚酸B處理16 h后油紅O染色陽性細胞的相對含量

注：與對照組相比：#P<0.01；與ox-LDL組相比：■P<0.01

2.2 丹酚酸B處理泡沫細胞后，CE/TC值的量-效關系

應用不同濃度丹酚酸B處理泡沫細胞后，油紅O染色陽性細胞的數(shù)量比例明顯減少，當濃度在100 μmol/L時，陽性細胞比例接近正常細胞(表1)。HPLC檢測結果顯示，CE/TC值隨著丹酚酸B濃度的增加而降低(表2，■P<0.01)，說明丹酚酸B處理泡沫細胞后減少膽固醇酯在細胞內聚集，有效抑制THP-1巨噬細胞泡沫化。

表2 不同濃度丹酚酸B處理16 h后細胞中

注：與對照組相比：#P<0.01；與ox-LDL組相比：■P<0.01

2.3 丹酚酸B對ABCG1 mRNA 表達的影響

前期實驗確定16 h為ABCG1 mRNA 表達的最佳時間，將此時間設定為處理時間。選擇不同濃度的丹酚酸B(詳見實驗組)干預泡沫化的THP-1 細胞16 h，可見ABCG1 mRNA 表達水平隨丹酚酸B濃度增加而升高，其中100 μmol/L 丹酚酸B處理組為0 μmol/L 丹酚酸B的2.12倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

目前對于AS形成的研究中，有兩種理論最為盛行。其中之一“損傷反應”理論認為，AS的形成過程中最開使發(fā)生的為血管內皮的損傷，內皮損傷后，單核細胞以及以LDL為主的循環(huán)脂蛋白順著破損的內膜間隙開始遷移，這些作用導致單核細胞源巨噬細胞不斷攝入修飾的LDL，最終導致巨噬細胞的泡沫化[7 -8]。另一種“滯留反應”理論認為，LDL首先遷移到內膜間隙，通過與蛋白多糖結合形成大分子，滯留在內膜間隙中并被修飾，接著被巨噬細胞攝取，進而引起巨噬細胞的泡沫化[9]。本實驗在體外模擬泡沫細胞的形成過程，用ox-LDL處理巨噬細胞，當培養(yǎng)瓶2濃度調整100 mg/L時，巨噬細胞泡沫化最為高效，泡沫化率接近95%。

ABCG1 為跨膜蛋白，是ATP 結合盒轉運體(ATP binding cassette transporter，ABC)超家族中的重要一員，ABCG1消耗ATP完成介導蛋白質、膽固醇、磷脂等多種物質的跨膜轉運。有研究表明，ABCG1主要作用為使膽固醇流出到成熟的高密度脂蛋白粒子上，促進膽固醇的逆轉運。在巨噬細胞中，ABCG1的表達可以防止脂質的過量累積，從而具有防止動脈粥樣硬化的作用[10]。目前有關報道提出，巨噬細胞中的ABCG1通過多種機制促進細胞內的膽固醇轉運至細胞外，還可以加強細胞內高密度脂蛋白的表達，對于細胞內的炎癥反應及趨化作用起到積極的抑制作用，從而達到防止動脈粥樣硬化的作用[11]。ABCG1 在細胞內的多種作用可以將炎癥反應和脂類物質的代聯(lián)系在一起。本研究顯示，100 μmol/L 丹酚酸B處理THP-1 細胞16 h 顯著增加了ABCG1 mRNA 的表達，使得丹酚酸B在 抑制AS 和炎癥相關疾病的機制得以補充。

丹酚酸B作為重要的酚酸類化合物，為丹參的主要藥理學活性組成成分，并具有良好的水溶性[12]。目前注射用丹參多酚酸鹽已在臨床上被廣泛應用，尤其在治療缺血性腦血管疾病的治療中尤為重要，丹酚酸B鎂鹽在其中扮演重要角色[13]。本實驗首先建立泡沫巨噬細胞模型，然后使用不同濃度的丹酚酸B對實驗組泡沫細胞進行干預。實驗結果顯示，丹酚酸B處理泡沫細胞后，細胞內紅染細胞成分及細胞內CE/TC值隨著丹酚酸B濃度的增加而降低(P<0.01)，說明丹酚酸B可有效抑制巨噬細胞的泡沫化，促進膽固醇向細胞外流出。100 μmol/L 丹酚酸B處理泡沫細胞16 h后，顯著增加了ABCG1 mRNA 的表達，提示這可能為丹酚酸B抗AS的一個新的作用機制，進一步豐富了丹酚酸B在抗動脈粥樣硬化過程中的作用。綜上所述，丹酚酸B的抗動脈粥樣硬化作用除已知的調脂作用外，與其通過上調ABCG1表達，降低巨噬細胞攝取膽固醇，抑制巨噬細胞泡沫化有關。本研究的后續(xù)工作將從分子水平對丹酚酸B抗動脈粥樣硬化和抑制細胞泡沫化的機制進行深入探討。