王潔,任錫亮,黃蕓萍,安學(xué)君,高天一,孟秋峰
(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江寧波315040)
榨菜(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee),學(xué)名莖瘤芥,因其莖在發(fā)育過程中膨大并呈瘤狀凸起,在加工腌制成產(chǎn)品的過程中有壓榨的工藝,所以通常被俗稱為榨菜。榨菜是起源于我國(guó)的一個(gè)芥菜變種,屬于十字花科蕓薹屬[1]。榨菜是我國(guó)重要的對(duì)外出口產(chǎn)品,平均每年出口約20萬t,其營(yíng)養(yǎng)豐富,加工后味道獨(dú)特、脆嫩爽口,與日本醬菜、歐洲酸菜并稱為世界三大名腌菜,深受消費(fèi)者喜愛[2]。
植物雄性不育是指雄性生殖器官無法產(chǎn)生正常功能的花藥、花粉或雄配子的一種遺傳現(xiàn)象,在被子植物中普遍存在。細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)受細(xì)胞核基因、細(xì)胞質(zhì)基因和正常代謝的共同控制,具有相應(yīng)的保持系和恢復(fù)系,在生產(chǎn)上應(yīng)用價(jià)值巨大[3]。蕓薹屬作物擁有豐富的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型,并在大白菜、甘藍(lán)、油菜和芥菜等作物上得到了廣泛應(yīng)用。目前,已經(jīng)公開報(bào)道的不育系主要有ogu CMS[4]、nap CMS[5]、tour CMS[6]、pol CMS[7]、hau CMS[8]、orf220 CMS[9-10]等。這些起源不同的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在性狀表現(xiàn)、不育機(jī)制等方面均存在較大差異,因此,從細(xì)胞生物學(xué)的角度系統(tǒng)研究不同類型胞質(zhì)雄性不育系的不育機(jī)制,將為育種工作者更為有效利用這些胞質(zhì)不育源提供重要的參考。
歐新A是史華清等[11]在芥菜型油菜中發(fā)現(xiàn)并選育成的雄性不育材料,不育株率達(dá)100%,不育性世代穩(wěn)定。范永紅等[12]將歐新A不育胞質(zhì)轉(zhuǎn)育到冬榨菜中,育成了多個(gè)榨菜胞質(zhì)雄性不育系。目前,該雄性不育系的分子機(jī)制和不育機(jī)制尚不清楚。前期,我們以冬榨菜歐新A雄性不育系為不育源,育成了不育性狀穩(wěn)定、綜合性狀良好的春榨菜雄性不育系09-05A,并利用該不育系成功培育出了雜交品種。本研究通過對(duì)春榨菜雄性不育系09-05A不同發(fā)育時(shí)期的花藥和花粉進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察,探索花粉敗育的發(fā)生時(shí)期和細(xì)胞學(xué)特征,為春榨菜雄性不育的雜種優(yōu)勢(shì)利用和雄性不育的發(fā)育機(jī)制研究提供理論依據(jù)。
榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-05A及其保持系于2016年10月種植在浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所生產(chǎn)基地,在正常條件下進(jìn)行栽培管理。次年4月,于盛花期取09-05A不育系和保持系的花序進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生活力測(cè)定。
采集剛開放的花朵,抖動(dòng)花藥使花粉粒散落在貼有雙面膠的金屬載物臺(tái)上,并用牙簽輕輕地將花粉粒涂布均勻,在Eiko IB5離子噴射義中噴鍍金粉4~5 min,之后在Hitachi Model TM-1000型掃描電鏡下觀察花粉粒形態(tài)。
將2 mg乙酸熒光素(fluorescein diacetate,FDA)溶于1 mL丙酮中作為母液,儲(chǔ)存在-20℃冰箱中備用。使用前,將FDA母液用0.5 mol/L蔗糖溶液稀釋至0.01%。在載玻片上滴一滴FDA染色液,取剛開放的花朵,用鑷子抖動(dòng)花藥,使花粉粒散落在染色液中,蓋上蓋玻片,趕走氣泡,于室溫、黑暗中放置30 min后,在短藍(lán)光激發(fā)的顯微鏡(DMLB,徠卡,德國(guó))下拍照觀察。
在載玻片上滴1滴1 μg/L的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染液,取剛開放的花朵,抖動(dòng)花藥使花粉粒散落在染色液中,蓋上蓋玻片,趕走氣泡,于室溫、黑暗中放置30 min后,于紫外燈激發(fā)的顯微鏡(DMLB,徠卡,德國(guó))下拍照觀察。
參照王潔[13]的方法,將樣品進(jìn)行包埋處理,用半薄切片機(jī)(LKB 11800)切片,獲得厚度為100 nm的樹脂切片,在載玻片上滴1滴蒸餾水,將樹脂切片放入水滴中,于85℃條件下在REICHERT-JUNG HK120展片機(jī)上展片。將切片用1%亞甲基藍(lán)染色后在顯微鏡(DMLB,徠卡,德國(guó))下觀察拍照。
將包埋好的小孢子樣品在Richard超薄切片機(jī)中切片,獲得厚度為50 nm的樹脂切片。用具有Fovara膜的銅鎳載網(wǎng)撈片,然后用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色液各染色15 min,干燥后于Hitachi ModelH-7650型透射電鏡下觀察拍照。
前期,我們首次將歐新A不育源轉(zhuǎn)育到春榨菜中,經(jīng)多代回交,成功培育了春榨菜雄性不育系09-05A,該不育系與冬榨菜歐新A不育系在葉片形狀、株高、瘤狀莖大小、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期等方面存在明顯差異(表1)。
對(duì)不育系09-05A及其保持系(Ma)的花蕾和開放花的花器官形態(tài)進(jìn)行觀察(圖1)發(fā)現(xiàn),不育系09-05A在蕾期(開花前5~7 d)表現(xiàn)出明顯的花柱外露現(xiàn)象(圖1E、F),開放花花冠整體較?。▓D1G),花藥狹長(zhǎng)干癟(圖1H、J、K)等特點(diǎn)。分別將09-05A及其保持系的花柱和雄蕊進(jìn)行剝離并比較其長(zhǎng)度發(fā)現(xiàn),09-05A與其保持系(Ma)相比花柱較長(zhǎng)(圖1I),且雄蕊較短(圖1J、K)。
表1 雄性不育系09-05A與冬榨菜歐新A主要農(nóng)藝性狀比較Table 1 Comparison of main agronomic traits between cytoplasmic male sterility system(CMS)09-05A and oxa A transferred in winter stem mustard
圖1 花器官形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphological observation of flower organs
對(duì)不育系09-05A及其保持系成熟花粉粒進(jìn)行掃描電鏡觀察(圖2)發(fā)現(xiàn),不育系09-05A花粉粒形態(tài)異常,萌發(fā)溝塌陷。利用FDA對(duì)成熟花粉粒進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn):保持系的花粉粒在藍(lán)光激發(fā)下能夠發(fā)出熒光(圖3A、C),花粉粒表現(xiàn)出具有生活力;而不育系09-05A的花粉粒在藍(lán)光激發(fā)下未能檢測(cè)到熒光信號(hào)(圖3E、G),花粉粒沒有生活力。利用DAPI對(duì)成熟花粉粒進(jìn)行染色,可以清楚地看到保持系成熟花粉粒細(xì)胞的3個(gè)細(xì)胞核(圖4A),而在不育系09-05A中未觀察到花粉粒細(xì)胞核熒光信號(hào)(圖4C)。
圖2 花粉粒掃描電鏡觀察Fig.2 Scanning electron microscopy(SEM)observation of pollen grains
圖3 花粉粒生活力觀察Fig.3 Observation on viability of pollen grains
圖4 花粉粒細(xì)胞核DAPI染色觀察Fig.4 DAPI staining observation of pollen grain nucleus
為了進(jìn)一步明確不育系09-05A花粉敗育的發(fā)生時(shí)期,本研究參照擬南芥不同花藥發(fā)育時(shí)期劃分標(biāo)準(zhǔn)[14],觀察了不同發(fā)育時(shí)期09-05A的花藥橫切半薄切片。結(jié)果表明:保持系和不育系都能正常形成四分體(圖5A、F);保持系小孢子從四分體中釋放出來后,形成形狀不規(guī)則、無細(xì)胞壁的單核細(xì)胞(圖5B);隨著花粉發(fā)育進(jìn)程的進(jìn)行,保持系小孢子細(xì)胞內(nèi)逐漸產(chǎn)生一些液泡,細(xì)胞壁開始形成,最終形成圓形、細(xì)胞核靠邊、擁有大液泡的單核細(xì)胞(圖5C、D);類似REGAN等的研究[15],隨后小孢子對(duì)液泡進(jìn)行再吸收,緊接著進(jìn)行第一次有絲分裂(圖5E);小孢子經(jīng)過2次有絲分裂之后形成擁有3個(gè)細(xì)胞核的細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。不育系09-05A的小孢子同樣能夠從四分體中正常釋放出來,形成形狀不規(guī)則、無細(xì)胞壁的單核細(xì)胞(圖5G);然而,隨著小孢子液泡化程度的進(jìn)行,不育系09-05A的花藥室內(nèi)逐漸開始出現(xiàn)異常形態(tài)的小孢子,這些小孢子不能被二甲基藍(lán)染料正常著色,細(xì)胞內(nèi)的部分內(nèi)含物丟失(圖5H、I);當(dāng)小孢子發(fā)育至有絲分裂時(shí)期時(shí),不育系09-05A花藥室內(nèi)異常形態(tài)的小孢子達(dá)到100%(圖5J)。
圖5 花藥橫切面觀察Fig.5 Transverse section observation of anthers
進(jìn)一步利用超薄透射電鏡對(duì)小孢子橫切面進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn):在小孢子液泡化早期,保持系小孢子細(xì)胞核及各類細(xì)胞器清晰可見,液泡開始出現(xiàn)并散落在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),細(xì)胞壁和表面覆蓋物已形成(圖6A);隨著小孢子進(jìn)入液泡化時(shí)期,液泡數(shù)量變少,體積變大,一個(gè)大液泡明顯清晰地分布在細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核被液泡擠至細(xì)胞邊緣(圖6C);隨后,小孢子進(jìn)入有絲分裂時(shí)期,大液泡消失(圖6E)。不育系09-05A的小孢子在液泡化早期細(xì)胞壁和表面覆蓋物發(fā)育完全,萌發(fā)溝正常,但細(xì)胞質(zhì)逐漸開始出現(xiàn)異常,表現(xiàn)為液泡體積不斷增大,細(xì)胞核、細(xì)胞器等細(xì)胞內(nèi)含物逐漸降解(圖6B、D);當(dāng)小孢子發(fā)育進(jìn)入有絲分裂時(shí)期,小孢子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞器等內(nèi)含物基本完全降解,只剩下殘留的碎片,細(xì)胞壁覆蓋物脫落,萌發(fā)溝處發(fā)生不正常內(nèi)陷和折疊,細(xì)胞成空癟、畸形狀態(tài)(圖6F)。
細(xì)胞質(zhì)雄性不育是廣泛存在于高等植物中的母性遺傳現(xiàn)象,是核基因、細(xì)胞器基因和生長(zhǎng)代謝等因素綜合作用的結(jié)果。其中,核基因起主要作用,線粒體在腺苷三磷酸(ATP)供應(yīng)、電子傳遞、蛋白質(zhì)翻譯等代謝過程中起著至關(guān)重要的作用[16]。研究表明,基于線粒體特異基因的分子標(biāo)記是鑒定不同類型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的一種有效手段[17]。HENG等[18]根據(jù)目前已報(bào)道的十字花科作物雄性不育系不育基因的保守序列設(shè)計(jì)線粒體特異基因分子標(biāo)記,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)發(fā)現(xiàn),在冬榨菜歐新A不育系及其保持系中未檢測(cè)到這些細(xì)胞質(zhì)特異性分子標(biāo)記,表明歐新A不育系與其他報(bào)道的十字花科細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(包括ogu CMS、nap CMS、tour CMS、pol CMS、hau CMS、Moricandia arvensis CMS、orf220 CMS)不同,是一種新型的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型。
圖6 小孢子橫切面觀察Fig.6 Transverse section observation of microspores
花粉敗育是細(xì)胞質(zhì)雄性不育的主要表現(xiàn)型,不同類型的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系其花藥發(fā)育的敗育時(shí)期和特征也各不相同。研究發(fā)現(xiàn),ogu CMS花粉敗育發(fā)生在小孢子四分體至單核花粉期,不育系的絨氈層細(xì)胞畸形,表明其敗育與絨氈層的不正常發(fā)育有關(guān)[19]。胡永敏等[20]對(duì)多種甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),pol和nap CMS小孢子敗育時(shí)期為孢原細(xì)胞時(shí)期,不能進(jìn)行造孢細(xì)胞和壁細(xì)胞的分化。鄒瑞昌等[21]將油菜hau CMS轉(zhuǎn)育到葉用芥菜中研究發(fā)現(xiàn):不育系花藥發(fā)育部分受阻于孢原細(xì)胞分化期,不能正常行成花粉囊;部分受阻于花粉母細(xì)胞時(shí)期至單核小孢子時(shí)期,花粉母細(xì)胞雖能正常進(jìn)行減數(shù)分裂,但發(fā)育到四分體時(shí)期或單核時(shí)期時(shí)細(xì)胞解體。HENG等[18]研究發(fā)現(xiàn),將油菜歐新A雄性不育系轉(zhuǎn)育至冬榨菜,不育系花粉敗育發(fā)生在單核細(xì)胞晚期,小孢子呈現(xiàn)液泡化,至花粉成熟時(shí)期,導(dǎo)致花粉完全敗育。以上研究表明,在不同遺傳背景下不同CMS花藥在發(fā)育過程中表現(xiàn)的敗育時(shí)期和細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)不同。
研究表明,相同不育源轉(zhuǎn)育到不同物種中,CMS表現(xiàn)型會(huì)表現(xiàn)出差異[22]。本研究通過對(duì)春榨菜雄性不育系09-05A的花器官進(jìn)行形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),該不育系表現(xiàn)出的柱頭蕾期外露、雄蕊顯著縮短等生物學(xué)性狀與冬榨菜歐新A雄性不育系[18]基本相同。通過對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的花藥和小孢子橫切面觀察和進(jìn)一步深入分析發(fā)現(xiàn):春榨菜雄性不育系09-05A花粉發(fā)育從單核小孢子中期(即小孢子液泡化早期)開始出現(xiàn)紊亂,稍早于冬榨菜歐新A雄性不育系花粉敗育時(shí)期(單核小孢子晚期);隨著花粉發(fā)育的進(jìn)行,不育系09-05A小孢子液泡化程度增加,同時(shí)細(xì)胞核、細(xì)胞器等物質(zhì)逐漸降解,至小孢子有絲分裂時(shí)期,已表現(xiàn)出100%的畸形和空癟,花粉敗育持續(xù)時(shí)間略短于冬榨菜歐新A雄性不育系。以上差異可能與物種間不同生態(tài)類型差異有關(guān)。
本研究通過對(duì)春榨菜雄性不育系09-05A的花器官進(jìn)行形態(tài)觀察、花粉育性進(jìn)行鑒定及不同發(fā)育時(shí)期的花藥和小孢子橫切面進(jìn)行深入分析研究發(fā)現(xiàn):不育系09-05A的花器官表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)性異常,主要表現(xiàn)為蕾期花柱外露,雄蕊縮短;花粉粒沒有生活力,高度不育;花粉發(fā)育在小孢子液泡化早期開始出現(xiàn)紊亂,至花粉有絲分裂時(shí)期表現(xiàn)出100%敗育,細(xì)胞呈現(xiàn)出畸形、空癟、不完整等表現(xiàn)型。結(jié)合細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果,推測(cè)小孢子細(xì)胞非正常液泡化是導(dǎo)致花粉敗育的原因。與冬榨菜歐新A雄性不育系花藥發(fā)育過程中表現(xiàn)的敗育時(shí)期和細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),二者在花粉敗育時(shí)期和過程等方面略有不同,說明同一不育源轉(zhuǎn)育至不同生態(tài)類型品種的雄性不育系細(xì)胞學(xué)特性可能會(huì)產(chǎn)生一定的差異。本研究為深入進(jìn)行榨菜雄性不育的發(fā)育機(jī)制研究和春榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的雜種優(yōu)勢(shì)利用奠定了一定的基礎(chǔ),還有待進(jìn)一步深入進(jìn)行相關(guān)不育基因的鑒定和研究。
致謝 重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供了“榨菜歐新A”不育源,并對(duì)本科研工作予以了大力支持,謹(jǐn)致謝意!
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