韋 慧， 王炎秋， 張迅軼， 紀(jì)亞忠

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，上海 200065)

體外受精-胚胎移植(in vitro fertility-embryo transfer, IVF-ET)結(jié)局主要受患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、不孕因素、激素水平、移植胚胎的數(shù)量和質(zhì)量、內(nèi)膜情況等多種因素的影響。控制性促排卵(controlled ovarian stimulation, COS)周期發(fā)育良好的卵泡中是否存在成熟的卵母細(xì)胞是臨床醫(yī)生和胚胎師關(guān)注的焦點(diǎn)。對(duì)于卵母細(xì)胞來(lái)說(shuō)，卵泡液是賴(lài)以生存的微環(huán)境，可以鏡像反應(yīng)卵細(xì)胞發(fā)育情況。因此，了解卵泡液的成分，對(duì)于認(rèn)識(shí)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能及受精等活動(dòng)具有重要意義。囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator， CFTR)是由囊性纖維化(cystic fibrosis, CF)基因編碼的一種氯離子通道蛋白，Riordan 等于1989年首次克隆成功。CFTR蛋白在正常情況下廣泛表達(dá)于呼吸道、胰腺、汗腺、小腸及生殖道等多種組織的上皮細(xì)胞上，負(fù)責(zé)對(duì)鹽和水份進(jìn)行跨上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn),在維持和穩(wěn)定機(jī)體局部液體微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，維持機(jī)體正常的生理功能具有重要的作用。離子通道蛋白是影響液體微環(huán)境的重要調(diào)控因子。CFTR作為子宮中唯一的Cl-通道,控制著宮頸、宮腔的液體分泌,從而對(duì)在女性生殖道中精子的獲能、游走、卵子受精、胚胎著床等一系列生殖事件進(jìn)行調(diào)控。本研究探討不孕女性患者卵泡液中CFTR的表達(dá)，旨在研究CFTR與女性年齡的關(guān)系和在女性生殖、生理中的作用及與人卵泡、胚胎正常生長(zhǎng)的調(diào)控。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年12月至2017年9月在同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行常規(guī)IVF/ICSI-ET助孕治療的患者80例，患者年齡25～52歲，按照年齡分為三組，A組≤35歲(n=28)；B組36～39歲(n=29)；C組≥40歲(n=23)。該研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與所有患者簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 空腹抽取80例患者月經(jīng)第2～3日、注射HCG日靜脈血送檢。收集80例患者行控制性促排卵扳機(jī)后，取卵日第1管卵泡直徑>15mm成熟卵泡的清亮、無(wú)血染的混合卵泡液，置離心管內(nèi)，2000 r/min，離心半徑20cm，離心10min，去除顆粒細(xì)胞，小心吸取上清液裝入無(wú)菌Eppendorf管中，封口，標(biāo)記后置于-20℃冰箱中保存待測(cè)。卵母細(xì)胞外周包裹著卵丘及放射冠顆粒細(xì)胞，在ICSI操作前，要去除卵周顆粒細(xì)胞，對(duì)MII期的卵子進(jìn)行單精子注射。通過(guò)在培養(yǎng)液中加入一定濃度的透明質(zhì)酸酶，然后應(yīng)用適合口徑的吸管反復(fù)吹吸去除卵周細(xì)胞。收集進(jìn)行ICSI“拆卵”時(shí)通過(guò)透明質(zhì)酸酶消化剝離的顆粒細(xì)胞，將細(xì)胞種至培養(yǎng)皿中放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h待測(cè)。

1.2.2 控制性促排卵方案 80個(gè)周期均采取拮抗劑方案，具體方案如下。拮抗劑方案： 患者在月經(jīng)第3日開(kāi)始應(yīng)用Gn(起始劑量75～300 IU)，根據(jù)卵泡發(fā)育情況適時(shí)調(diào)節(jié)Gn用量及添加拮抗劑(思則凱，瑞士默克)0.25mg或拮抗劑(歐加利，荷蘭默沙東)0.25mg每日1次，直至hCG注射日。當(dāng)至少2個(gè)卵泡直徑達(dá)18mm或3個(gè)卵泡直徑達(dá)17mm時(shí)，給予人絨毛膜促性腺激素(HCG，上海麗珠制藥有限公司)4000～8000 IU注射，36h后行陰式B超引導(dǎo)下穿刺取卵術(shù)，進(jìn)行IVF/ICSI授精。

1.2.3 雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定CFTR蛋白用抗人CFTR單抗(購(gòu)自中國(guó)上海志立生物公司)包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的CFTR與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人CFTR，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在450nm處測(cè)吸光度值(A450)，CFTR濃度與A值成正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中CFTR濃度。

1.2.4 間接免疫熒光染色法檢測(cè)顆粒細(xì)胞上CFTR蛋白的定位及表達(dá) 將培養(yǎng)后的卵丘顆粒細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定20min后，加入0.3% Triton室溫通透30min；細(xì)胞加入10%山羊血清封閉液常溫封閉30min；隨后加入小鼠抗CFTR抗體(1∶100稀釋?zhuān)珹bcam，ab2784)，放4℃冰箱過(guò)夜；將標(biāo)本復(fù)溫，細(xì)胞經(jīng)漂洗后，加入FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶50稀釋?zhuān)琘EASEN，33207ES60)，37℃孵育30min；細(xì)胞核采用DAPI染色；倒置熒光顯微鏡下觀察CFTR的細(xì)胞定位情況。

1.2.5 Real-time PCR法檢測(cè)CFTR基因表達(dá) TRIzol法提取顆粒細(xì)胞總RNA(TRIzol裂解液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(試劑購(gòu)自Fermentas公司)，取RT產(chǎn)物應(yīng)用ABI Prism 7500 SDS進(jìn)行real-time PCR(SYBRGreen熒光染料購(gòu)自上?？針?lè)生物科技有限公司)。引物由上海華大基因公司合成。real-time PCR總反應(yīng)體系50μL，將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下。CFTR上游引物： 5′-TGTAAATGGAGG-AGGAAATG-3′，下游引物： 5′-GAGAAGATGATA-AGTGGGAAA-3′；β-actin上游引物： 5′-CTGGGA-CGACATGGAGAAAA-3′；下游引物： 5′-AAGGA-AGGCTGGAAGAGTGC-3′。擴(kuò)增程序?yàn)椋?95℃作用5min，95℃作用15s，60℃作用45s 40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)后，在60～95℃進(jìn)行熔解曲線分析。通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)積累量，得到各管標(biāo)本的擴(kuò)增曲線、熔解曲線及目的序列的Ct值，同時(shí)檢測(cè)該管標(biāo)本管家基因β-actin的Ct值，計(jì)算各管標(biāo)本待測(cè)序列的△Ct值(△Ct=目的基因Ct值-該管樣品β-actin的Ct值)，該管標(biāo)本目的基因的相對(duì)表達(dá)量為2-ΔCt值。

1.2.6 胚胎實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 授精72h后檢查胚胎發(fā)育情況，胚胎分為5級(jí)。1級(jí): 7～10細(xì)胞，細(xì)胞碎片<5%，卵裂球均一性好。2級(jí)： 6～12細(xì)胞，細(xì)胞碎片6%～15%，卵裂球均一性良。3級(jí)： 5～6細(xì)胞，細(xì)胞碎片<30%。4級(jí): ≥6細(xì)胞，細(xì)胞碎片>30%或所有≤5細(xì)胞；5級(jí)： 2PN，未分裂胚胎或含有100%碎片的胚胎。1級(jí)、2級(jí)胚胎視為優(yōu)質(zhì)胚胎，1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)胚胎為可移植胚胎。2PN(原核pronucleus, PN)形成率=2PN數(shù)/獲卵數(shù)×100%，可移植胚胎率=可移植胚胎數(shù)/2PN胚胎數(shù)×100%，優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN胚胎數(shù)×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 患者的一般情況及卵子和胚胎發(fā)育結(jié)局比較

本研究共80例患者。不同年齡組比較，3組的不孕年限、基礎(chǔ)內(nèi)分泌雌二醇和孕激素相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);基礎(chǔ)內(nèi)分泌黃體生成素和卵泡刺激素不同年齡組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

不同年齡組獲卵數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著年齡的增大，獲卵數(shù)逐漸減少。2PN形成率和優(yōu)質(zhì)胚胎率在不同年齡組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而可用胚胎率在不同年齡組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

C組在取卵日的卵泡液CFTR水平(92.68±29.94)ng/mL]明顯高于A、B兩組取卵日的卵泡液CFTR水平(52.94±25.51)、(75.29±29.29)ng/mL]；B組在取卵日的卵泡液CFTR水平高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；卵泡液中CFTR水平與年齡呈明顯正相關(guān)(r=0.497)，見(jiàn)表1。

不同年齡組胚胎培養(yǎng)結(jié)局中獲卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎率與卵泡液中CFTR含量呈反比；2PN形成率與卵泡液中CFTR含量呈正比，見(jiàn)表1。

表1 患者的一般情況和卵子及胚胎發(fā)育結(jié)局

2.2 卵丘顆粒細(xì)胞上CFTR的定位及表達(dá)

使用間接免疫熒光染色法檢測(cè)卵丘顆粒細(xì)胞上CFTR的表達(dá)，CFTR蛋白在卵丘顆粒細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜上均有表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 鏡下觀察顆粒細(xì)胞中CFTR的表達(dá)定位情況(免疫熒光染色)Fig.1 CFTR is located in the cytoplasm and cell membrane of cumulus granulosa cells圖示CFTR定位于卵丘顆粒細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜；實(shí)線箭頭為顆粒細(xì)胞；虛線箭頭為顆粒細(xì)胞團(tuán)

2.3 real-time PCR法檢測(cè)卵丘顆粒細(xì)胞CFTR基因表達(dá)

4例不同年齡患者的卵丘顆粒細(xì)胞上均有一定量的CFTR mRNA表達(dá)；不同年齡患者卵丘顆粒細(xì)胞中CFTR mRNA表達(dá)與年齡呈正相關(guān)(r=0.440)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.560)，見(jiàn)表2。

不同年齡胚胎培養(yǎng)結(jié)局中獲卵數(shù)和可用胚胎率與年齡呈反比趨勢(shì)，可用胚胎率與CFTR mRNA表達(dá)量也呈反比趨勢(shì)，見(jiàn)表3。

表2 不同年齡患者卵丘顆粒細(xì)胞CFTR mRNA的表達(dá)

3 討 論

經(jīng)WHO預(yù)測(cè)，21世紀(jì)不孕癥將成為僅次于腫瘤和心腦血管病的第三大類(lèi)疾病，不孕癥已成為世界范圍內(nèi)廣泛關(guān)注的問(wèn)題。傳統(tǒng)的胚胎選擇根據(jù)胚胎的形態(tài)學(xué)參數(shù)進(jìn)行評(píng)估，即依據(jù)細(xì)胞數(shù)量、碎片百分比及均一性篩選可移植胚胎，該方法因缺少客觀的可量化公認(rèn)指標(biāo)且受到實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員主觀因素的影響，并不能準(zhǔn)確反映胚胎的發(fā)育潛能。臨床研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)30%可移植胚胎在著床期呈現(xiàn)“全”或“無(wú)”狀態(tài)，而且同一患者不同周期胚胎種植率也不同。目前，尚缺乏可靠的無(wú)創(chuàng)性的胚胎選擇標(biāo)志物。

表3 不同年齡患者卵丘顆粒細(xì)胞CFTR mRNA的表達(dá)與胚胎培養(yǎng)結(jié)局

研究證實(shí)，許多細(xì)胞因子參與卵母細(xì)胞及胚胎的正常發(fā)育，卵泡液是卵母細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，是在卵泡發(fā)育早期，由血漿蛋白跨過(guò)血-卵屏障與卵泡周?chē)念w粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞分泌物共同累積到濾泡腔所構(gòu)成的卵泡中一種重要的動(dòng)態(tài)組成成分。能否通過(guò)卵泡液的分析來(lái)預(yù)測(cè)卵子及胚胎的發(fā)育情況是目前研究的熱點(diǎn)。本研究分析了卵泡液CFTR與IVF/ICSI患者卵子及胚胎發(fā)育結(jié)局的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其在卵泡液中的濃度與患者的年齡、基礎(chǔ)內(nèi)分泌激素水平等因素之間的表達(dá)規(guī)律。目前已有許多研究發(fā)現(xiàn)，與年齡相關(guān)的不孕癥，不僅與卵子質(zhì)量、子宮內(nèi)膜、陰道分泌物改變及女性健康水平的下降等因素有關(guān)，同時(shí)還可能與卵泡液中某些相關(guān)蛋白質(zhì)的含量變化存在密切關(guān)系。Hashemitabar等發(fā)現(xiàn)，不同年齡段女性的卵泡液蛋白質(zhì)中有十余種蛋白存在差異，相較于年輕女性，中年女性的卵泡液中，血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、血液結(jié)合素、激肽原-Ⅰ、補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4這五種蛋白的表達(dá)發(fā)生下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，年齡≥40歲的患者在取卵日的卵泡液CFTR水平明顯高于其他兩組年輕患者取卵日的卵泡液CFTR水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)卵泡液中CFTR水平與年齡呈明顯正相關(guān)，年齡越大，卵泡液中CFTR水平越高。年齡不僅影響女性的卵巢功能和卵母細(xì)胞的質(zhì)量，還影響卵母細(xì)胞的發(fā)育，即隨著年齡的增加，卵母細(xì)胞發(fā)育異常的頻率也不斷增加，但機(jī)制尚未明確。卵泡液是卵母細(xì)胞賴(lài)以生存的微環(huán)境，測(cè)定卵泡液中CFTR含量具有簡(jiǎn)便性和早期預(yù)測(cè)性，因此對(duì)卵泡液中CFTR的代謝評(píng)估可能為預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞的質(zhì)量提供有價(jià)值的信息。

離子通道蛋白是影響液體微環(huán)境的重要調(diào)控因子。自20世紀(jì)80年代末CFTR基因被克隆以來(lái)，它一直是離子通道研究中的一個(gè)熱點(diǎn)，屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-binding Cassette transporter, ABC)家族。CFTR作為子宮中唯一的Cl-通道,控制著宮頸、宮腔的液體分泌。本研究結(jié)果顯示，年齡與卵泡液中CFTR水平呈正相關(guān)，且卵泡液中高水平CFTR與該卵泡液的獲卵數(shù)有關(guān)，表明隨著年齡增加，機(jī)體將過(guò)多合成分泌CFTR，可能影響卵泡中卵子的正常發(fā)育。有研究觀察到，CFTR抑制劑或者抗體的應(yīng)用會(huì)降低精子的獲能，同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到有CFTR突變小鼠的受精能力與正常小鼠相比明顯降低。本研究結(jié)果顯示，不同年齡組胚胎培養(yǎng)結(jié)局中2PN形成率與卵泡液中CFTR含量呈正相關(guān)，這說(shuō)明在胚胎形成早期微環(huán)境中的CFTR含量會(huì)影響卵母細(xì)胞的受精能力，這與已有的研究相符。但本研究觀察到可用胚胎率在卵泡液CFTR含量(52.94±25.51)～(75.29±29.29)ng/mL]內(nèi)呈遞增趨勢(shì)，在卵泡液CFTR含量(75.29±29.29)～(92.68±29.94)ng/mL]內(nèi)呈遞減趨勢(shì)，這說(shuō)明在胚胎的發(fā)育過(guò)程中，早期微環(huán)境中適量的CFTR可促進(jìn)胚胎的發(fā)育，但當(dāng)CFTR的含量超過(guò)一定的范圍，可能會(huì)影響胚胎的進(jìn)一步發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)內(nèi)分泌雌二醇水平與卵泡液中CFTR含量呈正相關(guān)，CFTR含量隨著bE2水平的升高而增多。有研究顯示[10-12]，CFTR的異常表達(dá)還與卵巢過(guò)度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome， OHSS)、輸卵管積水、沙眼衣原體感染所致的女性不孕等婦科疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。Ajonuma等[10]發(fā)現(xiàn)，給無(wú)孕激素對(duì)抗小鼠注射雌激素后，小鼠出現(xiàn)了OHSS樣癥狀，同時(shí)子宮和卵巢的CFTR表達(dá)增加。給予孕激素和抗CFTR藥物后，OHSS癥狀減輕，說(shuō)明雌激素可促進(jìn)CFTR的上調(diào)表達(dá)。血清中的雌激素水平普遍被認(rèn)為是反映卵母細(xì)胞質(zhì)量的良好指標(biāo)，卵泡液中雌激素水平隨著卵泡的生長(zhǎng)而逐漸升高，雌激素能促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，不同大小卵泡液中雌激素的濃度不同，而雌激素影響CFTR的上調(diào)表達(dá)，由此推測(cè)CFTR的濃度在不同大小卵泡液中的濃度可能存在差異性，在進(jìn)一步的研究中可選擇不同大小卵泡對(duì)其卵泡液中E2和CFTR的濃度和相關(guān)性進(jìn)行分析。

卵丘顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟和性激素分泌中有很重要的作用，它們通過(guò)縫隙連接傳遞信息，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟、排卵。分析卵丘顆粒細(xì)胞中基因表達(dá)的變化，可能與卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟相關(guān)，間接反映受精卵的發(fā)育能力。由于卵母細(xì)胞十分珍貴，因而通過(guò)研究卵丘顆粒細(xì)胞來(lái)間接研究卵泡和卵母細(xì)胞的發(fā)育是一個(gè)無(wú)創(chuàng)的、適合臨床開(kāi)展的途徑。本研究只選取了其中4例患者ICSI后卵丘顆粒細(xì)胞標(biāo)本來(lái)初步探索卵丘顆粒細(xì)胞CFTR表達(dá)與年齡的相關(guān)性及對(duì)ICSI助孕胚胎發(fā)育結(jié)局的影響趨勢(shì)，結(jié)果與卵泡液中表達(dá)結(jié)果一致。本研究結(jié)果所示CFTR主要表達(dá)在卵丘顆粒細(xì)胞胞漿和胞膜上。卵丘顆粒細(xì)胞中CFTR在基因水平表達(dá)與年齡可能存在一個(gè)正相關(guān)性，并有可能影響ICSI助孕胚胎發(fā)育結(jié)局，驗(yàn)證這一結(jié)果仍需要在不同年齡組加大樣本量進(jìn)行研究。CFTR在卵丘顆粒細(xì)胞的表達(dá)，可能影響卵母細(xì)胞的成熟和卵子的發(fā)育能力，進(jìn)而與ICSI助孕胚胎發(fā)育結(jié)局有關(guān)。

綜上所述，本研究分析了卵泡液中CFTR與IVF/ICSI患者卵子及胚胎發(fā)育結(jié)局的關(guān)系，初步探討了卵丘顆粒細(xì)胞CFTR表達(dá)對(duì)ICSI助孕胚胎發(fā)育結(jié)局的影響，證實(shí)了年齡與卵泡液中CFTR水平的相關(guān)性。CFTR蛋白是否可以作為與年齡相關(guān)的不孕癥的生物標(biāo)志還需要在未來(lái)研究中對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探究，需要進(jìn)一步開(kāi)展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)卵泡液中CFTR的細(xì)胞來(lái)源。同時(shí)證實(shí)了在胚胎形成早期，微環(huán)境中的CFTR含量會(huì)影響卵母細(xì)胞的受精能力，CFTR對(duì)于胚胎發(fā)育的影響仍需要增加樣本量進(jìn)一步研究。在進(jìn)一步的研究中，將對(duì)臨床隨訪一直追溯至妊娠結(jié)局，如臨床妊娠率、活產(chǎn)率等。期待可以發(fā)現(xiàn)CFTR更多生理病理方面的功能與作用，從而通過(guò)體外鑒定精確、簡(jiǎn)便地預(yù)測(cè)輔助生殖的成功率，并改善臨床結(jié)局。