唐 鈺 (吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，吉林 吉林 132013)

創(chuàng)傷性腦損傷后血管生成是一種反應(yīng)性保護(hù)機(jī)制。創(chuàng)傷性腦損傷后腦組織出現(xiàn)缺血缺氧，新生血管的生成具有重要作用，可以改善腦灌注，減輕繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷〔1，2〕。內(nèi)皮祖細(xì)胞可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體，在血管形成中發(fā)揮重要作用，內(nèi)皮祖細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)損傷區(qū)新生血管生成〔3，4〕。順磁性氧化鐵(SPIO)可以標(biāo)記脾臟來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞〔5，6〕。本文采用SPIO標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞，通過CT灌注成像觀察其對(duì)老年大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康、清潔級(jí)、雄性、17～19周齡、Wistar老年大鼠，購(gòu)自北京生命科學(xué)研究所，許可證號(hào):SYXK(京)2015-0003。

主要試劑:胎牛血清、淋巴細(xì)胞分離液、SPIO、Dulbecco磷酸鹽緩沖液(DPBS，美國(guó)Sigma公司)，胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、山羊抗大鼠CD31多克隆抗體(美國(guó)Gibco公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定 將大鼠處死后打開腹腔，分離脾臟組織，沖洗干凈后剪碎，研磨，并加入DPBS沖洗至研磨脾臟變?yōu)榻咏咨?，將得到的?xì)胞懸液加入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2 000 r/min離心20 min，提取單個(gè)核細(xì)胞的白膜層，再加入DPBS離心，棄去上清液，重復(fù)操作2次，支撐細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液以3×106/ml接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，采用流式細(xì)胞儀對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2.2 SPIO標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞 將SPIO工作液和多聚賴氨酸(PLL)工作液混合制成SPIO-PLL復(fù)合標(biāo)記物，吸棄內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入復(fù)合標(biāo)記物過夜孵育，普魯士藍(lán)染色觀察標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞:將過夜孵育的內(nèi)皮祖細(xì)胞洗滌后，多聚甲醛固定，加入普魯士藍(lán)溶液作用15 min，倒置顯微鏡觀察SPIO標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞。

1.2.3 分組 將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(24只)、SPIO組(12只)、顱腦損傷組(24只)、內(nèi)皮祖細(xì)胞組(36只)，對(duì)照組大鼠不予任何處理，SPIO組大鼠顱腦損傷模型建立后6 h經(jīng)尾靜脈注射SPIO工作液100 μl，顱腦損傷組大鼠建立顱腦損傷模型，內(nèi)皮祖細(xì)胞組大鼠建立顱腦損傷模型+建模后6 h經(jīng)尾靜脈注射SPIO標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞100 μl(1×106個(gè)內(nèi)皮祖細(xì)胞)。

1.2.4 建立創(chuàng)傷性顱腦損傷模型 SPIO組、顱腦損傷組、內(nèi)皮祖細(xì)胞組大鼠建立創(chuàng)傷性顱腦損傷模型。將大鼠腹腔麻醉成功后固定到手術(shù)臺(tái)上，顱頂部皮膚消毒后行正中縱行切口暴露右側(cè)頂骨，眼科鑷擴(kuò)大骨窗到3 mm×3 mm，將打擊錘自由落體撞擊硬腦膜，止血后縫合頭皮。

1.2.5 各組大鼠建模后CT灌注成像 將對(duì)照組、顱腦損傷組和內(nèi)皮祖細(xì)胞組大鼠各12只，移植后3、5、7 d進(jìn)行CT灌注掃描，利用軟件產(chǎn)生顱腦損傷傷側(cè)和健側(cè)腦血容量(CBV)、腦血流量(CBF)、平均通過時(shí)間(MTT)和表面通透性(PS)，計(jì)算灌注指標(biāo)的相對(duì)值(傷側(cè)/健側(cè))。

1.2.6 普魯士藍(lán)染色 移植后2、24、48 h取SPIO組大鼠和內(nèi)皮祖細(xì)胞組大鼠各4只，處死大鼠后取大鼠腦組織石蠟包埋進(jìn)行普魯士藍(lán)染色。伊紅染液復(fù)染，二甲苯固定切片，觀察普魯士藍(lán)染色情況。

1.2.7 腦組織CD31+細(xì)胞免疫組化染色及微血管計(jì)數(shù)比較 移植后3、5、7 d取顱腦損傷組，內(nèi)皮祖細(xì)胞組大鼠各8只，處死大鼠，取腦組織進(jìn)行石蠟包埋，采用SP法對(duì)CD31+細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)免疫組化染色，胞核呈藍(lán)色、胞質(zhì)呈棕色的長(zhǎng)條索樣細(xì)胞為CD31+細(xì)胞，在400倍高倍鏡下選5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)CD31+細(xì)胞，取平均值。微血管計(jì)數(shù):胞質(zhì)呈棕染的管腔樣結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細(xì)胞或者兩個(gè)及以上細(xì)胞之間的連接為微血管，在200倍視野下計(jì)數(shù)創(chuàng)傷區(qū)微血管數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，計(jì)量資料兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組之間比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SPIO標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)顱腦損傷區(qū)域的分布普魯士藍(lán)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn):移植后2、24、48 h，內(nèi)皮祖細(xì)胞組在顱腦損傷區(qū)域均見大量藍(lán)染顆粒聚集(SPIO標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞)。移植后2 h，藍(lán)染細(xì)胞主要在顱腦損傷組織周邊分布，和非損傷區(qū)域界限明顯;移植后24 h，在顱腦損傷區(qū)域見少量散在藍(lán)染細(xì)胞;移植后48 h，在顱腦損傷區(qū)域中央見大量藍(lán)染細(xì)胞，表明SPIO標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，從顱腦損傷區(qū)域周邊向顱腦損傷區(qū)域中央聚集;SPIO組在移植后2、24、48 h在顱腦損傷區(qū)域均未見藍(lán)染細(xì)胞，表明SPIO沒有向顱腦損傷區(qū)域聚集的能力。

2.2 顱腦損傷組和內(nèi)皮祖細(xì)胞組微血管計(jì)數(shù)比較內(nèi)皮祖細(xì)胞組移植后3、5、7 d顱腦損傷區(qū)微血管計(jì)數(shù)均顯著高于顱腦損傷組(P＜0.05)。見表1。

2.3 顱腦損傷組和內(nèi)皮祖細(xì)胞組CD31+細(xì)胞數(shù)比較內(nèi)皮祖細(xì)胞組移植后3、5、7 d顱腦損傷區(qū)CD31+細(xì)胞數(shù)均顯著高于顱腦損傷組(P＜0.05)。見表2。

表1 顱腦損傷組和內(nèi)皮祖細(xì)胞組微血管計(jì)數(shù)比較(，n=8)

表1 顱腦損傷組和內(nèi)皮祖細(xì)胞組微血管計(jì)數(shù)比較(，n=8)

組別 移植后3 d 移植后5 d 移植后7 d顱腦損傷組 35.46±4.23 47.68±5.21 55.46±5.31內(nèi)皮祖細(xì)胞組 55.47±4.68 76.56±5.34 83.24±5.47 t值 10.783 11.423 8.857 P值 0.000 0.000 0.000

表2 顱腦損傷組和內(nèi)皮祖細(xì)胞組CD31+細(xì)胞數(shù)比較(，n=8)

表2 顱腦損傷組和內(nèi)皮祖細(xì)胞組CD31+細(xì)胞數(shù)比較(，n=8)

組別 移植后3 d 移植后5 d 移植后7 d顱腦損傷組 77.65±6.87 114.35±9.12 129.78±8.32內(nèi)皮祖細(xì)胞組 121.43±8.21 163.24±9.53 178.69±8.57 t值 14.236 13.264 11.423 P值 0.000 0.000 0.000

2.4 各組大鼠CT灌注參數(shù)比較 顱腦損傷組大鼠移植后3、5、7 d相對(duì)腦血容量(rCBV)、相對(duì)腦血流量(rCBF)、PS值均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，移植后相對(duì)平均通過時(shí)間(rMTT)值和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);內(nèi)皮祖細(xì)胞組移植后3 d和移植后5 d rCBV值顯著低于顱腦損傷組(P＜0.05)，移植后7 d rCBV值和顱腦損傷組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);內(nèi)皮祖細(xì)胞組移植后 3、5、7 d rCBF和 PS值均顯著低于顱腦損傷組(P＜0.05)，移植后5 d rMTT值顯著高于顱腦損傷組(P＜0.05)，內(nèi)皮祖細(xì)胞組移植后3、7 d rMTT值和顱腦損傷組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3～表6。

表3 各組大鼠rCBV比較(，n=12，%)

表3 各組大鼠rCBV比較(，n=12，%)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與顱腦損傷組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 移植后3 d 移植后5 d 移植后7 d對(duì)照組 101.23±5.46 102.13±5.37 101.75±5.18顱腦損傷組 179.89±32.141) 139.35±27.581) 124.34±21.261)內(nèi)皮祖細(xì)胞組164.23±28.671)2) 82.31±19.831)2) 123.43±16.531)F值 43.264 31.243 13.231 P值 0.000 0.000 0.000

表4 各組大鼠rCBF比較(，n=12，%)

表4 各組大鼠rCBF比較(，n=12，%)

組別 移植后3 d 移植后5 d 移植后7 d對(duì)照組 98.78±0.76 99.32±0.83 98.97±0.85顱腦損傷組 173.24±31.521) 139.84±28.671) 124.38±18.791)內(nèi)皮祖細(xì)胞組148.75±26.461)2) 81.32±17.681)2) 109.48±16.531)2)F值 39.856 33.152 14.264 P值 0.000 0.000 0.000

表5 各組大鼠rMTT比較(，n=12，%)

表5 各組大鼠rMTT比較(，n=12，%)

組別 移植后3 d 移植后5 d 移植后7 d對(duì)照組 101.32±4.65 102.64±5.36 101.87±4.86顱腦損傷組 102.53±8.67 101.73±7.54 99.96±7.83內(nèi)皮祖細(xì)胞組 108.42±8.47 119.78±10.532) 102.31±8.02 F值 0.146 12.435 0.115 P值 0.836 0.000 0.867

表6 各組大鼠PS比較(，n=12，ml·100 g－1·min－1)

表6 各組大鼠PS比較(，n=12，ml·100 g－1·min－1)

組別 移植后3 d 移植后5 d 移植后7 d對(duì)照組 0.02±0.01 0.01±0.01 0.03±0.02顱腦損傷組 10.43±0.781) 7.68±0.571) 3.78±0.631)內(nèi)皮祖細(xì)胞組 7.68±0.931)2) 4.47±0.531)2) 0.02±0.012)F值 344.264 253.254 66.364 P值 0.000 0.000 0.000

3 討論

血管再生指血管以分裂或出芽的方式形成新的血管網(wǎng)，為細(xì)胞組織提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，改善局部組織血供，顱腦損傷后的血管再生可以恢復(fù)損傷區(qū)血供，減輕神經(jīng)元受到的損害，顱腦損傷后血管再生在繼發(fā)性損傷和創(chuàng)傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，因此促進(jìn)顱腦損傷患者血管再生對(duì)損傷后修復(fù)具有重要作用〔7～9〕。內(nèi)皮祖細(xì)胞參與新生血管的形成，顱腦損傷后局部缺血缺氧引起堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等多種細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，上述細(xì)胞因子的升高動(dòng)員骨髓中內(nèi)皮祖細(xì)胞，使內(nèi)皮祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的黏附作用降低進(jìn)入血液，血液循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞在黏附分子的作用下聚集到損傷部位，在損傷部位通過整合機(jī)制整合到新生血管壁內(nèi)增殖分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞參與新生血管的生成;內(nèi)皮祖細(xì)胞在局部微環(huán)境的作用下可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞參與血管內(nèi)膜的再生;內(nèi)皮祖細(xì)胞還可以通過旁分泌的方式影響血管生成因子的釋放，促進(jìn)血管內(nèi)皮化，增加新生血管數(shù)量〔10～12〕。本文研究發(fā)現(xiàn)SPIO標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞可以增加顱腦損傷大鼠顱腦損傷區(qū)微血管計(jì)數(shù)和CD31+細(xì)胞數(shù)量，內(nèi)皮祖細(xì)胞能夠促進(jìn)顱腦損傷大鼠顱腦損傷局部新生血管生成，能夠促進(jìn)顱腦損傷的修復(fù)。

CT灌注成像是腦功能成像的方法之一，可以通過組織血管化程度及血流灌注狀態(tài)獲得微循環(huán)的信號(hào)，可以通過CBV、CBF、MTT、PS等灌注參數(shù)反映內(nèi)部微血管密度和血流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)等情況，可以間接反映內(nèi)皮祖細(xì)胞參與顱腦損傷區(qū)域血管再生的過程〔13，14〕。血液黏滯度、微動(dòng)脈直徑、動(dòng)脈壓、顱內(nèi)壓等決定了損傷灶局部的血流量，微動(dòng)脈和微靜脈直徑的大小決定了CBV值，在機(jī)體創(chuàng)傷情況下血管自身調(diào)節(jié)功能異常，引起CBV值下降，從而導(dǎo)致組織灌注不足引起繼發(fā)損傷，損傷早期腦水腫為血管性水腫，呈低灌注狀態(tài)，對(duì)機(jī)體損害不大，隨著病情進(jìn)展發(fā)展為細(xì)胞毒性腦水腫，細(xì)胞毒性腦水腫對(duì)輕微損傷的神經(jīng)元造成無法逆轉(zhuǎn)的損傷，呈高灌注狀態(tài)〔15〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠腦損傷區(qū)處于高灌注期，內(nèi)皮祖細(xì)胞抑制可以改善腦損傷區(qū)的高灌注水平，表面通透性恢復(fù)也比較快。