王廷剛, 薛 峰, 李 宇, 牛兆健, 王 野

(1.青島海慈醫(yī)療集團普外科，山東 青島 266000;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，山東 青島 266000)

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率分別位居惡性腫瘤第2位和第4位。目前對結(jié)腸癌的形成、發(fā)展、治療和預(yù)后雖有新的認(rèn)識，但仍未發(fā)現(xiàn)合適的標(biāo)記物用于分析結(jié)腸癌的發(fā)病機制、診斷和治療[1-2]。

結(jié)腸癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素和多階段的過程，目前對結(jié)腸癌的研究[3]主要集中在mRNA和蛋白水平。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達，目前關(guān)于miRNA抑制腫瘤發(fā)生的研究[4]逐漸增多，miR-26a是miRNA的一種，其在腫瘤中作用的研究[5]也明顯增多。研究[6]顯示：在鼻咽癌組織和細胞中miR-26a表達水平降低，并通過靶向EZH2基因抑制癌細胞的生長和致瘤性。高遷移率族蛋白1(high mobility group protein 1，HMGA1)是miR-26a的一個靶基因，miR-26a可靶向HMGA1調(diào)控膀胱癌細胞的生長、凋亡、侵襲和遷移[7]。作為HMGA家族一員，HMGA1在人類各種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[8]。miR-26a在不同癌癥中的功能與其靶標(biāo)有關(guān)，關(guān)于其靶向調(diào)節(jié)HMGA1對結(jié)腸癌細胞的生物學(xué)特性的影響機制尚不清楚。因此，本研究旨在探討miR-26a靶向HMGA1對結(jié)腸癌細胞生長、侵襲和遷移的影響，以期為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 人結(jié)腸癌SW480細胞購自中國科學(xué)院細胞庫。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶和青鏈霉素購自美國Gibco公司，BCA和CCK8試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司，SYBR Green購自上海生工生物工程有限公司，雙熒光報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司，miR-26a mimics、miR-26a inhibitor和miR-NC購自廣州銳博生物科技有限公司，pcDNA3.1載體購自美國Invitrogen公司，PGL3熒光素酶報告基因載體購自北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司。CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，實時定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將裝有人結(jié)腸癌SW480細胞的凍存管從液氮罐中取出，37℃水浴解凍后，采用移液槍將細胞轉(zhuǎn)移到5 mL無菌離心管中，加入含有10%FBS、100 mg·L-1鏈霉素和100 U·L-1青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，加入細胞培養(yǎng)液懸浮細胞，接種到細胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后換液1次，之后每2～3 d換液1次，細胞融合度達到80%～90%時進行傳代。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染和細胞中HMGA1 mRNA和蛋白表達水平檢測 取生長至對數(shù)期的人結(jié)腸癌SW480細胞，加入0.25 %胰酶消化細胞，消化完全后將細胞轉(zhuǎn)移到新的離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，加入不含有胎牛血清的不完全培養(yǎng)液接種到細胞培養(yǎng)板中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞融合度達60%時，將miR-NC(miR-NC組)、miR-26a mimics(模擬物，miR-26a mimics組)和miR-26a inhibitor(抑制物，miR-26a inhibitor組)與不完全培養(yǎng)基混合后加入至人結(jié)腸癌SW480細胞中，滴加至24孔板表面，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用定量RT-PCR(qRT-PCR)和Western blotting法檢測SW480細胞中HMGA1 mRNA和蛋白表達水平。

1.4 熒光素酶報告基因檢測各組SW480細胞中雙熒光素酶活性 通過TargetScan(http://www.targetscan.org/)、PicTa(http://pictar.mdc-berlin.de/)和The miRBase(http://mirbase.org/)三大靶基因預(yù)測庫預(yù)測到miR-26a與HMGA1的3′-UTR有結(jié)合位點。將含有miR-26a結(jié)合位點HMGA1的3′-UTR片段插入PGL3熒光素酶報告基因載體，構(gòu)建野生型和突變型HMGA1的3′-UTR熒光素酶報告載體，分別命名為Wt-HMGA1和Mut-HMGA1。將構(gòu)建好的質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)染并分為3組，即miR-NC+miR-26a mimics組、Wt-HMGA1+miR-26a mimics組和Mut-HMGA1+miR-26a mimics組。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組SW480細胞中雙熒光素酶活性。

1.5 CCK8法檢測人結(jié)腸癌SW480細胞增殖活力 取轉(zhuǎn)染后生長至對數(shù)期的 miR-NC組、miR-26a mimics組和miR-26a inhibitor組細胞，采用細胞培養(yǎng)液懸浮細胞，細胞濃度調(diào)整為3×105mL-1，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細胞懸液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h后，加入10 μL CCK8溶液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定并記錄各組吸光度(A)值，以A值反映細胞的增殖活力。

1.6 CCK8法檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖活力 將人結(jié)腸癌SW480細胞分為miR-NC組(未轉(zhuǎn)染)、miR-26a mimics組(未轉(zhuǎn)染)、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組(miR-26a mimics轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HMGA1質(zhì)粒)和miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組(miR-NC轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HMGA1質(zhì)粒)。取各組對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌SW480細胞，采用0.25 %胰酶消化細胞，轉(zhuǎn)移細胞至新的EP管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，與不完全培養(yǎng)液接種到細胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h后，參照1.3步驟檢測各組細胞的A值，以A(490)/A(630)反映各組細胞的增殖活力。

1.7 Transwell小室法檢測各組SW480細胞中侵襲細胞數(shù) 將細胞分為miR-NC組、miR-26a mimics組、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組和 miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組。取生長至對數(shù)期的人結(jié)腸癌SW480細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105mL-1，取100 μL細胞懸液接種于覆蓋有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室的上室，下層加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基500 μL，培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)液，用棉簽輕輕拭掉膜上的細胞，HE染色后在倒置顯微鏡下觀察各組侵襲細胞數(shù)。

1.8 Transwell小室法檢測各組SW480細胞中遷移細胞數(shù) 將細胞分為miR-NC組、miR-26a mimics組、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組和miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組。除了Transwell室上未鋪Matrigel基質(zhì)膠外，其他的操作如同1.7步驟。

2 結(jié) 果

2.1 各組SW480細胞中 HMGA1 mRNA和蛋白表達水平及熒光素酶活性 miR-26a mimics組SW480細胞中HMGA1 mRNA表達水平(0.273±0.092)低于miR-NC組(0.992±0.112)(t=8.592，P=0.001)，miR-26a inhibitor組SW480細胞 中HMGA1 mRNA表達水平(3.754±0.241)高于miR-NC組(t=18.001，P=0.000)，Western blotting檢測各組SW480細胞中HMGA1蛋白表達水平見圖1～3。Wt- HMGA1+miR-26a mimics共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性(0.383±0.054)低于miR-NC+miR-26a mimics共轉(zhuǎn)染組(1.030±0.071)(t=12.563，P=0.000)，而Mut-HMGA1+miR-26a mimics共轉(zhuǎn)染組與miR-NC+miR-26a mimics共轉(zhuǎn)染組(1.001±0.081)SW480細胞中熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.466，P=0.665)，見圖4，即HMGA1是miR-26a的靶基因。

2.2 各組人結(jié)腸癌SW480細胞增殖活力 miR-NC、miR-26a mimics和miR-26a inhibitor組細胞轉(zhuǎn)染24(F=15.516，P=0.004)、48(F=41.849，P=0.000)和72 h(F=85.050，P=0.000)后細胞增殖活力比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，miR-26a mimics組細胞增殖活力在上述3個時間點均明顯低于miR-NC組(t24=2.566，P24=0.043；t48=4.721，P48=0.003；t72=6.547，P72=0.001)，而miR-26a inhibitor組細胞增殖活力在上述3個時間點均明顯高于miR-NC組(t24=2.999，P24=0.024；t48=4.426，P48=0.004；t72=6.496，P72=0.001)。見圖5和表1。

A:miR-NC group;B:miR-26a mimics group;C:miR-26a inhibitor group.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖1 各組SW480細胞中 HMGA1 mRNA表達水平

Fig.1 Expression levels of HMGA1 mRNA in SW480 cells in various groups

Lane 1:miR-NC+miR-26a inhibitor group;Lane 2:Wt-HMGA1+miR-26a mimics group;Lane 3:Mut-HMGA1+miR-26a mimics group.

圖2 各組SW480細胞中HMGA1蛋白表達電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of HMGA1 protein in SW480 cells in various groups

A:miR-NC group;B:miR-26a mimics group;C:miR-26a inhibitor group.*P<0.01vsmiR-NC group.

圖3 各組SW480細胞中HMGA1蛋白表達水平

Fig.3 Expression levels of HMGA1 protein in SW480 cells in various groups

2.3 共轉(zhuǎn)染后各組細胞增殖活力 miR-NC組、miR-26a mimics組、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1組和 miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1組細胞轉(zhuǎn)染24(F=56.233，P=0.000)、48(F=60.131，P=0.000)和72 h(F=78.398，P=0.000)后SW480細胞增殖活力比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；miR-26a mimics組(t24=7.537，P24=0.000；t48=8.265，P48=0.000；t72=10.416，P72=0.000)、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1組(t24=2.895，P24=0.028；t48=4.216，P48=0.003；t72=5.149，P72=0.001)細胞增殖活力在3個時間點均明顯低于miR-NC組，miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1組細胞增殖活力在3個時間點均明顯高于miR-NC組(t24=4.264，P24=0.003；t48=4.484，P48=0.002；t72=4.002，P72=0.004)；miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1組細胞增殖活力在3個時間點明顯高于miR-26a mimics組(t24=4.427，P24=0.002；t48=4.049，P48=0.004；t72=5.267，P72=0.001)，低于miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1組(t24=7.026，P24=0.000；t48=8.700，P48=0.002；t72=9.151，P72=0.004)。見表2。

A:miR-NC+miR-125a mimics;B:Wt-HMGA1+miR-125a mimics;C:Mutt-HMGA1+miR-125a mimics.*P<0.01vsmiR-NC+miR-26a mimics group.

圖4 各組SW480細胞中雙熒光素酶活性

Fig.4 Duble luciferase activities of SW480 cells in various groups

2.4 共轉(zhuǎn)染后各組SW480細胞侵襲細胞數(shù) miR-NC組、miR-26a mimics組、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1組和miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1組細胞轉(zhuǎn)染72 h后，Transwell小室法檢測細胞侵襲結(jié)果顯示：miR-26a mimics組和miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1組侵襲細胞數(shù)均明顯低于miR-NC組(t1=12.953，P1=0.000；t2=4.741，P2=0.002)，miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1組侵襲細胞數(shù)明顯高于miR-NC組(t=4.956，P=0.001)；miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1組侵襲細胞數(shù)明顯高于miR-26a mimics組(t=8.212，P=0.000)，低于miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1組(t=9.697，P=0.000)。見表3。

*P<0.05 vs miR-NC group.

Fig.5 Proliferation activities of cells in various groups detected by CCK8 method

表1 不同時間點各組結(jié)腸癌SW480細胞的增殖活力

Group Prolieration activity(t/h) 2448 72 miR-NC0.345±0.036 0.462±0.041 0.578±0.046 miR-26a mimics0.262±0.036*0.286±0.042*0.322±0.043*miR-26a inhibi-tor0.442±0.046*0.627±0.053*0.832±0.054*F15.51641.84985.050P0.0040.0000.000

*P< 0.05vsmiR-NC group.

2.5 共轉(zhuǎn)染后各組SW480細胞中遷移細胞數(shù) miR-NC組、miR-26a mimics組、miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1組和 miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1組細胞轉(zhuǎn)染72 h后，Transwell小室法檢測結(jié)果顯示：miR-26a mimics組和miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1組遷移細胞數(shù)均明顯低于miR-NC組(t1=10.456，P1=0.000；t2=4.809，P2=0.001)，miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1組遷移細胞數(shù)明顯高于miR-NC組(t=5.590，P=0.001)；miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1組遷移細胞數(shù)明顯高于miR-26a mimics組(t=16.046，P=0.000)，低于miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1組(t=10.400，P=0.000)。見表3。

表2 不同時間點共轉(zhuǎn)染后各組細胞增殖活力

Group Proliferation activity (t/h) 244872miR-NC 0.366±0.0360.538±0.0410.697±0.046miR-26a mimics0.206±0.036*△0.291±0.041*△0.343±0.043*△miR-26a mimics +pcDNA3.1-HMGA10.469±0.031*0.412±0.034*0.522±0.039*miR-NC + pcDNA3.1-HMGA10.625±0.034*△0.672±0.029*△0.833±0.038*△F79.07360.13178.398P0.0000.0000.000

*P<0.01vsmiR-NC group;△P<0.01vsmiR-26a mimics + pcDNA3.1-HMGA1 group.

3 討 論

在過去的幾十年間，研究者[9-10]發(fā)現(xiàn)：miRNA可作為主要的調(diào)控因子參與腫瘤的發(fā)生，這給腫瘤分子途徑的研究提供了新的視角，針對不同類型、不同時期和級別的腫瘤參與調(diào)控的miRNA可能不同，這使miRNA作為特異性腫瘤標(biāo)志物成為可能。miR-26a在腫瘤方面已有很多研究，但其在腫瘤發(fā)生中的角色仍有爭議[11]。研究[12-15]顯示：miR-26a在肝癌和乳腺癌等腫瘤中表達水平下調(diào)，其與靶基因結(jié)合可抑制腫瘤生長；但在肺癌和膽囊癌中可通過糖原合成激酶3β(GSK-3β)使miR-26a表達水平上調(diào)，促進腫瘤的發(fā)生。miR-26a表達和生物學(xué)功能的不同可能與癌細胞遺傳背景有關(guān)。miR-26a在結(jié)腸癌細胞中的作用尚未清楚，因此本研究的目的是探討miR-26a的生物學(xué)特性。

表3 共轉(zhuǎn)染后各組侵襲細胞數(shù)

Tab.3 Number of invasion cells in various groups after co-transfection

GroupNumber of invasion cellsNumber ofmigration cellsmiR-NC139.8±5.6189.8±8.7miR-26a mimics67.4±6.2*97.4±9.6*miR-26a mimics+ pcDNA3.1-HM-GA1113.3±7.1*△#147.3±10.5*△#miR-NC+ pcDNA3.1-HM-GA1167.5±8.2*239.2±13.8*F116.16893.540P 0.0000.000

*P<0.01vsmiR-NC group;△P<0.01vsmiR-26a mimics group;#P<0.01vsmiR-NC+pcDNA3.1-HMGA1 group.

不同腫瘤中miR-26a的作用可能不同，這與所調(diào)控的靶基因有關(guān)[16]。HMGA1可調(diào)節(jié)多個轉(zhuǎn)錄因子的功能，其作為癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其在正常人中一般低表達或者表達缺失，而在一些癌癥患者中常過度表達[17]。研究[18]顯示：HMGA1的過度表達與膀胱癌的腫瘤分期、等級、復(fù)發(fā)和預(yù)后有關(guān)，降低HMGA1的表達可阻滯細胞周期和降低細胞活性。為了驗證miR-26a是否與HMGA1共同參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，本研究首先驗證了HMGA1是否為miR-26a的靶基因，將構(gòu)建的野生型和突變型HMGA1的3′-UTR熒光素酶報告載體轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌SW480細胞中，并通過共轉(zhuǎn)染檢測細胞中熒光素酶活性，結(jié)果證實HMGA1是miR-26a的靶基因。

研究[19]顯示：miR-26a在肝癌中表達下調(diào)，其表達與肝癌患者的生存期及對干擾素的敏感性有關(guān)。在乳腺癌細胞和組織中miR-26a表達水平下調(diào)，將miR-26a mimics轉(zhuǎn)染細胞可明顯抑制細胞的生長[20]。本研究將miR-NC、miR-26a mimics和miR-26a inhibitor共轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細胞，轉(zhuǎn)染24、48和72 h后CCK8實驗檢測結(jié)果顯示：miR-26a mimics組細胞活力明顯低于miR-NC組，miR-26a inhibitor組細胞活力明顯高于miR-NC組，說明miR-26a在人結(jié)腸癌發(fā)生中起重要作用。

研究[21-22]顯示：HMGA基因相關(guān)的miRNA在垂體腺瘤中表達下調(diào)，進而使HMGA1和HMGA2表達上調(diào)，但在無功能的垂體腺瘤中，下調(diào)miRNA與HMGA1上調(diào)無關(guān)，說明能夠靶向HMGA基因的miRNA下調(diào)可增加人垂體腺瘤中HMGA蛋白表達。研究[23-24]顯示：miR-296可通過抑制HMGA1轉(zhuǎn)錄從而抑制HMGA1表達，當(dāng)強制表達miR-296后，可通過上調(diào)HMGA1明顯降低人前列腺癌細胞的增殖和侵襲，表明HMGA1可作為miRNA的靶基因?qū)Π┘毎l(fā)生發(fā)展起作用。已有研究[25-27]證實HMGA1是miR-26a的靶基因，但miR-26a是否靶向調(diào)控HMGA1對結(jié)腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移起作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示：miR-26a mimics組和miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1組細胞活力、侵襲和遷移數(shù)均明顯低于miR-NC組，miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1組細胞活力、侵襲和遷移數(shù)均明顯高于miR-NC組；miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1組細胞活力、侵襲和遷移數(shù)明顯高于miR-26a mimics組，低于miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1組，說明miR-26a靶向HMGA1調(diào)控結(jié)腸癌細胞的生物學(xué)特性。

綜上所述，HMGA1是miR-26a的靶基因，上調(diào)miR-26a表達可抑制人結(jié)腸癌SW480細胞增殖，下調(diào)miR-26a表達可促進細胞增殖，miR-26a可靶向HMGA1抑制細胞增殖、侵襲和遷移。