徐海冬 冷奇穎 PATRICIA Adu-Asiamah 王章 李婷 張麗

（廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湛江 524088）

環(huán) 狀 RNA（circular RNA，circRNA） 是 一 類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）。與傳統(tǒng)的線性RNA（linear RNA）相比，circRNA不存在5'和3'端，為共價(jià)鍵連接在的環(huán)狀閉鎖結(jié)構(gòu)，對(duì)RNA外切酶（RNase R）具有抗性，表達(dá)穩(wěn)定，不易降解。近幾年研究發(fā)現(xiàn)circRNA與人類疾病發(fā)生關(guān)聯(lián)緊密，成為RNA領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)。早期研究認(rèn)為circRNA是標(biāo)準(zhǔn)RNA剪接的副產(chǎn)物，但隨著研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在真核生物中普遍存在，認(rèn)為可能具有一定的生物學(xué)功能。circRNA來自RNA前體（pre-RNA）的反式剪接，即下游外顯子同上游外顯子反向結(jié)合形成地環(huán)形結(jié)構(gòu)。不同序列來源的circRNA可發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。有報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)circRNA可吸附miRNA發(fā)揮miRNA海綿（miRNA sponges）作用，也有報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)RNA環(huán)化與mRNA形成可競爭剪接因子，以此調(diào)控目的基因的表達(dá)。但是，circRNA的主要作用還未清晰。本文總結(jié)了circRNA的發(fā)現(xiàn)歷程、特征及分類、環(huán)化生成及調(diào)控機(jī)制、主要功能及在畜禽中的研究進(jìn)展，并對(duì)其在畜禽中的研究進(jìn)展進(jìn)行了展望，以期為進(jìn)一步研究circRNA提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 circRNA的發(fā)現(xiàn)歷程

circRNA是一類新發(fā)現(xiàn)具有環(huán)形結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性RNA分子，廣泛存在于真核生物體內(nèi)［1］。如表1，circRNA的發(fā)現(xiàn)歷程有3個(gè)階段：（1）circRNA真實(shí)存在性；（2）真核生物中circRNA的普遍性；（3）某個(gè)circRNA的功能性研究。

表1 circRNA發(fā)現(xiàn)歷程簡況表

1976年，Sanger和 Kolakofsky［2-3］在植物類病毒和副流感病毒顆粒中首次發(fā)現(xiàn)了circRNA。1979年，Capel等［14］在動(dòng)物細(xì)胞和真菌酵母中發(fā)現(xiàn)circRNA，之后也在其他真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了circRNA，如在小 鼠SRY［14］，大鼠細(xì)胞色素P4502C24［5］、人的P4502C18中［6］等。但由于circRNA結(jié)構(gòu)的特殊性及當(dāng)時(shí)有限的研究手段，認(rèn)為circRNA異常拼接產(chǎn)物。近年來高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)迅速發(fā)展為circRNA的研究提供了契機(jī)。2012年，Danan等［7］在古細(xì)菌發(fā)現(xiàn)circRNA的普遍存在性，并認(rèn)為其可能具有生物學(xué)功能。Salzman等［8］通過RNA-Seq方法在人體中首次鑒定出約80個(gè)circRNA，至此circRNA的研究才正式進(jìn)入人們的視野。

Jeck等［9］在人類的成纖維細(xì)胞中檢測出超過25 000個(gè)circRNA，Memczak等［15］利用高通量測序結(jié)合人類白細(xì)胞數(shù)據(jù)庫鑒定出1 950種人類circRNAs，1 903種小鼠circRNAs和724種線蟲circRNAs，其中人和小鼠中共有81種circRNAs高度保守。隨著大量研究表明，circRNA廣泛存在真核生物等高等動(dòng)物體內(nèi)，并且在基因表達(dá)和機(jī)體生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。例如，circFUT10可抑制牛成肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)分化［11］；circEIF3J和circPAIP2能促進(jìn)母基因的線性轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)［12，16］；circZNF609具有編碼起始密碼子和終止密碼子的開放閱讀框［17］；circCDR1as和circSry可與AGO蛋白形成沉默復(fù)合體抑制翻譯起始［10，18］。目前circRNA被認(rèn)為是一類新的功能大分子，參與基因表達(dá)調(diào)控，豐富了真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的多樣性和復(fù)雜性［9，18］。circRNA的發(fā)現(xiàn)為研究細(xì)胞發(fā)育和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制掀開新的一頁，對(duì)生命活動(dòng)的探索具有重要意義。

2 circRNA的特征及分類

2.1 circRNA的特點(diǎn)

目前發(fā)現(xiàn)，circRNA廣泛存在于不同生物體內(nèi)的各種類型的細(xì)胞和組織中。與線性RNA相比，circRNA是沒有游離的5'帽子和3'Poly（A）尾巴的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。由于其閉鎖的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，circRNA對(duì)RNA外切酶RNaseR不敏感［19］，比線性RNA更穩(wěn)定，不易被降解，大多數(shù)circRNA的半衰期超過48 h，而線性 RNA 的平均半衰期只有約 10 h［9，20］，這可能是circRNA可以抵抗分支酶和核酸外切酶RNase R的降解。但大部分circRNA在血清外泌體中并不穩(wěn)定，半衰期小于15 s［21］，且容易受其他RNA的干擾。癌細(xì)胞和癌組織中circRNA較線性轉(zhuǎn)錄本低［22］，可能是線性轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞中易達(dá)到合成與降解的平衡，而circRNA更加穩(wěn)定，在正常增殖的細(xì)胞中不斷被“積累”，在癌細(xì)胞無限增殖過程中被“稀釋”。circRNA的長度波動(dòng)較大，但在大多數(shù)真核生物中circRNA具有高度的序列保守性［18，23］。全基因組分析發(fā)現(xiàn)來源編碼區(qū)外顯子的circRNA具有高度的序列保守性，但是基因間和內(nèi)含子來源的circRNA保守性相對(duì)較低［18］。

利用一種新的檢測工具CIRI explorer2發(fā)現(xiàn)了同一基因中一些不保守的外顯子只在circRNA中出現(xiàn)，而不存在于線性RNA中。這種只出現(xiàn)在circRNA中的外顯子，是因?yàn)槎鄠€(gè)轉(zhuǎn)錄本在形成成熟線性RNA時(shí)，由于線性RNA的不穩(wěn)定性而被降解掉，還是因?yàn)樵谛纬蒫ircRNA時(shí)由選擇性剪接而特意產(chǎn)生，到目前為止還不清楚。

研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)circRNA在各種生物中表達(dá)豐富，其表達(dá)水平多數(shù)高于母基因的線性轉(zhuǎn)錄本［9，15］。而且circRNA表達(dá)常具有一定的組織、時(shí)序和疾病特異性［15，18］。已知大多數(shù)的 circRNA 屬于非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA）， 但 是 少 數(shù)circRNA含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列（Internal ribosome entry site，IRES）可能具有編碼能力［24-25］。

2.2 circRNA的分類

circRNA來源于母基因的外顯子、內(nèi)含子、非編碼區(qū)、反義鏈轉(zhuǎn)錄本或基因間區(qū)。根據(jù)circRNA序列來源可以分為4大類（表2）［16］：第一類是全部來源外顯子的circRNA（Exonic circular RNA，EciRNA）；第二類是全部來源于內(nèi)含子的circRNA（Intronic circular RNA，ciRNA）第三類是來源于外顯子和內(nèi)含子的circRNA（Exon-intron circular RNA，EIciRNA）；第四類包括來源于反義鏈轉(zhuǎn)錄本的反義circRNA（Antisense circular RNA）、來源于基因間序列或其他未注釋基因組序列的circRNA（Intergenic circular RNA）。絕大多數(shù)circRNA屬于EciRNA，其序列來源于外顯子特別是編碼區(qū)序列。

表2 circRNA 的分類［12，16］

4大類circRNA除了序列來源不同外，還具有以下區(qū)別：（1）EciRNA和EIciRNA整個(gè)分子均是由3'-5'磷酸二酯鍵組成，但是ciRNA接合位點(diǎn)（junction）處由 2'-5'磷酸二酯鍵連接［26］；（2）EciRNA側(cè)翼內(nèi)含子的長度通常大于內(nèi)含子的平均長度，并通常含有反向重復(fù)序列［9，27］；（3）ciRNA通常包含靠近5'剪接位點(diǎn)的7 nt GU富集堿基序列和靠近分支位點(diǎn)（Branchpoint，BP）的11 nt C富集堿基序列［28］；（4）EciRNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中［8，23］，而 EIciRNA 和 ciRNA 主要存在于細(xì)胞核中［26，29］；（5）EciRNA 的序列保守性高于 ciRNA 和基因間circRNA的序列保守性［16］。

3 circRNA的生成和調(diào)控機(jī)制

真核生物RNA是遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)傳遞的中間媒介，遺傳信息在RNA水平上有著廣泛且復(fù)雜的調(diào)控方式，基因在轉(zhuǎn)錄后的pre-RNA要經(jīng)過復(fù)雜的加工才能形成成熟的RNA。單個(gè)基因位點(diǎn)可以通過經(jīng)典可變反向剪接（Alternative backsplicing junctions）及經(jīng)典可變剪接（Alternative splice junctions）產(chǎn)生多種類型的circRNA［30］，因此不同來源的circRNA的生成機(jī)制也不同。

3.1 EciRNA的生成機(jī)制

EciRNA是初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過特殊的反向剪接反應(yīng)（Back-splicing）形成的，是下游外顯子序列5'剪接位點(diǎn)（5' splice site，5'SS）與上游外顯子3'剪接位點(diǎn)（3'splice site，3'SS）反向連接生成了circRNA（圖1）。目前有兩種模型解釋了EciRNA反向剪接形成機(jī)制：（1）依賴于剪接體的套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化模型（外顯子跳躍）（Lariat-driven circularization）（圖 1-B）；（2）內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化模型（Intron-pairing-driven circularization）（圖 1-C）。

套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化是由pre-mRNA在剪接過程中部分RNA發(fā)生折疊，拉近了非相鄰?fù)怙@子距離，發(fā)生外顯子跳躍（Exon skipping）的經(jīng)典剪接（圖1-B）。被跳過外顯子的上游剪接受體（Splice acceptor，SA）和下游剪接供體（Splice donor，SD）共價(jià)結(jié)合形成包含外顯子的套索前體（Exon-containing lariat precursor），該前體通過內(nèi)部剪接去除內(nèi)含子，形成EciRNA［31］。某些個(gè)circRNA中存在線性mRNA缺失的外顯子，保護(hù)了這些外顯子不被降解掉，這說明外顯子跳躍是形成circRNA的合理機(jī)制［8-9］。許多EciRNA側(cè)翼連接點(diǎn)有規(guī)范的剪接信號(hào)［9-10］，經(jīng)典的剪接位點(diǎn)決定了外顯子環(huán)化效率［32］，抑制經(jīng)典剪接體會(huì)導(dǎo)致circRNA水平降低［32］，這些都表明經(jīng)典的剪接體機(jī)制是circRNA生成所必需的。酵母中大多數(shù)的circRNA都是由外顯子套索前體產(chǎn)生［33］。

內(nèi)含子驅(qū)動(dòng)環(huán)化是位于側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)域反向互補(bǔ)序列（Flanking intronic regions reverse complementary sequences，RCSs）（如Alu原件等）（圖1-C）互補(bǔ)配對(duì)，這會(huì)誘導(dǎo)下游外顯子序列的5'SS反向接近上游外顯子3’SS，有效地促進(jìn)了反向剪接的發(fā)生［9］，隨后剪接體切除剩余內(nèi)含子形成環(huán)形RNA分子［34］。當(dāng)內(nèi)含子沒有被完全剪切掉，保留在新生成環(huán)狀外顯子之間，就會(huì)形成EIciRNA類型的分子。

“套索驅(qū)動(dòng)”和“內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)”的主要區(qū)別是先發(fā)生經(jīng)典剪接還是反向剪接［35］。“套索驅(qū)動(dòng)”是先發(fā)生經(jīng)典剪接，產(chǎn)生一個(gè)線性RNA和一個(gè)包含外顯子的內(nèi)含子套索，隨后內(nèi)含子套索通過反向剪接生成circRNA［36］。“內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)”是先發(fā)生反向剪接，并直接生成circRNA［9］。哺乳動(dòng)物中大多數(shù)EciRNA是由內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)生成的，而低級(jí)的真核生物中的EciRNA則是大多由套索驅(qū)動(dòng)生成［33］。

3.2 EciRNA環(huán)化調(diào)控機(jī)制

有研究發(fā)現(xiàn)外顯子環(huán)化與線性剪接競爭剪接因子，進(jìn)而與線性RNA存在競爭關(guān)系，circRNA的環(huán)化效率也受到剪接因子的調(diào)節(jié)［16］，如一些順式元件（cis-acting splicing regulatory elements）和反式原件（trans-acting splicing elements）（圖 1）［16］。

研究發(fā)現(xiàn)單個(gè)外顯子的circRNA（single exon circular RNA）長度通常大于多個(gè)外顯子的circRNA（Multiple exon circular RNA）的平均長度［8］。Eci-RNA側(cè)翼內(nèi)含子含有倒置重復(fù)序列（如Alu等）（圖1-C）［16］，并且通常含有多個(gè)重復(fù)序列［8］。這些序列存在競爭性配對(duì)，調(diào)節(jié)環(huán)化效率并造成可變環(huán)化，致使同一個(gè)母基因可以形成由不同外顯子和內(nèi)含子組成的多樣型circRNA［27-28］。有研究發(fā)現(xiàn)只有30-40 nt短側(cè)翼反向重復(fù)序列就足以促進(jìn)環(huán)化［8］，但這種側(cè)翼區(qū)反向互補(bǔ)重復(fù)序列不一定有效誘導(dǎo)外顯子環(huán)化，大多數(shù)的circRNA由短散在核重復(fù)序列（Short interspersed nuclear elements，SINEs）驅(qū)動(dòng)形成，這說明內(nèi)含子配對(duì)的穩(wěn)定性是circRNA生成的必要條件［37］。

RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）可以通過與內(nèi)含子中一些短的順式元件結(jié)合發(fā)揮作用（圖1-D），促使下游外顯子序列的5'SS反向接近上游外顯子的3'SS，形成有利于反向剪接的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)外顯子環(huán)化［16］。在人和果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)剪接因子盲肌蛋白（Muscleblind，MBL/MBNL1）可以結(jié)合到來源于第二外顯子circMbl的pre-RNA內(nèi)含子的MBL結(jié)合位點(diǎn)，使兩個(gè)內(nèi)含子靠近，從而促進(jìn)circMbl生成［38］。震動(dòng)蛋白（Quaking，QKI）能特異識(shí)別NA-CUAAY核心（core）及UAAY半位點(diǎn)（half-site）［39］，牽拉結(jié)合點(diǎn)相互縮小空間距離，在人類上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）的過程中誘導(dǎo) EciRNA 生成［16］。脂肪瘤融合蛋白（Fused in sarcoma/Translocated in liposarcoma，F(xiàn)US/TLS）可結(jié)合到內(nèi)含子側(cè)翼區(qū)，調(diào)控circRNA的形成［40］。有報(bào)道稱提高RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄延伸率（RNA-Pol II transcription elongation rate）可以增加初始circRNA的表達(dá)水平［41］。

圖1 circRNA的生成示意圖［16］

有報(bào)道發(fā)現(xiàn)RNA編輯酶腺苷脫氫酶（Adenosine deaminase，ADAR）可以結(jié)合RNA雙鏈，通過將腺苷酸轉(zhuǎn)變成肌苷酸（A變成I）（圖1-E）。環(huán)化外顯子側(cè)翼區(qū)重復(fù)序列的雙鏈產(chǎn)生U：I錯(cuò)配，使RNA雙鏈結(jié)合能力減弱［34］。ADAR高表達(dá)會(huì)損傷mRNA前體環(huán)狀配對(duì)序列，減少circRNA的生成［16］。在人和線蟲中發(fā)現(xiàn)，ADAR的缺失造成circRNA的表達(dá)水平異常上升［34］。

EciRNA的生成是多個(gè)順反調(diào)控原件共同調(diào)節(jié)的結(jié)果。例如，Laccase基因的環(huán)化受到內(nèi)含子重復(fù)序列和RNA結(jié)合蛋白的調(diào)控［42］，ADAR也會(huì)減弱RNA的內(nèi)含子配對(duì)，控制circRNA的生成。

3.3 ciRNA的生成機(jī)制

ciRNA是由含有特殊序列內(nèi)含子在剪接過程中逃避脫支酶（Debranching enzyme，DBE）消化形成的circRNA［12］。這類內(nèi)含子在3'SS端的分支位點(diǎn)（BP）附近含有11 nt C富集序列，在5'SS附近含有7 nt GU富集序列（圖2），這些序列形成的特殊結(jié)構(gòu)會(huì)阻止脫支酶與之結(jié)合［16，28］。

剪接過程中兩個(gè)原件結(jié)合先形成包含外顯子和內(nèi)含子的套鎖中間體（Lariat），再在脫支酶和核酸酶作用下形成ciRNA。其過程包括兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)（圖2）：首先分支位點(diǎn)（Branchpoint，BP）的2'-OH攻擊外顯子5'SS，形成內(nèi)含子套索結(jié)構(gòu)，而后5'外顯子的3'-OH攻擊下游外顯子3'SS，釋放線性內(nèi)含子并將外顯子順序連接，最后線性內(nèi)含子釋放3'尾巴后形成2'-5'連接的內(nèi)含子來源的circRNA。正常內(nèi)含子套索則是在脫支酶作用下被解開，再被核酸外切酶消化，而含有11 nt C和7 nt GU特殊序列的內(nèi)含子套索會(huì)限制脫支酶與之結(jié)合，殘余的部分線性RNA序列會(huì)被核酸外切酶降解［12］。不同于EciRNA，ciRNA對(duì)RNA脫支酶不敏感，并含有2'-5'接合點(diǎn)（Junction）［26］。ciRNA和 EIciRNA 主要存在于細(xì)胞核中調(diào)控基因表達(dá)［16］。

也有研究發(fā)現(xiàn)前體tRNA能剪切成環(huán)形成tricRNA（tRNA intronic circRNA）［43］，tRNA 剪接內(nèi)切酶復(fù)合體通過識(shí)別前體tRNA內(nèi)特殊的膨脹-螺旋-膨脹（BHB）的結(jié)構(gòu)序列，切除反密碼子環(huán)中的內(nèi)含子［38］，此部分內(nèi)含子兩端相連接形成tricRNAs［44］。有研究報(bào)道，在白血病患者中的PML/RARα基因上發(fā)現(xiàn)，了2個(gè)因染色體異位融合的 circRNA（fusion circRNA，f-circRNA）［45］。因此，circRNA的生源機(jī)制有待進(jìn)一步探索明確。

4 circRNA的功能

circRNA廣泛存在于各個(gè)物種中，大多數(shù)真核生物的circRNA具有序列保守性，表達(dá)呈現(xiàn)一定的組織特異性和發(fā)育階段性，這表明circRNA是一種功能分子。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)circRNA具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯、吸附miRNA等功能，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)一些circRNA具有編碼多肽的能力（圖3）。

圖2 ciRNA的生成機(jī)制［12］

4.1 circRNA可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄

圖3 circRNA功能示意圖［46］

CircRNA可與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄（圖3-B）。EciRNA可以與細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)分子特異性結(jié)合，作為腳手架（Scaffold）與RNA或DNA結(jié)合，為RBP、RNA、DNA之間互作提供平臺(tái)。這些轉(zhuǎn)錄因子包括 RNA 聚合酶 II、Quaking（QKI）［16］、EIF4A3［47］和 MBL［38］等。例如，circMbl上含有MBL 結(jié)合位點(diǎn)［32］，而 MBL 會(huì)促進(jìn)circMbl和MblmRNA的生成。因此circMbl作為自我調(diào)節(jié)分子會(huì)減少circMbl和MblmRNA的合成［48］，提高果蠅和人細(xì)胞內(nèi)線性剪接水平，會(huì)使circRNA的生成量明顯減少［49-50］。細(xì)胞核中位于轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近的內(nèi)含子錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域52（ci-ankyrin repeat domain 52，ci-ankrd 52）和內(nèi)含子沉默信息調(diào)節(jié)因子7（Silent information regulator 7，ci-sirt 7）［26］， 可 聯(lián) 合 RNA聚合酶II復(fù)合體，順式調(diào)節(jié)母基因的線性轉(zhuǎn)錄本表達(dá)。circEIF3J和circPAIP2會(huì)與U1小核核糖核蛋白（U1 small nuclear ribonucleoprotein，U1 snRNP）相互作用于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游300 bp處，順式方式調(diào)控母基因線性轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄［12，16］。circRNA還可以通過與線性轉(zhuǎn)錄本競爭剪接的方式調(diào)控母基因的表達(dá)。線性剪接與反向剪接的競爭決定了circRNA和母基因線性轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。來源于小鼠甲酸精基因（Formin，F(xiàn)mn）的circFmn包含了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，遺留了一個(gè)非編碼的線性轉(zhuǎn)錄物，因此circFmn可作為mRNA陷阱（mRNA trap）隔離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，降低Fmn蛋白的表達(dá)水平［51］。

4.2 circRNA與蛋白質(zhì)相互作用

也有報(bào)導(dǎo)circRNA與RBP結(jié)合能發(fā)揮生物學(xué)功能（圖3-D）。circCDR1as和circSry可與miRNA的效應(yīng)因子AGO相結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）［10，18］，占據(jù)了mRNA的翻譯起始位點(diǎn)，抑制翻譯起始。CircANRIL可與pre-rRNA競爭性結(jié)合PES1蛋白，抑制核酸外切酶對(duì)結(jié)合PES1蛋白后的pre-rRNAs加工過程［52］，表明circANRIL影響核糖體成熟，阻礙蛋白質(zhì)翻譯，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。circFOXO3與細(xì)胞周期依賴性激酶2（Cyclin-dependent kinase 2，CD-K2）、P21形 成circFOXO3-CDK2-P21三 元 復(fù)合物抑制細(xì)胞周期［53］。CDK2與細(xì)胞周期蛋白E（Cyclin E）結(jié)合形成cyclin E-CDK2復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞G1期向S期過度；CDK2也可與細(xì)胞周期蛋白A（Cyclin A）結(jié)合形成cyclin A-CDK2復(fù)合物，促使細(xì)胞完成S期。P21結(jié)合CDK2可抑制CDK2與cyclin A、cyclin E的結(jié)合，circFOXO3-CDK2-P21三元復(fù)合物增強(qiáng)了P21對(duì)CDK2的抑制作用，避免了cyclin E-CDK2復(fù)合物的形成，阻斷細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，同時(shí)也避免了cyclin A-CDK2復(fù)合物的形成，使細(xì)胞停滯在S期或發(fā)生凋亡。circFOXO3在細(xì)胞質(zhì)中還可以與抗衰老相關(guān)蛋白分化抑制因子1（Inhibitor of differentiation-1，ID1）、E2F1 轉(zhuǎn)錄因子（E2F transcription factor 1，E2F1）以及抗應(yīng)激黏著斑激酶（Facal adhesion-associated protein kinase，F(xiàn)AK）、HIF1α結(jié)合，阻礙這些蛋白進(jìn)入細(xì)胞核或線粒體，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞衰老［54］。

4.3 circRNA作為miRNA海綿

MicroRNA（miRNA） 是 一 種 大 約 22 nt的ncRNA分子，通過與目的基因mRNA的3’UTR結(jié)合降低目的基因的表達(dá)水平。circRNA含有大量的miRNA應(yīng)答原件（miRNA response elements，MREs），可吸附miRNA（圖3-A），發(fā)揮miRNA海綿功能，降低miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用。由此可見circRNA可作為競爭性內(nèi)源RNA（Competing endogenous，ceRNA）在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)［16］。例如，來源于小腦退行性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄本（Cerebellar degeneration-related 1 antisense transcript，CDR1as）的circRNA 具有 70個(gè) miR-7結(jié)合位點(diǎn)，可調(diào)控胰島素受體底物1（Insulin receptor substrate-1，IRS-1）等多個(gè)靶基因的表達(dá)［18］。有研究表明miR-671與CDR1as結(jié)合后會(huì)使得CDR1as裂解，并可釋放與之結(jié)合的miR-7［55］。阿格蛋白（Argonature，AGO）可與CDR1as結(jié)合，使CDR1as免于降解及結(jié)合miR-7。circHIPK3可結(jié)合miR-124-3p和miR-338-3p調(diào)控β細(xì)胞Slc2a2、Akt1、Mtpn等關(guān)鍵基因表達(dá)［56］。來源于Y染色體性別決定基因（Sex-determining region Y，SRY）的circSry具有16個(gè)miR-138結(jié)合位點(diǎn)，可吸附miR-138調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲、發(fā)展和轉(zhuǎn)移［55，57］。circFUT10可以結(jié)合 miR-133a進(jìn)而抑制牛成肌細(xì)胞增值、促進(jìn)分化［11］；circMTO1可以吸附miR-9抑制人肝癌細(xì)胞增值性和侵染性［58］；circZFR可吸附miR-130a和miR-107抑制人胃癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡［59］；circRBFOX2s可吸附miR-206促進(jìn)雞成肌細(xì)胞增殖［60-61］。對(duì)比lncRNA等線性miRNA海綿分子，circRNA不易被RNA外切酶降解，具有較高的穩(wěn)定性和時(shí)效性［16，58］。一些研究表明哺乳動(dòng)物中的circRNA很少包含大于10個(gè)以上的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，這可能與circRNA本身的穩(wěn)定性有關(guān)［36］

4.4 circRNA可翻譯功能蛋白質(zhì)

有些circRNA含有可編碼多肽。目前報(bào)道的circRNA翻譯機(jī)制有兩種：（1）依賴內(nèi)部核糖體嵌入位點(diǎn)（Internal ribosomal entry site，IRES）（圖3-C）；（2）依賴 N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）甲基化修飾。人circSHPRH可利用重疊密碼子翻譯功能蛋白質(zhì)抑制膠質(zhì)瘤生成［13］。丁型肝炎病毒（Hepatitis D virus，HDV）核心的負(fù)鏈circRNA可編碼122個(gè)氨基酸的HDV抗原（Hepatitis D virus antigen，HDAg）［62］。 人circ-FBXW7也 含 有 IRES，可編碼21 kD的蛋白質(zhì)，抑制U251和U373癌細(xì)胞的增殖［63］。部分circRNA雖無IRES，仍能結(jié)合核糖體啟動(dòng)翻譯。如在人和小鼠的成肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)具有開放閱讀框（Open reading frame，ORF）［17］的circZNF609可翻譯蛋白質(zhì)。Pamudurti等［64］在果蠅大腦組織中通過核糖體印跡鑒定出circMBL的終止密碼子處有核糖體結(jié)合，并通過蛋白質(zhì)譜分析得到了circRNA翻譯的蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)m6A甲基化修飾會(huì)促進(jìn)circRNA的翻譯［17］，皆因此類circRNA起始密碼子上含有RRACH（R=G或A；H=A、C或U），該序列中的A堿基可被甲基化酶復(fù)合體METTL3/14甲基化，促使YTHDF3可之結(jié)合，并招募eIF4G2和其他翻譯起始因子，啟動(dòng)circRNA的翻譯［17］。此cricRNA沒有終止密碼子，若翻譯起始，circRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可使核糖體通過類似滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle ampli fi cation，RCA）的機(jī)制參與多肽延長。

4.5 circRNA參與細(xì)胞通訊和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

也有報(bào)道circRNA可調(diào)控細(xì)胞通訊和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。血清等外泌體的circRNA與胞質(zhì)中存在顯著差異，表明circRNA進(jìn)入外泌體是一個(gè)選擇性過程，可能作為細(xì)胞間物質(zhì)傳遞、信息交流的途徑［29］。分泌小泡（含外泌體）中circRNA比線性RNA比例較高［65］，表明分泌小泡是細(xì)胞選擇性釋放和清除內(nèi)源性circRNA的一種機(jī)制。CircRNA也可調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，例如mcircRasGEF1B可調(diào)控脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的細(xì)胞間黏附因子（ICAM-1）mRNA的穩(wěn)定性，敲低mcircRasGEF1B會(huì)影響LPS誘導(dǎo)的ICAM-1的表達(dá)［66］。

綜上所述，circRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的分子，具有不同的分子特點(diǎn)和形成機(jī)制，關(guān)于其功能研究還有待深入。circRNA在物種中具有較高的序列保守性，具有調(diào)控機(jī)體生長發(fā)育和新陳代謝的功能，在遺傳品種改良和品系選育的工作中，有望作為分子育種的新靶點(diǎn)。

5 circRNA在畜禽中的研究進(jìn)展

畜禽的經(jīng)濟(jì)性狀與疾病防控是動(dòng)物科學(xué)關(guān)注的重點(diǎn)。近年來，circRNA在該領(lǐng)域的研究也是如火如荼，為挖掘農(nóng)業(yè)動(dòng)物重要經(jīng)濟(jì)性狀遺傳機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新思路。

5.1 circRNA在家畜中的研究進(jìn)展

家畜繁殖機(jī)能、生長發(fā)育、肌肉發(fā)育、脂肪沉積、產(chǎn)毛（絨）量、產(chǎn)奶量和疾病發(fā)生等是畜牧業(yè)關(guān)注的重要經(jīng)濟(jì)性狀。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA參與家畜大腦、卵巢、肌肉、脂肪、心臟、肝臟和乳腺等性狀的發(fā)育和疾病發(fā)生過程。

在肌肉和脂肪發(fā)育方面，Liang等［67］從貴州小型豬脂肪、心肌等9種不同組織及3個(gè)發(fā)育階段的骨骼肌中鑒定出了5 934個(gè)circRNA，繪制了豬circRNA的時(shí)空表達(dá)譜，確定了149個(gè)與肌肉生長發(fā)育、肌肉收縮、染色質(zhì)修飾、陽離子平衡、ATP水解耦合的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞緊密連接及鈣離子信號(hào)通路有關(guān)的circRNA。并構(gòu)建了首個(gè)小型豬的circRNA數(shù)據(jù)庫。Chen等［68］采集180 d和8年雅南母豬的心肌和背最長肌，通過RNA-seq發(fā)現(xiàn)了心肌樣本中26個(gè)mRNA、4個(gè)lncRNA、22個(gè)miRNA和26個(gè)circRNA差異表達(dá)；骨骼肌樣本中81個(gè) mRNA、5個(gè) lncRNA、79個(gè) miRNA和 62個(gè)circRNA差異表達(dá)，由此可見心肌和骨骼肌的衰老過程中存在差異。在肌肉老化過程中，Chen等［68］還評(píng)估了多重共調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，為研究肌肉老化的分子機(jī)制提供了良好的基礎(chǔ)。Sun等［69］研究藍(lán)塘豬和長白豬肌肉組織中差異表達(dá)的編碼基因、lncRNA、circRNA及miRNA，結(jié)果在藍(lán)塘豬中發(fā)現(xiàn)有1 401個(gè)circRNA高表達(dá)，2 959個(gè)circRNA低表達(dá)，其中有236個(gè)是與肌肉發(fā)育相關(guān)的，并發(fā)現(xiàn)有40個(gè)circRNA參與miRNA介導(dǎo)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

Li等［70］利用RNA-Seq方法研究胚胎期和成年期哈薩克羊背最長肌組織中的circRNA，共鑒定出6 113個(gè)circRNA，功能分析發(fā)現(xiàn)circRNA的母基因主要富集在肌肉生長和發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路，oar_circ_0000385、oar_circ_0000582和 oar_circ_0001099具有肌肉發(fā)育相關(guān)miRNA的多重保守位點(diǎn)。Wei等［71］分析胚胎期和成年期秦川牛的背最長肌中差異表達(dá)的circRNA，共鑒定出12 981個(gè)circRNA，其中有624個(gè)在成年牛中高表達(dá)，204個(gè)低表達(dá)。典型的是circLMO7，過表達(dá)circLMO7會(huì)吸附miR-378a-3p抑制成肌細(xì)胞分化，使得細(xì)胞周期中S期細(xì)胞數(shù)量增加，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量減少，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。同課題組Li等［11］發(fā)現(xiàn)circFUT10可以結(jié)合miR-133a促進(jìn)成肌細(xì)胞分化，使得細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞數(shù)量增加，S期細(xì)胞數(shù)量減少，抑制細(xì)胞增值，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Li等［72］發(fā)現(xiàn)circFGFR4可以吸附miR-107，促進(jìn)Wnt3a基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞增殖沒有顯著影響。

在大腦和生殖系統(tǒng)研究方面，Ven?等［73］對(duì)豬胚胎發(fā)育期大腦組織測序共發(fā)現(xiàn)4 634個(gè)circRNA具有時(shí)間表達(dá)差異，皮質(zhì)部circRNA的表達(dá)豐度最高，這表明circRNA對(duì)于豬胚胎期腦部發(fā)育具有重要調(diào)控作用。Li等［74］利用RNA-seq研究產(chǎn)前、產(chǎn)后哈薩克羊腦垂體中差異表達(dá)的circRNA發(fā)現(xiàn)，大量的circRNA參與垂體激素分泌及相關(guān)通路，oar_circ_0000059具有58個(gè)與垂體相關(guān)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，并且40個(gè)circRNA包含至少1個(gè)IREs和ORF，這表明circRNA廣泛參與垂體的發(fā)育和分泌功能。Tao等［75］通過麻城黑山羊和波爾山羊排卵前后卵泡組織RNA-seq分析，共檢測出1 395個(gè)circRNA，其中有37個(gè)差異表達(dá)。GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)大量circRNA參與卵巢類固醇生成和P53信號(hào)通路。其中chi_circ_0008219可與3個(gè)卵泡相關(guān)的miRNA相結(jié)合，表明circRNA對(duì)母羊卵巢卵泡有潛在影響。

在泌乳性能研究方面，Zhang等［76］研究產(chǎn)后90 d和250 d荷斯坦奶牛乳腺組織中差異表達(dá)的circRNA，共鑒定出6 621個(gè)circRNA，其中有2 231個(gè)共表達(dá)。功能富集分析發(fā)現(xiàn)來源于4個(gè)酪蛋白 編 碼 基 因（CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3）的circRNA在90 d奶牛乳腺組織中高表達(dá)，這些circRNA也具有miR-2284的結(jié)合位點(diǎn)，而miR-2284可與CSN1S1和CSN2的mRNA結(jié)合，由此猜測這些circRNA可能參與酪蛋白的表達(dá)調(diào)控。Zhu等［77］對(duì)分娩后1、7和21 d大鼠的乳腺組織高通量測序，發(fā)現(xiàn)并鑒定了來源于Tc2n基因Exon10和Exon11的circRNA（cTc2n）。定量檢測發(fā)現(xiàn)cTc2n在乳腺中高表達(dá)。cTc2n在這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化呈現(xiàn)先顯著下降、后輕微上升的趨勢，而Tc2nmRNA呈現(xiàn)相反的趨勢。生信分析發(fā)現(xiàn)cTc2n不存在miRNA結(jié)合位點(diǎn)，而Exon10和Exon11編碼Tc2n蛋白的保守區(qū)域，推測cTc2n可抑制Tc2nmRNA的產(chǎn)生。

在動(dòng)物疾病發(fā)生研究方面，小鼠作為畜牧學(xué)科研究的模式動(dòng)物，在家畜研究中應(yīng)用廣泛，尤其是在疾病研究方面。Pei等［78］通過將小鼠暴露在氡輻射的條件中，通過對(duì)肺組織RNA-aeq發(fā)現(xiàn)107個(gè)circRNA上調(diào)，83個(gè)circRNA下調(diào)，其中30個(gè)高表達(dá)的circRNA具有多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，表明circRNA可能參與氡誘發(fā)的肺損傷的病理變化。Huang等［79］對(duì)水迷宮測試后的5月齡、10月齡SAMP8鼠和SAMR1鼠的海馬體RNA-seq，發(fā)現(xiàn)mmu_circRNA_017963與自噬體組合、胞外分泌、細(xì)胞凋亡、RNA剪接、突觸囊泡循環(huán)等多個(gè)過程，表明circRNA參與阿茲海默癥的發(fā)生。Errichelli等［40］通過體外培養(yǎng)老鼠和人的胚胎干細(xì)胞，改變RNA結(jié)合蛋白FUS的表達(dá)水平，檢測circRNA的變化，發(fā)現(xiàn)FUS可結(jié)合到側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)，調(diào)節(jié)circRNA的形成。關(guān)于人腫瘤研究中，活體實(shí)驗(yàn)常在小鼠皮下異體移植人癌變的腫瘤，再通過注射過表達(dá)載體或干擾片段來改變特定circRNA的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)circRPKCI［80］、circ-Amotl1［81］、circCDYL［82］、circHIPK3［83-84］、hsa_circ_0007385［85］、hsa_circ_00126-73［86］、circCCDC66［87］和 circRNA_100782 等 circRNA 分子可促進(jìn)腫瘤生長，circ-FBXW7［63］、circ-ITCH［88］、circC3P1［89］、circFoxo3［90］和cirZKSCAN1［91］等circRNA分子可抑制腫瘤生成。

5.2 circRNA在家禽中的研究進(jìn)展

在家禽的研究中，circRNA在生長發(fā)育、肌肉發(fā)育、產(chǎn)蛋量和疾病防治中的作用是人們主要關(guān)注的內(nèi)容。

Ouyang等［60-61］采 集 11胚 齡（E11）、16胚齡（E16）、1日齡（P1）杏花雞母雞的腿肌，通過RNA-seq共鑒定出13 377個(gè)circRNA，其中有1 470個(gè)差異表達(dá)，有946個(gè)circRNA具有一個(gè)或多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，共涉及150個(gè)已知miRNA分子。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)雞circRBFOX2.2-3和circRBFOX2.2-4可吸附miR-206，促進(jìn)雞成肌細(xì)胞增殖，抑制成肌細(xì)胞分化，雞circSVIL.6-14可結(jié)合miR-203，促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖和分化［12，92］。利用iTRAQ技術(shù)鑒定出差異表達(dá)蛋白，并與circRNA的數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，結(jié)果在E11 和 P1比較組發(fā)現(xiàn)23個(gè)差異蛋白基因具有差異表達(dá)的circRNA。包括肌肉收縮通路相關(guān)的基因DMD、TNNT3、TNN、TPM1、TPM2和TPM3，其中DMD和TNN基因含有多個(gè)差異的circRNA［60］。由此可見，在雞胚胎期肌肉發(fā)育過程中，circRNA通過吸附miRNA或參與調(diào)控蛋白表達(dá)等方式調(diào)控肌肉發(fā)育。

此外，Zhang等［93］用雞禽白血病 J（ALV-J）亞型侵染ALV抗性和ALV敏感性雞，20周后采集肝臟組織。RNA-seq鑒定出1 800多個(gè)circRNA，其中有32個(gè)circRNA差異表達(dá)。且發(fā)現(xiàn)在ALV抗性組中的12個(gè)circRNA存在多個(gè)miRNA分子結(jié)合位點(diǎn)，基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)主要集中于免疫通路。這表明circRNA可能參與ALV-J引起的免疫過程。

6 展望

目前對(duì)于circRNA的研究仍處于起步階段，有大量技術(shù)問題需要突破。隨著高通量測序和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，將會(huì)有越來越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)，其功能研究會(huì)越來越深入。circBase［94］、Circ2Traits［95］、CircNet［96］等數(shù)據(jù)庫中收錄了近 10萬circRNA測序結(jié)果，并能預(yù)測circRNA-miRNA-mRNA相互作用。circRNA過表達(dá)載體和干擾手段不斷趨于成熟，使人工調(diào)控細(xì)胞內(nèi)circRNA的表達(dá)成為可能，利于進(jìn)一步探索circRNA的功能［18，97］。CircRNA與疾病發(fā)生密切相關(guān)，可作為癌癥等疾病監(jiān)測的新型靶標(biāo)分子［58］。在畜禽研究方面，主要集中在生長發(fā)育、肌肉發(fā)育等經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的circRNA的研究。對(duì)于circRNA的功能注釋僅限于circRNA的來源編碼基因或可能的miRNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析，因此需進(jìn)一步探索circRNA作用網(wǎng)絡(luò)，研究circRNA在基因表達(dá)調(diào)控的作用，加深畜禽的經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)circRNA的篩選與鑒定，更好的為畜禽分子育種提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。