阿魏蘑雜交育種研究

翟陽陽 宋金俤* 吳成龍 曹艷芳 蔣 寧

（1.江蘇蕈源種業(yè)科技有限公司，江蘇 南京 211302；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院，江蘇 南京 210014）

阿魏蘑（Pleurotus nebrodensis），又名白靈菇、白阿魏蘑，多叫白靈菇，隸屬于擔子菌亞門（Basidiomycotina），傘菌綱（Agaricomycetes），傘菌目（Agaricales），側(cè)耳科（Pleurotaceae），側(cè)耳屬（Pleurotus）。野生阿魏蘑僅生長在我國新疆天山、塔城的阿魏灘上。其生長方式為寄生或腐生。寄主主要為傘形花科植物阿魏、刺芹的腐爛根莖。因其口味上佳，營養(yǎng)豐富，被譽為“草原上的牛肝菌” “素鮑魚” “蠔菇王”等。

據(jù)國家食品監(jiān)督檢驗中心檢測，阿魏蘑子實體干品中蛋白質(zhì)、脂肪、灰分、粗纖維、碳水化合物、多糖含量分別為 17.7%、4.31%、4.8%、15.4%、43.2%、19%[1]。所含人體必需氨基酸占氨基酸總量的35%，高于一般食用菌的25%。其中，賴氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的含量明顯高于其他側(cè)耳屬品種[2]。有報道指出，阿魏蘑子實體中的多糖具有提高人體非特異性免疫功能和特異性細胞免疫功能的作用[3]。因此，它是一種高蛋白、低脂肪，富含礦質(zhì)元素和維生素D[4]等的優(yōu)質(zhì)珍稀食用菌。

阿魏蘑原基為球狀或短棒狀，子實體多單生。子實體農(nóng)藝性狀因母種菌株的不同而表現(xiàn)出較大的差異，現(xiàn)工廠化主栽品種以掌狀、扇形為主，野生阿魏蘑有馬蹄狀、柱狀及不規(guī)則形。子實體表面白色或暗黃色，有些菌株子實體表面有微紋，單朵產(chǎn)量重者可達500 g以上?；肯掳蓟蚱秸?，具有一定的向光性，菌蓋直徑 80～200 mm，菌柄長短粗細不一，肉質(zhì)中實脆嫩，具特殊香味。

阿魏蘑工廠化生產(chǎn)過程大體可概括為菌種制備→制包接種→發(fā)菌→后熟→冷（溫差）刺激→搔菌→催蕾→疏蕾→采收→包裝儲存、運輸→銷售。阿魏蘑對生長環(huán)境要求嚴格，生產(chǎn)周期長，成本較高。自1983年在新疆地區(qū)成功實現(xiàn)人工栽培以來，雖然國內(nèi)工廠化生產(chǎn)企業(yè)逐步增加，但仍無法滿足市場需求。國內(nèi)其他地區(qū)由于栽培時間較短，經(jīng)驗不足，對其生物學特性研究不夠透徹，加之菌種退化快等原因，導(dǎo)致工廠化生產(chǎn)中易出現(xiàn)畸形菇多、產(chǎn)量低或菌包不出菇等現(xiàn)象，嚴重影響生產(chǎn)企業(yè)的積極性，制約了阿魏蘑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

食用菌的育種方法主要有野生菌株馴化育種、孢子分離育種、誘變育種及原生質(zhì)體融合育種。目前，孢子分離育種與分子標記結(jié)合起來成為一種新的食用菌育種方法[5]。本研究主要是通過 ISSR及RAPD分子標記技術(shù)，分析鑒別各供試菌株之間的親緣關(guān)系及遺傳相關(guān)性，結(jié)合各菌株的農(nóng)藝性狀確定雜交親本。通過單孢雜交育種并對得到的雜交菌株進行 ISSR分子標記，鑒定其是否屬于新品種，作出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗病阿魏蘑新品種選育。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試親本菌株共計 26種，來源及菌絲體性狀詳見表1。

1.2 試驗方法

（1）培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來水1 L，pH自然。原種和栽培種培養(yǎng)基：棉籽殼45%，玉米芯24%，麩皮20%，木屑10%，石灰1%，水分62%～64%，pH 7.5。

表1 供試菌株基本性狀

（2）供試菌株RAPD與ISSR分子標記鑒定。本研究ISSR與RAPD分子標記鑒定供試菌株委托南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司進行。由于供試菌株香阿魏與1505-2野阿魏是野生采集分離的菌株，所以利用 ISSR分子標記來鑒定它們是否屬于阿魏蘑的一類。其余24個供試菌株則采用RAPD分子標記技術(shù)分析鑒定它們之間的遺傳差異。具體操作參照①食用菌菌種真實性鑒定 RAPD法，標準編號：NY/T 1743-2009；②食用菌菌種真實性鑒定 ISSR法，標準編號：NY/T 1730-2009。

（3）供試菌株品比試驗。根據(jù)栽培料配方稱取原料，加水拌勻，使栽培料水分達到62%～64%。將每個供試菌株經(jīng)母種階段擴繁培養(yǎng)后，接種于18×33（cm）栽培料包進行暗室恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24±2 ℃，時間45天左右，每個菌株接種50包，設(shè)置3個重復(fù)。待菌絲長滿菌包后進行一段時間的后熟培養(yǎng)，后熟期一般為 60天。成熟的標志是菌包變軟，富有彈性，而部分品種菌包會出現(xiàn)較厚的菌被。然后將菌包移入冷房進行出菇管理[6]。

①冷刺激：菌包移入冷房后，設(shè)定溫度-3～3 ℃，關(guān)閉燈光，維持7天。②搔菌催蕾：完成低溫刺激后，打開袋口，用鑷子去除接種塊，進行催蕾。催蕾時同樣需要溫差刺激，高溫維持在 15～18 ℃，低溫維持在5～8 ℃，每天重復(fù)5次。濕度設(shè)定為85%～95%。在保證溫濕度的前提下，盡可能通入經(jīng)過濾的新風使 CO2濃度維持在 1 000 mg/kg以下。出菇房光照強度在300 lx以上，10～15天在搔菌處即出現(xiàn)球狀或柱狀的原基。③疏蕾：隨著原基的生長，某些菌株的原基叢生現(xiàn)象較為嚴重，需用刀具修去生長弱或靠近袋口邊緣的小菇蕾。原基生長至乒乓球大小時保留 1～2個使其繼續(xù)生長。④整個出菇階段控制溫度為8～16 ℃，濕度85%～95%，CO2濃度900～3 000 mg/kg，光照強度大于300 lx。采收稱重，觀察記錄各項農(nóng)藝性狀。

（4）單孢雜交[7]。①雜交親本的選擇：阿魏蘑單孢雜交育種是運用具有不同的遺傳特性的單核菌絲體進行雜交，選育出具有優(yōu)良性狀的雜交異核體。因此，雜交親本需具有不同的優(yōu)點。從RAPD與 ISSR分子標記的試驗結(jié)果可以得知供試菌株的遺傳相似性等信息。冷房品比試驗結(jié)果可獲得供試菌株的產(chǎn)量及各項農(nóng)藝性狀。根據(jù)兩項試驗結(jié)果選擇產(chǎn)量高，菇形好，菇質(zhì)優(yōu)，抗性強，管理相對方便的菌株作為新品種選育的雜交親本。②孢子收集：親本確定后，選取具有親本典型性狀的待收集孢子的3個，至成熟后采收。用酒精將菇體擦拭干凈，無菌水沖洗3次，無菌紗布吸干表面水分，用刀具切割成適合于固定在實驗室自制的廣口玻璃瓶孢子收集器上的小菇塊。菌褶面向下，用無菌紗布包好瓶口，靜置12～18 h，收集孢子印。為保證收集的孢子純正，有關(guān)操作需在超凈工作臺上完成。③獲取單核體菌絲：采用連續(xù)稀釋法，即用接種環(huán)蘸取2～3次孢子放入10 mL無菌水中，搖勻后吸取1 mL孢子液到9 mL的無菌水中，再次搖勻吸取1 mL孢子液到9 mL無菌水中，以此類推。稀釋至 106個/mL后將孢子液涂布于平板培養(yǎng)基。25 ℃恒溫避光培養(yǎng)，待孢子萌發(fā)菌落直徑達5 mm左右移至斜面培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。然后用接種針挑取部分菌絲制成水玻片觀察是否具有鎖狀聯(lián)合。未出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合的菌絲認定為單核菌絲，并進行編號。④配對雜交：確定雜交親本組合，將所得單核菌絲經(jīng)過篩選后一一配對雜交，具體操作是用7 mm打孔器獲取的接種塊彼此相距1～2 cm接種于平板培養(yǎng)基上，放入 25 ℃恒溫箱內(nèi)避光培養(yǎng)。至兩菌落菌絲交合后挑取交合處菌絲放置顯微鏡 40倍鏡下觀察有無鎖狀聯(lián)合。保留出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合的雜交組合，未出現(xiàn)則說明兩單核菌絲雜交不親和，予以淘汰。

（5）雜交菌株的篩選。①拮抗試驗：拮抗試驗是鑒定菌株間遺傳差異的傳統(tǒng)方法，菌絲之間的拮抗反應(yīng)是菌株間不同遺傳特性的重要表現(xiàn)[8]。利用三點法將具有鎖狀聯(lián)合的雜交菌株分別與親本進行拮抗試驗，觀察是否出現(xiàn)拮抗線。只有在培養(yǎng)基上兩兩出現(xiàn)拮抗線，才說明雜交成功，產(chǎn)生了新的性狀[9]。排除與親本未出現(xiàn)明顯拮抗線的雜交組合。②母種階段菌絲生長速度的測定：將符合預(yù)期要求的雜交組合與親本同時接種于平面培養(yǎng)基，每個組合菌株接種5個培養(yǎng)皿，置于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)，每隔1天觀察一次。記錄每個雜交菌株菌絲的顏色、密度及生長勢。待其中一菌株培養(yǎng)皿內(nèi)菌絲長滿培養(yǎng)基時結(jié)束培養(yǎng)，測量其他培養(yǎng)皿內(nèi)菌落直徑。③培養(yǎng)料內(nèi)菌絲生長速度的測定：新雜交菌株接種到培養(yǎng)料后，待菌絲生長至瓶肩，選取各雜交菌株生長一致的3個菌包進行劃線標記，測量菌絲的吃料速度。④瓶栽品比試驗：按比例配制培養(yǎng)料，加水拌勻后含水量在62%～64%，每瓶約裝入干料270 g，高壓滅菌2.5 h，冷卻后接種。每種雜交菌株與親本接種20瓶，設(shè)置3個重復(fù)，放入培養(yǎng)室內(nèi)25 ℃避光培養(yǎng)。待菌絲蓋面時開始每3天測量菌絲的生長速度并觀察其生長勢，共測量5次。菌絲長滿培養(yǎng)瓶并完成后熟后，移入冷房進行出菇管理，觀察記錄每個雜交菌株與親本的產(chǎn)量及菇體色澤、形狀、厚度等農(nóng)藝性狀。計算各菌株的生物學效率，篩選出符合研究目的的雜交菌株。⑤雜交菌株分子鑒定：采用 ISSR分子標記技術(shù)對篩選出的目的雜交菌株進行鑒別，操作參照1.2（2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株遺傳分析

由于使用的是單鏈引物而且擴增的序列是未知的，因此使用分子標記前要先篩選引物。本試驗由115條引物中篩選出22條擴增條帶清晰、重復(fù)性好的引物。22條引物將供試26個菌株共擴增出37條清晰易辨的多態(tài)性 DNA條帶。圖 1為引物S99、S124對26個供試菌株擴增的ISSR電泳圖譜。

圖1顯示，某一位置有明顯條帶的記為“1”，沒有 條帶的記 為 “0”，建立“0、1”矩陣。利用NTSYSpc2.10生物軟件構(gòu)建供試菌株的遺傳關(guān)系樹狀圖，進行菌株間遺傳相似性分析。

圖2為篩選后的22條引物將供試菌株擴增和由相關(guān)軟件分析后得到的聚類分析樹狀圖。由圖 2可知，當遺傳系數(shù)為0.28時，可將供試菌株分為兩類，菌株1505-2野阿魏和香阿魏聚為一類，其余供試菌株聚為另一類；當遺傳系數(shù)為0.53時，供試菌株分為Ⅴ類，第Ⅰ類為白靈 00489、北京白靈、白靈A1、上海高白靈、白靈509、白靈菇、白靈00619、A25、A18、A28、A12、50869、A30、A32、華中白靈、白靈參寶、A1、A8、A6、A14、白靈901；第Ⅱ類為608；第Ⅲ類為白靈A19；第Ⅳ類為A16；第Ⅴ類為1505-2野阿魏、香阿魏。1505-2野阿魏和香阿魏為野生采集的菌株，通過分析屬于阿魏蘑菌株，且與其他供試菌株之間的遺傳相似系數(shù)小，可能存在較大的雜交優(yōu)勢。第Ⅰ類供試菌株根據(jù)不同遺傳系數(shù)又能分為不同的類別，在遺傳系數(shù)為0.73時又可分為五小類。

圖1 引物S99、S124 ISSR指紋圖譜

圖2 供試阿魏蘑菌株遺傳關(guān)系樹狀圖

2.2 供試菌株品比試驗結(jié)果

將完成由營養(yǎng)生長到生殖生長的各供試菌株出菇菌包移入同一間冷房進行出菇品比試驗，以保證各種生長條件基本相同，排除環(huán)境因素帶來的干擾。

（1）出菇同步性。阿魏蘑菌包出菇性狀包括現(xiàn)蕾的時間、子實體的性狀（大小，形狀）和采收時間的一致性。這反映了工廠化生產(chǎn)期間阿魏蘑出菇管理的難易程度。菌包經(jīng)受冷刺激后，各出菇菌包在較短時間內(nèi)同時出現(xiàn)原基，子實體大小、形狀基本相同，能夠同時采收，說明該菌株出菇一致性高，管理較容易。表2為本次試驗中26個供試菌株的出菇一致性統(tǒng)計表，催蕾期為從開袋冷刺激催蕾到開始現(xiàn)蕾所需的時間，其時間長短從一定程度上反映了該菌株生長勢和生產(chǎn)成本的高低；現(xiàn)蕾期和采收期分別為菌包開始現(xiàn)蕾至全部菌包完成現(xiàn)蕾所需的時間和開始采收至采收結(jié)束的時間；育菇時間為菌株平均每菌包從現(xiàn)蕾到采收所需時間，育菇時間長短反映子實體的生長速度。白靈菇出菇一致性的高低由現(xiàn)蕾期和采收期決定，兩時期所用時間越短，出菇一致性越高。

表2 供試阿魏蘑菌株出菇各時期所需時間 （單位：d）

由表2可知，供試菌株中催蕾期最短的為白靈A1、白靈901、白靈00489，用時16天；最長的為白靈A16和A14，用時54天；A18與A12催蕾期也較長，分別為50 天和52天。供試菌株的現(xiàn)蕾期最短的是白靈A1，僅需2天；A30、A32、上海高白靈的現(xiàn)蕾期為3天。白靈A1采收期最短，為5天；其次為白靈901和A19，為6天；最長的是香阿魏、A14和A8，需26天。供試菌株中育菇時間最短的菌株是A18，需要8天，其次是A16（9天）、華中白靈（11天）、A19（11天）。

綜上所述，出菇一致性較高，出菇管理比較簡單的菌株有白靈A1、A30、A32、白靈A19、白靈00489、白靈901。

（2）農(nóng)藝性狀。阿魏蘑作為一種珍稀高檔食用菌，在市場上不如平菇、雙孢蘑菇一類常見。消費者對白靈菇子實體外觀特征及口感的要求較為嚴格，通常喜歡菇柄較短、菇朵厚實、形狀規(guī)整潔白的菇體。表3記錄了此次試驗中各供試菌株的子實體農(nóng)藝性狀。在平均單朵重量方面，以各菌包生長的第一潮子實體測量記錄，菌株白靈菇以 363 g位居首位；其次是白靈A19和白靈608，分別為311 g和299 g；平均單朵重量最低的菌株是A32、白靈00619和A30，分別為150 g、148 g和140 g。在子實體形狀、色澤方面，野生菌株香阿魏子實體為漏斗狀，顏色暗黃且菇柄較長，1505-2野阿魏子實體顏色偏暗，菇柄長，兩者均不適合作為親本。其余供試菌株大部分為掌形、白色。菌株白靈 A1、白靈901菇體潔白；A30、A32、白靈00619、上海高白靈菌株子實體為柱狀，其中A30、A32子實體表皮開裂。其他菌株具叢生現(xiàn)象，出菇管理較為復(fù)雜。在子實體硬度及厚度方面，菌株華中白靈與A14的硬度大，口感稍差；菌株白靈菇、華中白靈子實體很厚。在菇柄長度與子實體向光性方面，菌株白靈菇菇柄短，向光性較強，整體比較成型；菌株50869、A12子實體向光性極強，對光源的位置敏感。

表3 供試阿魏蘑菌株的農(nóng)藝性狀

此次研究需要選擇遺傳差異大，出菇一致性高且具有突出農(nóng)藝性狀的菌株作為雜交親本。通過2.1與2.2節(jié)對供試菌株遺傳分析、出菇一致性及各項農(nóng)藝性狀的比較分析可知，菌株白靈菇、白靈A19與白靈A1相互之間遺傳差異大，菌株白靈菇雖然出菇一致性不明顯，但是其產(chǎn)量為供試菌株中最高；白靈A1子實體潔白、掌形，出菇一致性高，管理方便；白靈A19橢圓形，子實體形狀統(tǒng)一，出菇一致性高；白靈A1與白靈A19菌株的產(chǎn)量也較高。經(jīng)過綜合比較后，本次試驗選擇菌株白靈菇、白靈A19和A1作為雜交親本，圖3 b、c、d為雜交親本子實體生長狀況。對3個親本進行拮抗試驗，結(jié)果如圖3 a所示，菌株白靈菇與白靈A19、白靈A1均有拮抗線產(chǎn)生，而白靈A19與白靈A1之間無拮抗線產(chǎn)生，又根據(jù)親本各自相對突出的性狀，最終以白靈菇（A）×白靈A19（B）、白靈菇（A）×白靈A1（C）這兩種作為此次試驗的雜交組合。

2.3 單孢雜交

（1）單核體收集。確定雜交親本后，收集孢子印，稀釋涂板，25 ℃恒溫培養(yǎng)，挑取萌發(fā)的單菌落于平面培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時間后觀察菌絲形態(tài)，具有星射線的菌落一般為單核體菌株。顯微鏡下 40倍鏡檢是否具有鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)。試驗挑取的白靈菇、白靈A19、白靈A1的單菌落數(shù)和單核體數(shù)分別為46、39、42和28、24、30。

（2）配對雜交。在白靈菇（A）×白靈 A19（B）雜交組合中，分別選取白靈菇、白靈A19單核體菌落各10個，計100種配對組合進行雜交；在白靈菇（A）×白靈A1（C）雜交組合中，選取白靈菇單核菌株11個，白靈A1單核菌株（圖4）16個進行配對雜交，計176種組合。經(jīng)鏡檢，A×B雜交得到 59個具有鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)標記的組合；A×C雜交得到127個具有鎖狀聯(lián)合標記的組合。

圖4 部分雜交組合菌絲顯微圖

圖3 雜交親本拮抗試驗及子實體生長狀況

圖5 拮抗試驗

2.4 雜交菌株的篩選

利用三點法將具有鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)的雜交組合與親本進行拮抗試驗，部分拮抗結(jié)果如圖5所示。其中A×B雜交中，與親本A產(chǎn)生拮抗線而不與親本B產(chǎn)生拮抗線的有3個雜交組合，與親本A不產(chǎn)生拮抗線而與親本 B產(chǎn)生拮抗線的有 9個雜交組合，剩余 47個雜交組合與兩親本均能產(chǎn)生明顯的拮抗線；A×C雜交中，與親本A產(chǎn)生拮抗線而不與親本C產(chǎn)生拮抗線的有1個雜交組合，與親本A不產(chǎn)生拮抗線而與親本C產(chǎn)生拮抗線的有2個雜交組合，剩余127個雜交組合與兩親本均能產(chǎn)生明顯的拮抗線。雜交組合A×C的雜交親和率高于A×B組合。

3 小結(jié)與討論

育種工作的關(guān)鍵在于親本的選擇，而實驗方法也至關(guān)重要。分子標記技術(shù)具有簡單快速、準確低耗等特點，本研究首先利用RAPD與ISSR分子標記技術(shù)對 26個供試菌株進行分子水平上的分析鑒定；結(jié)合冷房出菇品比試驗獲得了各供試菌株的農(nóng)藝性狀。根據(jù)試驗的設(shè)計思路及實驗結(jié)果，選擇具有突出農(nóng)藝性狀和性狀之間互補及遺傳差異較大的菌株白靈A19、白靈A1及菌株白靈菇作為此次育種研究的親本。通過對遺傳樹圖的分析與親本間的拮抗試驗，確定了白靈A19×白靈菇、白靈A1×白靈菇兩個雜交組合，且后者的雜交親和率高于前者。根據(jù)試驗流程，共獲得174個有效雜交組合。對這174個雜交組合還需進行重復(fù)品比試驗，并應(yīng)用經(jīng)本次試驗篩選后的分子標記引物，對表現(xiàn)良好的雜交菌株進行 ISSR分子標記鑒定，測定其是否屬于阿魏蘑新品種。