巴西產(chǎn)死胎的母豬血液中的豬圓環(huán)病毒3型全基因組測序分析

摘譯自 Tochetto 等， Transboundary & Emerging Diseases． 2017， (2)．

吳好葉， 梁海英，曾智勇*

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

主持國家自然科學(xué)基金項目1項，省廳級項目3項；參研貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目5項，其他各類省廳(局)級項目13項；獲“貴州省科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎三等獎”3項。先后發(fā)表各類學(xué)術(shù)論文180余篇，其中SCI論文3篇，一級學(xué)報論文12篇，核心期刊90余篇；參編養(yǎng)殖技術(shù)叢書3冊，參編專業(yè)類著作2冊，參編《畜牧獸醫(yī)行政管理學(xué)》（國家規(guī)劃教材）。

曾智勇，男，1978年9月生，四川威遠(yuǎn)人，博士，貴州大學(xué)教授、碩士研究生導(dǎo)師、貴州大學(xué)學(xué)術(shù)骨干，貴州省科技特派員，黑龍江畜牧獸醫(yī)雜志編委。主要從事動物傳染病及病原分子生物學(xué)相關(guān)研究，以規(guī)?；i場主要病毒性疫病為基礎(chǔ)，開展新型疫苗和病原快速檢測方法及試劑盒的研發(fā)。同時，長期面向豬場開展豬病毒性疫病的抗體監(jiān)測和病原的快速檢測以及規(guī)?；i場疾病防

豬圓環(huán)病毒（Porcine circoviruses， PCV）系圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬無囊膜的單股負(fù)鏈DNA病毒，根據(jù)抗原性和基因型的不同，最初分為豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）和2型（PCV2），基因組大小約 2 000 bp。2016 年，Phan 等 從 美 國患有心肌炎和多系統(tǒng)炎癥的病豬中發(fā)現(xiàn)了一種新型豬圓環(huán)病毒（PCV3）。就在幾乎同一時間，Palinski等（2017）從患有豬皮炎腎炎綜合征、繁殖障礙、以及流產(chǎn)胎兒樣品中也檢測到了PCV3。有趣的是，盡管上述病癥與PCV2的感染相似，但在這些研究中都沒有檢測到PCV2基因組。在中國，Shen等（2017）在確定PCV2、繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和偽狂犬病毒（PRV）均為陰性的表現(xiàn)發(fā)熱、厭食并患有呼吸系統(tǒng)疾病的仔豬中檢測到了PCV3。此外，Ku等（2017）也懷疑PCV3與豬繁殖障礙有關(guān)。上述研究報道表明，PCV3在上述病癥中可能起著非常重要的作用，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中應(yīng)引起足夠的重視。在波蘭14個養(yǎng)豬場中，有12個豬場的母豬及3～20周齡豬的血清中均檢測到了PCV3。研究從巴西某豬場曾產(chǎn)出數(shù)量不等死胎的母豬血液中（1～4頭/窩），成功測序了2株P(guān)CV3全基因組序列。

實驗選擇巴西南部的A、B兩個豬場作為調(diào)查對象，分別采A場3頭、B場6頭剛產(chǎn)死胎的母豬血液，分別合為1份，共2份；同時分別采集A場5頭、B場10頭未產(chǎn)死胎的母豬血液，分別合為1份，共2份。對4份混合血樣分別用0．22μm濾器過濾后，150 000×g 4 ℃ 離 心 4 h， 沉 淀用核酸酶處理后，使用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚法分別提取核酸。以該核酸為模板，使用Φ29 DNA聚合酶，通過多重置換擴(kuò)增技術(shù)（MDA）進(jìn)行病毒DNA的擴(kuò)增。用Nextera試劑盒構(gòu)建DNA文庫后，用Miseq v2300試劑盒通過Illumina MiseqTM 平臺測序。利用生物信息軟件對獲得的序列與GenBank 登錄的其他23株P(guān)CV3的基因序列進(jìn)行多重比對，使用SDT v．1．2軟件分析序列的同源性，使用 MEGA 7．0．18 軟件中的 Hasegawa-Kishino-Yano模型和γ分布的最大似然法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的建立。Bootstrap值通過1 000次重復(fù)進(jìn)行計算。使用SplitsTree4軟件的PHI測試對25個序列進(jìn)行重組分析。

通過metaS-PAdes基因匯編程序，總共生成357 306個（豬場A）和459 648個（豬場B）配對末端讀長（PE reads），借助Base Space云數(shù)據(jù)庫通過基因組裝器對檢索到的重疊群進(jìn)行分析，獲得兩株大小均為2 000 bp的PCV3基因組序列（A豬 場，PCV3-BR/RS/6，MF079253；B豬 場，PCV3-BR/RS/8，MF079254）。病毒基因組均包含編碼復(fù)制相關(guān)蛋白（Rep）和衣殼蛋白（Cap）2個開放閱讀框（ORF）；5'基因間區(qū)域含有235個核苷酸，包括一個潛在的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（莖環(huán)基序TAGTATTAC），與先前報道的PCV1和PCV2基因組一致。Rep ORF在5'末端包含一個替代的起始密碼子GTC（纈氨酸），在鳥類圓環(huán)病毒和最近發(fā)現(xiàn)的一種名為Pork NW2/USA/2009的豬病毒基因組中，也發(fā)現(xiàn)了這種替代的起始密碼子。Rep N端的三個滾環(huán)復(fù)制基序 I [FTINN]、II [PHLQG]和 III [YCKK]與其他圓環(huán)病毒相同。23個參考PCV3序列均檢測到了三個額外的功能未知的基序，它們分別是WWDGY（aa 196-200）、DDFYGWVP（aa 209-216）和 DRYP（aa 225-228）。

PCV3-BR/RS/6 (MF079253) 和 PCV3-BR/RS/8 (MF079254)2與其他比較毒株的全基因組核苷酸序列相似性，分別為97．8%和99．8%之間。前者與中國KY075988和KY075986兩株的同源性最高，后者與韓國、美國和中國等報道的PCV3基因組同源性最高。Cap和Rep基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析出現(xiàn)類似的結(jié)果。目前，無法從病毒起源方面比較PCV3基因組差異，一是可用于比對的完整PCV3基因組數(shù)量相對較少；二是在系統(tǒng)進(jìn)化樹分析中，可能人為地對單獨序列進(jìn)行歸類。因此，只有可用于比對的PCV3參考序列增多，才能得出比較準(zhǔn)確的推斷。此外PHI測試結(jié)果表明，25個全基因組之間沒有發(fā)生重組（P = 0．317 4）。

目前，僅在美國、中國、波蘭和韓國有PCV3的報道。通過調(diào)查，此前南美尚無有關(guān)于PCV3的報道。研究從產(chǎn)死胎母豬血液中檢測到PCV3，而未產(chǎn)死胎母豬檢測結(jié)果為陰性，這表明PCV3已在南美流行，同時提示繁殖障礙可能與PCV3感染有關(guān)。Palinski等也曾通過定量PCR發(fā)現(xiàn)在流產(chǎn)胎兒中PCV3病毒含量較高。目前從豬繁殖障礙母豬、患有豬皮炎腎炎綜合征以及呼吸系統(tǒng)疾病的豬中均檢測到PCV3，表明該病毒可能與多種疾病的發(fā)生有關(guān)。研究將有助南美及其他國家研究PCV3感染的分布情況，以及分析PCV3與產(chǎn)死胎之間的關(guān)系，盡早確定PCV3的產(chǎn)生機(jī)理，分析其與多種疾病的關(guān)系，有利于豬業(yè)生產(chǎn)以及疾病防控。